應用噬菌體噴霧消毒劑防控細菌性奶牛乳腺炎

摘要：目的 為探究噬菌體消毒制劑防控奶牛乳腺炎的潛力，本研究在奶牛場環境樣本中分離鑒定了2株肺炎克雷伯菌噬菌體SWPA1和SWPA2，與2株大腸埃希菌噬菌體共同制備噬菌體JPW雞尾酒噴霧消毒劑，通過JPW與過氧乙酸（PAA）聯用進行奶牛場噴霧效果評估。方法 本研究在上海某牛場乳腺炎患病奶牛乳汁及乳尖表面開展致病菌分離及耐藥分析；以乳汁中分離的肺炎克雷伯菌做指示菌，進行牛場污水中噬菌體分離；通過透射電鏡觀察噬菌體形態；并進行裂菌譜、最佳感染復數（MOI）、一步生長曲線、對pH、紫外線和溫度耐受性的測定，分析噬菌體的生物學特性；制備噬菌體雞尾酒消毒制劑JPW，與PAA進行聯合噴霧消毒，檢測噬菌體噴霧消毒劑對牛場環境中細菌的消殺效果。結果 本研究在乳腺炎奶牛乳汁及乳尖表面分離到大腸埃希菌5株，肺炎克雷伯菌10株；耐藥分析結果顯示分離的肺炎克雷伯菌呈現多重耐藥性；隨后在污水中分離到2個肺炎克雷伯菌噬菌體，命名為SWPA1和SWPA2；電鏡下觀察SWPA1為肌尾噬菌體、SWPA2為短尾噬菌體；2株噬菌體對分離的肺炎克雷伯菌的裂解譜覆蓋率達到70%；體外抗菌試驗發現，噬菌體SWPA1和SWPA2的最佳感染復數均為0.1，最適pH均為7，在25～45 ℃范圍內保持接近100%存活率；制備了肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌噬菌體雞尾酒消毒制劑JPW；消毒結果顯示，與PAA單獨消毒效果相比，JPW與PAA聯用能夠顯著降低奶牛體表及牛場環境中的細菌數。結論 噬菌體噴霧消毒劑JPW與PAA組合消毒模式能夠有效降低養殖場環境及乳房表面的細菌數，提高消毒效果，提示噬菌體雞尾酒噴霧消毒制劑具有防控養殖場奶牛乳腺炎的潛力。

關鍵詞：奶牛乳腺炎；噬菌體；消毒劑；肺炎克雷伯菌

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Phage spray disinfectant to prevent and control cow mastitis

Zhao Xiaoming1， Xia Lu2， Wang Xiaoxu3， Cao Chuangui1， Xu Feng3， Xiao Yaoming1， and Wang Zhaofei2

（1 Animal Disease Prevention and Control Center of Jiading Area， Shanghai 201899; 2 Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240; 3 Shanghai Center for Animal Disease Control and Prevention， Shanghai 202154）

Abstract Objective In order to explore the potential of phage disinfectants for the prevention and control of dairy cow mastitis， two strains of Klebsiella pneumoniae phages SWPA1 and SWPA2 were isolated and identified in dairy farm environmental samples， and a spray disinfectant was prepared by previously reported Escherichia coli phages and Klebsiella pneumoniae phages SWPA1 and SWPA2 （named JPW）. The effect of disinfection in dairy farms was evaluated by JPW in combination with peracetic acid （PAA）. Methods" " Pathogenic bacteria were isolated and analyzed on the milk and nipple tip surfaces of cows suffering from mastitis on a cattle farm in Shanghai. K. pneumoniae， isolated from milk， was used as an indicator bacterium to isolate phages from cattle farm sewage. Phage morphology could be visualized using transmission electron microscopy. The rhizobacterial profile， optimal multiplicity of infection （MOI）， phage one-step growth curve， and determination of pH， ultraviolet， and temperature tolerance are utilized to assess the biological characteristics of phages. Bacteriophage cocktail spray disinfectant preparation JPW was prepared and combined with PAA for spray disinfection to detect the sanitizing effect in the cattle farm environment. Results" " "In this study， 5 strains of Escherichia coli and 10 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from the milk and nipple tip surfaces of mastitis cows. The results of the drug resistance analysis showed that the isolated K. pneumoniae exhibited multidrug resistance. Subsequently， two K. pneumoniae phages were isolated in sewage and named SWPA1 and SWPA2; SWPA1 and SWPA2 belong to Myoviridae and Podoviridae recognized by electron microscopy， respectively. The lysis spectrum of two phages against Klebsiella pneumoniae isolates reached 70%. The in vitro antibacterial test found that the optimal multiplicity of infection of both of the two phages was 0.1， and the optimal pH was 7， maintaining a survival rate close to 100% in the range of 25～45 ℃. The results showed that the combination of JPW and PAA could significantly reduce the number of bacteria on the cow’s body surface and in the farm environment compared with PAA used alone. Conclusion" " The combined disinfection prepared by phage and PAA can effectively improve the disinfection effect in dairy cows， suggesting that phage cocktail spray disinfections have the potential to prevent and control dairy cow mastitis.

Key words Cow mastitis; phages; disinfectants; Klebsiella pneumoniae

奶牛乳腺炎是由多種致病因素誘發奶牛乳腺組織產生炎癥反應的一種疾病，是奶牛場最常見、危害最大并且造成經濟損失最嚴重的疾病之一，嚴重影響奶牛生產性能和乳品質量，給奶牛養殖業和乳制品制造業帶來不菲的經濟損失，限制行業的發展。除此之外，乳腺炎可能傳播與食物毒素有關的人畜共患傳染病，威脅和損害人類社會公共健康[1]。致病菌是引起奶牛乳腺炎的主要原因，其中致病菌被分成感染性致病菌和環境性致病菌。傳染性致病菌通常存在于患病動物的乳房和擠奶設備上，在動物之間直接傳播或通過接觸傳播擠奶工人，其中以金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌為主[2-3]。環境性致病菌一般來源于墊料、糞便、畜禽棚舍等農場環境，甚至可以定植在奶牛胃腸道、呼吸道，主要包括包大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產氣桿菌和除無乳鏈球菌以外的鏈球菌菌株[4]。當奶牛免疫系統受到損傷、免疫力下降或環境衛生沒有得到的保障，環境性病原微生物就會感染奶牛乳腺，導致乳腺炎的發生。其中大腸埃希菌（Escherichia coli）是環境型乳腺炎最主要的病原菌，也是中毒性和致死性乳腺炎的最常見原因，可引起從輕微到嚴重的臨床炎癥，包括菌血癥、高燒和產奶量減少等[5-6]；肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作為環境型乳腺炎重要的病原菌，其導致的奶牛乳房炎在國內的發病率逐年上升。此外，肺炎克雷伯菌呈現多重耐藥特點，導致臨床中抗生素治療效果不佳[7-8]。

目前國內外防控環境性病原微生物引起乳腺炎的常規方法是使用化學消毒劑和抗生素。常見的消毒劑包括酚類、揮發性烷化劑、鹵素類、表面活性劑、堿類等，不但對環境物品有腐蝕性和破壞性，對動物本身也有很大的刺激性和損傷性[9]；同時，不合理地使用消毒劑會導致細菌對消毒劑產生耐藥。今年來報道發現，細菌對消毒劑的耐藥可能會導致對抗生素產生共耐藥，給公共安全帶來巨大的威脅[10-12]。因此，亟須尋找一類高效不耐藥的新型抗菌策略。目前利用噬菌體防控病原菌的感染日益受到重視。

噬菌體（bacteriophage，phage）是一類能特異性侵襲細菌的病毒顆粒。1915年，由英國Twort首次發現，基于其特異性侵染細菌的屬性被用于感染的防治[13]。噬菌分布極為廣泛，是目前存在種類最豐富的生物體，并且其不感染真核生物、不污染環境、安全性高，能廣泛適用于殺滅動物體和環境（包括地面、土壤、水體、空氣以及物體表面等）特定的病原菌，對飼養環境中致病菌的防控具有重要意義[14]。為了提高抗菌譜和抗菌效力，噬菌體抗菌產品一般由多種不同類型噬菌體混合的雞尾酒制劑組成，并且在體外或體內與其他抗菌劑協同使用[15]。目前，噬菌體制劑憑借其特異性、有效性和安全性等優勢，在臨床上已有多例治療耐藥大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌引起感染的案例。Bao等[16]用肺炎克雷伯菌噬菌體雞尾酒制劑成功治療了一名泌尿系統感染患者。Taha等[17]將噬菌體ZCKP用于治療糖尿病并發癥——糖尿病足感染的多重耐藥肺炎克雷伯菌患者，療效顯著。同時，噬菌體療法還可作為針對家禽大腸埃希菌病的有效替代生物防治措施[18]。除此之外，本課題組此前已有研究表明針對耐藥大腸埃希菌引起的奶牛乳腺炎，噬菌體雞尾酒制劑（SYGD1，SYGMH1和SYGE1）顯著減少了細菌、體細胞和炎癥因子的數量，減輕了牛乳腺炎的癥狀，達到了與抗生素治療相同的效果[19]。除此之外，噬菌體也被用作消毒劑使用來殺死或減少環境中的細菌。Rathor等[20]采用分離得到7種噬菌體制成的混合消毒劑，對環境進行消毒處理，檢測環境中多重耐藥的鮑曼不動桿菌活性，結果顯示抑菌效果顯著。Accolti等[21]基于益生菌的清潔系統，驗證了噬菌體制劑可以顯著降低甚至消除醫院環境中獲得性感染的多種多重耐藥菌，包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌等。同時，噬菌體消毒制劑更多的研究集中在用于食品或者食品加工過程中消毒效果，包括對于食物表面常見的食源性致病菌金黃色葡萄球菌、各菌株的大腸埃希菌等的研究[22]。并且基于此類研究，美國食品和藥物管理局（FDA）批準使用特定的噬菌體作為抗菌劑來對抗單核細胞增生李斯特菌的食品污染[23]。

本研究從患乳腺炎奶牛的乳汁中分離和鑒定大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，并以乳汁中的肺炎克雷伯菌作為指示菌，從污水中分離得到兩株烈性噬菌體。同時，進一步檢測了兩株噬菌體的生物學特性，包括對溫度、pH和紫外線的敏感度及其一步生長曲線。進一步，我們制備了靶向大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的噬菌體雞尾酒制劑JPW。對牛舍進行JPW與PAA（過氧乙酸）聯合噴霧消毒，對牛舍地面、欄架、空氣以及奶牛乳房表面采樣進行細菌計數，評估噬菌體噴霧消毒劑的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料及儀器

試驗所用的試劑、材料及儀器見表1。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺炎樣品采集

采集上海嘉定區某牛場20份乳腺炎患病奶牛乳汁及乳尖表面棉拭子，保存至生理鹽水采樣管，（不同牛/批次采集）貼好標簽后冰袋保存，2 h內送到實驗室進行分析。

1.2.2 細菌的分離與純化培養

奶樣充分搖勻，懸液接種于綿羊血平板，37 ℃培養18～24 h。挑取單菌落，分別接種于5％的綿羊鮮血瓊脂培養基或LB液體培養基進行純化培養。

1.2.3 細菌的PCR鑒定

對分離菌株進行16S rRNA PCR鑒定。根據GenBank數據庫設計細菌16S rRNA基因的通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程公司合成。

PCR按照50 μL體系的Green Taq Mix經典PCR程序進行，將PCR產物送至公司測序，測序結果通過BLAST軟件進行對比分析。

1.2.4 藥敏性實驗

采用Kirby-Bauer紙片擴散法測定分離菌株對5種抗生素的耐藥性。5種抗生素包括氨芐西林AMP（2 μg/片）、慶大霉素GEN（30 μg/片）、環丙沙星CIP（5 μg/片）、頭孢吡肟FEP（30 μg/片）和美羅培南MEM（10 μg/片）。其中氨芐西林、頭孢吡肟屬于β-內酰胺類藥物，慶大霉素屬于氨基糖苷類藥物，環丙沙星屬于喹諾酮類藥物，美羅培南屬于碳青霉烯類抗生素。具體步驟如下：挑取單菌落搖菌培養，調整菌液濃度至1.5×108 CFU/mL，用BHI半固體培養基倒板培養，平板凝固后無菌操作貼上藥敏片，培養18～24 h后測量抑菌圈直徑。試驗結果根據2016版CLSI 判讀標準，將所有結果分為耐藥（R）、中度敏感（I）或敏感（S）。

1.2.5 噬菌體的分離

將從奶牛場及周邊環境中采集的污水樣本4000 r/min離心20 min，取上清液，濾器過濾，樣本保存于4 ℃。以奶牛乳汁或乳房體表中分離的肺炎克雷伯菌為指示菌，對奶牛場周邊糞便及污水環境的60份樣本進行噬菌體分離鑒定。富集污水中可能存在的噬菌體，具體步驟如下：將污水與處于對數生長期（A600≈0.6）的菌液過夜培養，離心收上清，0.22 μm濾器過濾。取100 μL濾液與100 μL菌液混合，37 ℃孵育15 min，鋪雙層板，12 h后挑取單個透明噬菌斑于菌液中（A600≈1.0）培養，離心取上清液并用過濾除菌后保存備用。上清液取不同稀釋度做雙層瓊脂平板，每個噬菌斑純化3次。

1.2.6 噬菌體效價的測定

噬菌體原液用SM緩沖液梯度稀釋，采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體的效價。選擇范圍在30～300個噬菌斑的平板計數。噬菌體的滴度（PFU/mL）=噬菌體個數平均數×稀釋倍數×10。

1.2.7 噬菌體的擴培

將上述分離到噬菌體的指示菌培養1 L至對數生長期（A600 ≈0.8），加入50 mL噬菌體原液（1×108 PFU/mL），37 ℃ 160 r/min振蕩培養8～12 h，4000 r/min離心20 min，將上清過濾除去細菌碎片，得到的噬菌體保存于4 ℃備用。

1.2.8 噬菌體的透射電鏡觀察

取噬菌體液滴加于銅網，晾干后用2 %的磷鎢酸（pH 6.7）進行負染，干燥后用Talos L120C G2型

120 kV透射電鏡觀察。

1.2.9 噬菌體的菌譜測定

噬菌體裂菌譜通過噬菌體斑點滴定法和濁度法測定。斑點滴定操作方法如下：將待測菌液與LB半固體培養基混合后加入平皿，混合液室溫靜止10 min凝固。隨后分別取5 μL不同稀釋度的噬菌體液滴于平板表面，待噬菌體液晾干后37 ℃培養箱中過夜培養。觀察平板并記錄呈現清晰透明噬菌斑的菌株編號。濁度法操作方法如下：將待檢測過夜培養的肺炎克雷伯菌濃度調整至A600為0.6（細菌濃度為3×108 CFU/mL），隨后分別在待測菌液中加入3×107 PFU/mL噬菌體，室溫靜置2 h后測定細菌濁度（A600值）。噬菌體裂解力=加入噬菌體2 h 后細菌A600/初始細菌A600× 100%。

1.2.10 噬菌體的熱穩定性測定

每10 ℃設置一個溫度梯度，測定噬菌體不同范圍內的熱穩定性。分別取1 mL噬菌體于不同的溫度下水浴1 h，之后立即放于冰上，利用雙層瓊脂平板測定噬菌體效價。噬菌體存活率=不同溫度處理噬菌體濃度/初始噬菌體濃度×100%。

1.2.11 噬菌體的pH穩定性測定

將100 μL噬菌體（1×108 PFU/mL）與900 μL不同pH值的無菌LB混勻，37 ℃水浴1 h，通過測定噬菌體的效價來評價pH對噬菌體的影響。噬菌體存活率=不同pH處理后噬菌體濃度 / 初始噬菌體濃度×100%。

1.2.12 噬菌體的紫外線敏感性檢測

取2 mL，濃度為1×108 PFU/mL噬菌體置于無菌培養皿，于30 W的紫外燈下（距離平板約35 cm）照射10～70 min，通過測定噬菌體的滴度來評價紫外線對噬菌體活性的影響。噬菌體存活率=各個時間點噬菌體濃度/初始噬菌體濃度×100%。

1.2.13 噬菌體外殺菌試驗

細菌培養至對數期（A600≈ 0.8），調整細菌A600= 0.6，細菌濃度為3×108 CFU/mL。按照0.001、0.01、0.1、1、10和100的感染比（MOI）將不同濃度的噬菌體分別與3×108 CFU/mL的細菌混合，其中對照組加入等體積的SM緩沖液。測定不同時間點細菌濁度（A600）。

1.2.14 噬菌體的一步生長曲線測定

將指示菌培養至對數期（A600≈0.8），將噬菌體與指示菌按MOI=0.1進行混合，37 ℃ ，160 r/min培養，每隔10 min（直到150 min）取樣100 μL，12000 r/min離心2 min，過濾；取上清液倍比稀釋后測定噬菌體效價。

1.2.15 噬菌體雞尾酒JPW制備

上述獲取的2個肺炎克雷菌噬菌體與實驗室保存的兩個大腸埃希菌噬菌體vB_EcoM_SYGD1和vB_EcoP_SYGE1（每個噬菌體1 L，濃度為1×108 PFU/mL）均勻混至15 L的無菌容器中，該混合噬菌體溶液即為本研究所需的噬菌體微生態消毒劑。消毒劑規格為10 L，其中總噬菌體含量為1×1012個噬菌體（1×1012 PFU），濃度為1×108 PFU/mL。

1.2.16 奶牛噴霧消毒及效力評估

選擇3日以上未進行任何清洗、消毒處理過的牛舍，選取2個獨立區域（每個區域隨機分配50頭奶牛）。一區使用過氧乙酸（PAA）噴霧消毒；二區使用噬菌體雞尾酒JPW和PAA混合噴霧消毒。消毒前每個操作區隨機選檢測點（包含地面、欄架、乳房表面和空氣菌落）進行細菌總數檢測，檢測方法為：分別在地面、欄架、乳房表面用蘸取PBS的棉拭子在邊長10 cm的隨機正方形范圍內涂抹取樣，后將采樣棉拭子置于裝有PBS溶液滅菌管中樣。空氣菌落采樣：隨機在各個區域監測點，放置5%綿羊鮮血瓊脂培養皿。采樣高度和奶牛呼吸高度一致，距離墻壁大于50 cm，避開風口，打開培養皿蓋，放置5 min后，蓋上培養皿。將所有培養皿置于培養箱倒置進行培養12～16 h，記錄平板上的細菌總數。

隨后進行環境消毒操作。PAA消毒（一區），PAA濃度0.2% （V/V），用量10L，覆蓋面積10～20 mL/m3；混合消毒（二區），噬菌體濃度1×108 PFU/mL，用量5 L，PAA濃度0.2% （V/V），用量5 L，使用方法為噬菌體噴灑后3 h再進行PAA噴灑，覆蓋面積10～20 mL/m3；噴霧裝置為金花牌電動噴霧器（體積約18 L），每次噴霧的距離和壓力保持一致，均勻噴灑在操作區域。消毒后6 h對每個操作區隨機選取地面、欄架、乳房表面的檢測點（每個檢測點3個平行取樣）進行細菌總數檢測。檢測方法同上。

分別于第1、4、7、10和第14天進行同樣消毒操作，隨后按照上述方法進行消毒前后取樣。根據消毒前后細菌總數的殺滅對數值（KL）進行消毒效果評價。KL = No-Nx。式中：KL為殺滅對數值，Nx為消毒后活菌濃度對數值，No為消毒前平均活菌濃度的對數值。根據GB/T 38504-2020噴霧消毒效果評價方法，檢測噬菌體噴霧消毒劑使用后，待測區域自然菌（細菌總數）的KL≥1.00，判定為消毒有效。

1.2.17 統計學分析

使用Graphpad prsim 8.0軟件進行數據分析。組間差異采用t檢驗方式，非正態分布的數據以中位數表示，采用Wilcoxon秩和檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 奶牛乳腺炎病原菌的分離鑒定

收集上海嘉定區某牛場20份乳腺炎患病奶牛（所選乳區的乳汁體細胞數均大于100萬個/mL，判定為乳房炎陽性）的乳汁及乳尖表面棉拭子，進行病原細菌的分離與鑒定。其中與奶牛場乳腺炎致病密切相關的細菌為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。分離到大腸埃希菌5株（乳尖表面5株，乳汁0株）、肺炎克雷伯菌10株（乳尖表面3株，乳汁7株）。

2.2 菌株耐藥分析

K-B紙片擴散法對所用菌株進行耐藥性分析，表2結果顯示，5株乳尖表面的大腸埃希菌中主要是對氨芐西林（60%）和慶大霉素（40%）表現出耐藥。其中ECK3株對氨芐西林表現較高的耐藥力，ECK1和ECK5同時對氨芐西林和慶大霉素同時表現出中等耐藥。10株肺炎克雷伯菌主要是對氨芐西林（80%）和慶大霉素（60%）表現出較強的耐藥性，同時對慶大霉素（30%）、環丙沙星（50%）、美羅培南（20%）和頭孢吡肟（10%）也呈現一定耐藥性。其中3株乳尖表面來源的肺炎克雷伯菌同時表現為對氨芐西林和慶大霉素的完全耐藥；其中7株乳汁來源的肺炎克雷伯菌表現為對氨芐西林（71%）、慶大霉素（86%）和環丙沙星（43%）的較高耐藥率。值得注意，KPM5菌株呈現多重耐藥特性，能夠抵抗氨芐西林、頭孢吡肟、環丙沙星和美羅培南，需引起養殖場高度關注。

2.3 噬菌體分離

根據分離鑒定的病原菌，選擇肺炎克雷伯菌作為指示菌，對奶牛場周邊糞便及污水環境的60份樣本進行噬菌體分離鑒定。共分離到2株肺炎克雷伯菌噬菌體。分別命名為SWPA1和SWPA2噬菌體抗菌結果顯示（表3和圖1），2株噬菌體對2.1中分離的肺炎克雷伯菌的裂解譜覆蓋率達到70%（能夠同時裂解10株分離株中的7株）。肺炎克雷伯菌噬菌體的電鏡下形態如圖2所示，SWPA1為肌尾噬菌體、SWPA2為短尾噬菌體。

2.4 噬菌體的鑒定及生物學分析

對2株噬菌體進行熱穩定性、pH穩定性、紫外線的敏感性和一步生長曲線的測定（圖3）。從圖3（A）中可以看出SWPA1和SWPA2在25～45 ℃下保持較高活力，存活率接近100%；隨著溫度的升高，噬菌體的活性逐漸降低；當溫度達到65 ℃時，噬菌體滴度顯著下降，75 ℃孵育后噬菌體的活性完全喪失。顯然，牛舍環境溫度范圍屬于SWPA1和SWPA2最適生存溫度內。pH敏感性試驗表明，pH 7～8是其最適生長條件，但pH低于3或高于12時均失活，說明兩種噬菌體均對強酸或強堿敏感（圖3B）。從圖3C可以看出，兩種噬菌體對紫外都很敏感，短時間暴露后活性急劇下降。圖3D結果表明SWPA1和SWPA2的對細菌的感染及增殖能力很強。其中SWPA1感染潛伏期為10 min，SWPA2感染潛伏期為20 min；潛伏期后，SWPA1和SWPA2分別在40和60 min達到子代噬菌體產生的峰值（超過5×108 PFU/mL）。綜上，2株噬菌體具備成為抗菌消毒劑的潛力。

2.5 噬菌體雞尾酒JPW制備

將2株肺克噬菌體（SWPA1和SWPA2）和2株大腸埃希菌噬菌體（SYGD1和SYGE1）按同等濃度混合，制備為噬菌體雞尾酒消毒劑JPW。裂菌譜實驗顯示，JPW能夠有效裂解全部的大腸埃希菌分離株和70%肺炎克雷伯菌分離株（表3和圖1）。體外殺菌實驗結果顯示，JPW與肺炎克雷伯菌KPM3的MOI大于0.1，JPW呈現顯著殺菌效果（圖4）。

2.6 噬菌體JPW噴霧消毒實驗

對牛舍地面、乳房表面和欄架分組消毒，進行細菌總數檢測，計算KL值判斷消毒效果。當KL≥1.00，表示消毒有效。圖5A結果表示在消毒處理的第1、4、7、10和14天，地面消毒效果顯示，PAA+JPW處理組的KL值均顯著高于PAA處理組，且不同時間點PAA+JPW組的KL值均高于1，表明PAA+JPW處理組對牛場地面消毒效果優于PAA單獨處理；圖5B顯示，對奶牛乳房表面進行消毒處理的不同時間點，PAA+JPW處理組的KL值同樣均顯著高于PAA處理組，PAA+JPW處理組的KL值均高于1，而PAA處理組只有在連續消毒的第4、7、10和14天才顯示KL值大于1。表明PAA+JPW處理組對牛乳房表面消毒效果優于PAA單獨處理；圖5C結果表示， PAA+JPW組和PAA組消毒后，牛舍空氣菌落沉降的KL值均無明顯差異，并且KL值在第1、4、7和10天均大于1；圖5D表明，PAA+JPW消毒后牛場欄架表面的KL值均略高于PAA組，但無顯著差異，兩組的KL值均高于1，表明PAA+JPW處理組對牛場欄架表面消毒效果略優于PAA單獨處理。

綜上所述，與PAA獨消毒相比，噬菌體JPW與PAA組合消毒模式能夠更有效降低養殖場地面（圖5A）、乳房表面（圖5B）和欄架（圖5D）的細菌數（每個時間點的KL值均大于1）。

3 討論

乳腺炎仍然是奶牛場的主要疾病，每年都在全世界范圍內造成嚴重的經濟損失[24]。抗生素作為對抗細菌最有效的藥物，市面上廣泛流通著30余種抗生素用于治療奶牛哺乳期和干奶期的乳腺感染，并且乳腺感染的治療占奶牛場80%以上的抗微生物藥物的使用，是奶牛場使用抗菌藥物的主要原因[25]。目前，由于抗生素的不合理使用和過度使用導致細菌耐藥性日益嚴重。大腸埃希菌作為引起奶牛乳腺炎最主要的病原體之一，耐藥性形勢嚴峻。從奶牛乳腺炎患牛乳汁中分離出的大腸埃希菌顯示對抗生素的多重耐藥性，包括但不限于對氨基青霉素（例如氯唑西林）、多肽（例如桿菌肽）、林可酰胺（例如林可霉素）和大環內酯類（例如紅霉素）[26-30]；同時作為臨床上重要的抗生素耐藥基因“儲存庫”，可以通過水平轉移將耐藥基因傳播到其他微生物群落中[31]。肺炎克雷伯菌作為僅次于鮑曼不動桿菌的多重超級耐藥菌，其中尤其是耐碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）檢出率的升高給臨床治療帶來了更嚴峻的挑戰[32-33]。本研究結果顯示，分離的肺炎克雷伯菌株對β-內酰胺類藥物（氨芐西林和頭孢吡肟）表現出較強的耐藥性，并且耐氨芐西林菌株檢出率高達80%。此外，部分菌株對碳青霉烯類抗生素（美羅培南）產生了一定耐藥性，需引起高度警惕。鑒于獸醫臨床中肺炎克雷伯菌呈現多重耐藥性，亟待探索出解決耐藥的新方法。

鑒于特異性、安全性、生產潛力和低成本的獨特優勢，噬菌體療法目前被認為是抗生素療法極具潛力的替代療法[34]。噬菌體可以分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體，其中烈性噬菌體感染宿主菌后借助細菌自身的復制體系復制子代噬菌體，當子代噬菌體積累到一定數量時，會引起細菌的裂解導致細菌死亡，因而具備開發新型抗菌制劑的潛力[35]。本研究制備的噬菌體雞尾酒消毒劑來源均為裂性噬菌體。其中SWPA1屬于有尾噬菌體目肌尾噬菌科，SWPA2屬于有尾噬菌體目短尾噬菌科。本研究分離噬菌體對臨床分離肺炎克雷伯菌的裂解譜覆蓋率達到70%，潛伏期短，體外殺菌效果好；兩株大腸埃希菌噬菌體對于分離的大腸埃希菌的裂解譜覆蓋率達到100%，裂菌效率高。此外，由于噬菌體在靶向細菌之前可能會因各種環境壓力而失活，因此噬菌體制劑的穩定性是成功治療的關鍵[36]。本研究分離得到的SWPA1和SWPA2熱穩定性高，在20～45 ℃保持接近100%活力，并且在較廣的pH范圍內存活。綜上，本研究獲得的噬菌體抗菌活性強，能在不同溫度和pH值下相對穩定，表明本研究采用的噬菌體具備環境消毒的潛力。

雖然噬菌體制劑具有高特異性和強殺菌活性的優點，但是細菌對噬菌體產生的抗性仍然是一個亟待解決的問題。可在12 h內的短時間內對噬菌體產生抗性[37]。為了克服這一缺點，使用多種噬菌體混合制成雞尾酒是一種有效的措施[38]。本研究中采用4種噬菌體混合制成的雞尾酒制劑與化學消毒劑PAA聯合使用對患病奶牛乳房進行消毒，與PAA單獨消毒相比，噬菌體與PAA聯合消毒細菌數明顯降低，消毒效果顯著。

4 結論

總體而言，抗生素耐藥性和耐藥基因的轉移作為嚴重的公共衛生問題引起廣泛重視。噬菌體療法是后抗生素時代的前景廣闊的替代療法。本研究描述了噬菌體的分離和特性，并評價了它們對耐藥大腸埃希菌和耐藥肺炎克雷伯菌的體外抗菌效果；制備噬菌體雞尾酒噴霧消毒劑可以顯著減少環境中細菌數量。以上研究表明噬菌體雞尾酒噴霧消毒制劑能夠降低奶牛養殖場細菌總數，具備防控奶牛乳腺炎的潛力，為噬菌體消毒制劑在養殖場的綜合應用提供理論依據和數據支持。

參 考 文 獻

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