頭孢他啶/阿維巴坦聯合不同抗菌藥物對產金屬酶腸桿菌目細菌體外活性分析

摘要：目的 研究頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南、亞胺培南和美羅培南對產金屬酶腸桿菌目細菌的體外抑菌活性，為臨床產金屬酶腸桿菌目細菌的治療提供依據。方法 收集昆明醫科大學第一附屬醫院2022年8月—2023年8月碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌，PCR方法檢測blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaNDM和blaIMP等5種耐藥基因，應用微量肉湯稀釋法檢測頭孢他啶/阿維巴坦、氨曲南、亞胺培南和美羅培南的最低抑菌濃度，棋盤法檢測頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南、亞胺培南和美羅培南的協同抑菌活性，計算聯合藥敏的部分抑菌濃度指數和敏感折點指數，判斷兩種組合之間的協同、相加、無關或拮抗作用，評估不同組合之間的協同效果。結果 本研究共收集耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌234株，其中產金屬酶的菌株占12.8%（30/234），對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率為100%（30/30）。分別從不同樣本類型中選擇6株產金屬酶的代表性菌株進行聯合藥敏實驗，結果頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南對6株菌株部分抑菌濃度指數均lt;0.5，表現出協同作用，協同率為100%（6/6），聯合美羅培南和亞胺培南時，每個組合僅對1株菌株表現出協同作用，協同率為16.7%（1/6），但在美羅培南的組合中，有3株菌株表現出相加作用，相加率為50%（3/6），對2株雙酶型菌株均無協同或相加作用，敏感折點指數頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南明顯優于亞胺培南和美羅培南，協同效果顯著。結論 體外聯合藥敏結果顯示，對產金屬酶腸桿菌目細菌，頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南具有顯著的協同效果，聯合美羅培南和亞胺培南協同效果不明顯，因此頭孢他啶/阿維巴坦聯合氨曲南可作為治療產金屬酶腸桿菌感染的方案之一。

關鍵詞：聯合藥敏實驗； 碳青霉烯類； 多重耐藥；協同抑菌活性；金屬酶

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

In vitro activity analysis of ceftazidime/avibactam combined with different antimicrobial drugs on metallozyme-producing Enterobacterales

Dong Xiaoxue1，2， Zhang Hongjuan1，2， Su Yandan1，2， Li Xinyue1，2， Xu Yunmin1，2， Zhu Xiaoyan1，2，

Guo Lanhua3， and Shan Bin1，2

（1 Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032; 2 Yunnan Province Clinical Research Center for Laboratory Medicine， Kunming， 650032; 3 Shizong County People’s Hospital， Shizong 655700）

Abstract Objective To study the in vitro antibacterial activity of ceftazidime/avibactam combined with aztreonam， imipenem， and meropenem against metalloenzyme-producing Enterobacterales， and provide a basis for the clinical treatment of metalloenzyme-producing Enterobacterales. Methods Carbapenem-resistant Enterobacterales were collected from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from August 2022 to August 2023， and five drug resistance genes （blaKPC， blaOXA-48， blaVIM， blaNDM， and blaIMP） were detected by the PCR method. The minimum inhibitory concentrations of ceftazidime/avibactam， aztreonam， imipenem， and meropenem were detected by the microbroth dilution method. The checkerboard method was used to detect the synergistic antibacterial activity of ceftazidime/avibactam combined with aztreonam， imipenem and meropenem. The partial inhibitory concentration index and sensitive breakpoint index of the combined drug susceptibility were calculated to judge the synergistic， additive， irrelevant or antagonistic effect between the two combinations， and to evaluate the synergistic effect between the different combinations. Results A total of 234 carbapenem-resistant strains of Enterobacterales were collected， of which 12.8% （30/234） were metalloenzyme-producing strains and 100% （30/30） were resistant to ceftazidime/avibactam. Six representative strains producing metalloenzymes were selected from different sample types for combined antimicrobial susceptibility experiments. A synergistic effect between ceftazidime/avibactam and aztreonam was observed in 6/6 （100%） of the strains， with partial inhibitory concentration indices smaller than 0.5. When combined with meropenem and imipenem， each combination showed a synergistic effect on only 1 strain， and the synergistic rate was 16.7% （1/6）. However， in the combination of meropenem， 3 strains showed an additive effect， and the additive rate was 50% （3/6）， and the 2 strains of the double enzyme type strain had no synergistic or additive effect. The sensitive breakpoint index of ceftazidime/avibactam combined with aztreonam was significantly better than that of imipenem and meropenem， and the synergistic effect was significant. Conclusion The results of in vitro combined drug susceptibility showed that ceftazidime/avibactam combined with aztreonam had a strong synergistic effect on metalize-producing Enterobacterales， and the synergistic effect of meropenem and imipenem was not obvious. Therefore， ceftazidime/avibactam combined with aztreonam could be used as one of the regimens for the treatment of metalloenzyme-producing Enterobacterales infections.

Key words Combined antimicrobial susceptibility tes;" Carbapenems;" Multidrug resistance;" Synergistic antibacterial activity;" Metalloenzymes

耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）的抗感染治療是一個全球性的健康問題，因缺乏有效的抗菌藥物以及耐藥性的持續演變，常導致臨床治療失敗，增加患者的住院率和死亡率，其中產金屬酶的菌株可以水解大多數抗菌藥物，對目前最后一線的藥物β-內酰胺酶抑制劑如阿維巴坦、瑞來巴坦等不敏感，感染后死亡率高達30%以上[1-2]。為了緩解CRE臨床治療的難點，新的治療方法不斷被提出來，首先是新型抗菌手段的開發，如噬菌體療法和納米顆粒等，但因這些新型抗感染方法缺乏有效的臨床數據及前瞻性研究，臨床應用仍受限；其次是多藥聯合治療，已有研究證實合理的藥物聯合治療可以明顯降低死亡率，改善患者的預后[3–6]。2023年《碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗及報告專家共識》中指出當菌株對頭孢他啶/阿維巴坦（ceftazidime/avibactam，CZA）敏感時，不推薦常規聯合應用抗菌藥物，如果藥敏結果顯示耐藥，則建議以CZA為基礎，聯合碳青霉烯類、氨基糖苷類等進行聯合藥敏試驗，篩選可用的多藥聯合治療方案[7]。本研究中，依據共識提出的方案，采用棋盤法研究CZA聯合氨曲南（aztreonam，ATM）、美羅培南（meropenem，MEM）和亞胺培南（imipenem，IPM）對CZA耐藥的產金屬酶的腸桿菌目細菌的體外抗菌活性，以期得到合適的多藥聯合方案來治療CZA耐藥CRE引起的難治性感染。

1 資料和方法

1.1 菌株收集

收集昆明醫科大學第一附屬醫院2022年8月—2023年8月耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌，以MALDI-TOF MS鑒定細菌，通過標準紙片擴散法和VITEK-2 Compat全自動細菌鑒定藥敏系統篩選對IPM、MEM或厄他培南耐藥的菌株，本研究分別從不同樣本類型（痰、尿液和肺泡灌洗液）中選擇6株產金屬酶的代表性菌株進行聯合藥敏試驗，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，來自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。

1.2 碳青霉烯酶基因檢測

將-80 ℃凍存的菌株復蘇后，接種于血瓊脂平板，37 ℃、5%CO2培養18～20 h，使用DNA提取試劑盒提取細菌DNA作為PCR擴增模板，通過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀初步確定其碳青霉烯酶基因，引物設計參照文獻進行[8]，PCR擴增產物均送北京博邁德生物科技有限公司進行測序，測序結果經NCBI數據庫比對確定其基因型。

1.3 抗菌藥物敏感性試驗

采用標準紙片擴散法或VITEK-2 Compact微生物鑒定藥敏系統進行藥敏實驗，實驗菌株采用微量肉湯稀釋法測定CZA、IPM、MEM和ATM的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC），其中MEM、IPM、ATM的濃度范圍為0.125～256 mg/L，CZA濃度范圍為0.125/4～128/4 mg/L，試驗方法為挑取18～20 h的純培養物配成1.5×108 CFU/mL的菌懸液，菌懸液與MH肉湯按操作要求稀釋后以每孔100 μL加入藥敏板中，將藥敏板放入37 ℃的孵育箱中培養16～20 h后判讀結果，藥敏結果判斷參照2023年CLSI M100標準[9]。

1.4 棋盤法聯合藥敏

實驗菌株經微量肉湯稀釋法復核后，對CZA耐藥的菌株進行聯合藥敏試驗，聯合方案以CZA為基礎，聯合藥敏板中，CZA的濃度范圍為0.125/4～

128/4 mg/L，MEM和IPM的濃度范圍為0.125～16 mg/L、

1～128 mg/L，ATM的濃度范圍為0.25～32 mg/L，實驗方法類似于微量肉湯稀釋法，將按比例配制好的MH肉湯按每孔100 μL加入聯合藥敏板中，37 ℃孵育16～20 h判讀結果。

1.5 統計方法

結果判讀參照部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）和敏感折點指數（susceptible breakpoint index，SBPI），FICI≤0.5時為協同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關作用，FICI＞2表示拮抗作用，SBPI等于2.0表示抗菌藥物A和B組合的MIC值等于它們各自的敏感折點，或者其中1種抗菌藥物的組合MIC小于其敏感折點，計算公式如下[7，10]。

FICI=（聯合時A藥的MIC值）/（單藥時A藥的MIC值）＋（聯合時B藥的MIC值）/（單藥時B藥的MIC值）

SBPI=（A藥的敏感折點/A藥組合時的MIC）＋（B藥的敏感折點/B藥組合時的MIC）

2 結果

2.1 產金屬酶CRE藥敏及碳青霉烯酶基因結果

2022年8月—2023年8月共收集CRE菌株234株，藥敏分析顯示菌株對臨床常用抗菌藥普遍耐藥，對CZA的耐藥率達100%（30/30），見表1。234株中產金屬酶菌株為30株，占比12.82%，其中對CZA耐藥的CRE菌株均產金屬酶，主要為產NDM型菌株，占90%（27/30），其次為IPM型占10%（3/30），其中2株除了產NDM外，還分別產KPC和OXA-48型碳青霉烯酶，見圖1～2。

2.2 產金屬酶CRE聯合藥敏試驗結果

本研究分別從不同樣本類型（痰、尿液和肺泡灌洗液）中選擇6株產金屬酶的代表性菌株進行聯合藥敏試驗，其中K2和K4菌株除表達blaNDM基因外，還分別表達blaKPC和blaOXA-48基因，菌株信息如表2。

本研究分析了6株產金屬酶的菌株對CZA聯合ATM、MEM和IPM的協同作用，CZA聯合ATM對6株菌株均有協同作用，協同率100%（6/6）；聯合MEM協同率為16.7%（1/6），其中3株表現出相加作用，未表現出協同或相加作用的均為產雙碳青霉烯酶的菌株；在聯合IPM的組合中，有1株菌表現出協同作用，協同率為16.7%（1/6），其余5株菌均為無關作用，表3。同時我們計算了協同陽性組合間的SBPI指數，CZA聯合ATM的SBPI指數顯著高于聯合MEM和IPM（表4）。

3 討論

由于缺乏可行的抗菌藥物以及替代療法，多重耐藥革蘭陰性菌的抗感染問題一直是公共衛生領域的難題，相較于對碳青霉烯類敏感的腸桿目細菌引起的感染，CRE引起的嚴重感染死亡率增加2～3倍，尤其是CRE血流感染的患者，其病死率高達50%，且單藥治療死亡率明顯高于多藥聯合治療[11-12]。2019年美國疾病預防與控制中心將CRE列為緊急公共衛生威脅，迫切需要尋求新的抗菌藥物來控制耐藥菌的感染與傳播[13]，CZA的出現在很大程度上解決了臨床抗感染的問題，尤其是針對產KPC和OXA-48的菌株，但是CZA對產金屬酶的菌株缺乏抑菌活性的問題極大地限制了它的臨床應用[14]。ATM作為一種傳統抗生素，可以對抗金屬酶的水解作用，但產金屬酶的菌株通常還存在其他的耐藥機制，使得僅約30%的分離株對ATM保持敏感，導致產金屬酶的腸桿菌感染后臨床治療藥物的選擇極為有限[15]，抗菌藥物的聯合治療可能是解決多重耐藥菌感染的可期方案之一。

藥敏分析提示CRE對臨床常用的抗生素耐藥率高，對碳青霉烯類、頭孢菌素類、β-內酰胺類/β-內酰胺酶抑制劑耐藥率均大于90%，對CZA的耐藥率達100%（30/30），所有CZA耐藥的菌株均產金屬酶，聯合藥敏結果表明CZA聯合ATM可以顯著地降低了CZA和ATM的MIC值，聯合后其MIC值均降至敏感折點（MIC＜4 mg/L）以下，而對產雙碳青霉烯酶的菌株中，產NDM+KPC的菌株較NDM+OXA-48的MIC值降幅較小，考慮可能是因為KPC水解抗生素的作用較OXA-48強，協同后其MIC值降幅較小，但其MIC值均＜4 mg/L[16]。目前已經有較多的研究表明CZA聯合ATM具有協同效果，Mauri等[17]的一項Mate分析中，CZA聯合ATM對80%的產NDM的腸桿菌表現出體外協同抑菌活性，在降低臨床死亡率和住院時間上也表現出巨大的優勢。Falcone等[18]的一項前瞻性研究中，對比了102例患者CZA聯合ATM和其他活性抗生素對血流感染患者30 d的死亡率和不良事件發生率，CZA聯合ATM的治療組中30 d的死亡率12.1%，明顯低于其他抗生素（黏菌素、替加環素、氨基糖苷類和碳青霉烯類）治療組的44.0%，在急性腎損傷的發生上，也遠遠低于對照組，此外聯合治療還能降低CRE的復發和CZA耐藥率的發生。總之，CZA聯合ATM治療產金屬酶腸桿菌感染的臨床療效中具有明顯的優勢。

CZA與ATM的聯合已被證明對產金屬酶的菌株有效，但基于CZA聯合MEM、IPM的研究還較少，專家共識推薦對CZA耐藥菌株，可以考慮聯合碳青霉烯類抗生素治療，既往的研究中，Kuai等[19]通過棋盤法分析了CZA聯合MEM的對不同酶型CRE的協同效果，其中93.8%（15/16）的菌株表現出協同作用，未表現出協同作用的為產NDM型菌株，且聯合后除NDM型外均可以將MEM的MIC值降到8 mg/L以下，Gaibani等[20]通過棋盤法分析了CZA聯合MEM和IPM對13株產KPC酶KPN的體外協同效果，CZA聯合對所有KPC分離株均有協同作用，包括其中2株對CZA耐藥的產KPC分離株，Wang等[21]也通過CZA聯合MEM/IPM成功治愈了1例腎移植術后產KPC型肺炎克雷伯菌引起多發感染的患者。而本研究中對產金屬酶的菌株CZA聯合MEM或IPM協同效果僅為16.7%（1/6），其中2株雙酶型的菌株均表現為無關作用，由此可見，CZA聯合傳統的抗生素如碳青霉烯類對產KPC酶的菌株體內及體外均有協同性，但對產金屬酶的菌株，其協同效果并不明顯，尤其是金屬酶同時聯合其他酶型的菌株，這與共識的推薦存在一定的差異[7]?？傊谘芯康?株菌株中，CZA聯合ATM的整體協同效果顯著，盡管是針對產雙酶型的菌株，仍表現出較強的協同作用，考慮可能是ATM抑制金屬酶的作用，而CZA對OXA-48和KPC具有較強的水解作用，從而使得CZA與ATM的組合表現出顯著的抑菌效果，這與專家共識推薦的方案一致，而CZA聯合MEM或IPM對產金屬酶的菌株協同效果并不顯著。產金屬酶的菌株通常具有廣泛的氨基糖苷類耐藥基因，對頭孢吡肟的耐藥性較高，對其他的新型β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑組合如頭孢洛扎/他唑巴坦、亞胺培南/瑞來巴坦和美羅培南/韋博巴坦等敏感性較差，目前治療首選仍然考慮CZA聯合ATM，黏菌素、替加環素和氨基糖苷類藥物可作為治療的二線藥物，并盡可能與其他活性抗菌藥物聯合使用[22-23]。

綜上所述，產金屬酶的CRE菌株引起的感染仍然是治療的難點，CZA聯合ATM對產金屬酶的菌株體外協同效果顯著，但考慮到本研究納入研究的菌株有限，且聯合藥敏方案較少，結果可能存在一定的偏倚，未來需要增加樣本量和藥物組合來進一步驗證本研究的結果，同時也需要更多的臨床前瞻性研究來評估體外具有協同活性的藥物在體內的整體療效，以得到合適的聯合方案應用于臨床抗感染治療。

參 考 文 獻

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