阿莫西林原料藥中未知雜質的研究

摘要：目的 對阿莫西林原料藥中的一個含量略大于0.05%的未知單雜進行分離純化并鑒定結構。方法 采用制備HPLC對阿莫西林原料藥中的一個未知雜質進行富集、分離和純化，得到高純度雜質樣品并通過高分辨質譜（HRMS）、核磁共振（NMR）技術及HPLC進行雜質結構的確證。結果 阿莫西林原料藥中目標雜質的結構為（2S，3R，5R，6R）-3-甲基-3-乙基-6-[（R）-（-）-2-氨基-2-（4-羥基苯基）乙酰氨基]-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3.2.0]庚烷-2-甲酸，即阿莫西林C3位上的一個甲基被乙基替代后形成了五元環3-甲基-3-乙基二取代阿莫西林的衍生物。結論 該雜質系首次從阿莫西林原料藥中鑒定出來，其與阿莫西林結構密切相關，歸為無新的高毒性結構雜質即一般雜質，建議可在原料質量標準中對其適當放寬限度。

關鍵詞：阿莫西林；未知雜質；結構鑒定

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Research on unknown impurities in amoxicillin API

Xu Shubo， Cheng Rui， Luo Houhua， Liu Kuo， Deng Jingen，Geng Yuefei， and Xie Weihang

（Gooddoctor Pharmaceutical Group Co.， Ltd，Mianyang 622650）

Abstract Objective To isolate， purify and identify the structure of an unknown impurity with a content slightly greater than 0.05% in amoxicillin raw materials. Methods The unknown impurity in amoxicillin raw material were enriched， separated， and purified using preparative HPLC to obtain high-purity impurity samples. The impurity structure was confirmed by high-resolution mass spectrometry （HRMS）， nuclear magnetic resonance （NMR） technology and HPLC. Results The structure of an unknown impurity in amoxicillin raw material was （2S， 3R， 5R， 6R）-3-methyl-3-ethyl-6-[（R）-（-）-2-amino-2-（4-hydroxyphenyl） acetylamino]-7-oxo-4-thia-1-azabicyclic [3.2.0] heptane-2-carboxylic acid， where a methyl group on the C3 position of amoxicillin was replaced by ethyl to form a derivative of pentacyclic 3-methyl-3-ethyl disubstituted amoxicillin. Conclusion This impurity was identified for the first time in the amoxicillin raw material and was closely related to the structure of amoxicillin. It could be classified as a general impurity with no new high-toxicity structure. It was recommended to appropriately increase the limits of the target impurity in the quality control of raw materials.

Key words Amoxicillin; Unknown impurity; Structure identification

阿莫西林（amoxicillin）又名羥氨芐青霉素，是一種常用的青霉素類廣譜β-內酰胺類抗生素。阿莫西林殺菌作用強，穿透細胞壁的能力也強，是目前應用較為廣泛的口服青霉素之一。阿莫西林原料藥系采用發酵法制備的起始物料6-APA[1-5]

溶解后，與D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽溶液在酶的作用下進行縮合反應得到阿莫西林粗品[6，8]，再通過結晶、濾過、洗滌、干燥等工序，最終得到阿莫西林成品，該工藝屬于半合成工藝。發酵工藝包括了生物系統，更加難預測和控制，也更加復雜。源于發酵的產品其可變性也常常要比合成產品大。因此，發酵產品的雜質屬性要比一個合成產品更加復雜和難以預測。發酵來源的原料藥因其復雜的發酵源雜質組成一直是生產企業質量控制和藥政機構文件審評的難點。歐洲藥品管理局發布的指導原則《抗生素中相關雜質質量標準制定》[9]為這類原料藥的質量控制提供了法規依據，填補了現行法規的空白。指南指出，阿莫西林按最大日劑量2 g計算，其雜質的報告限度、鑒定限度和控制限度與化學全合成藥物相同均為0.05%。這為阿莫西林原料藥及其制劑中未知雜質的研究帶來了挑戰。本實驗室在多批次阿莫西林原料藥中發現超限未知雜質，經過檢測含量為0.059%（歸一化法），超出控制限度，根據《抗生素中相關雜質質量標準制定》指導原則需要對該雜質進行定性研究。

1 材料與儀器

阿莫西林原料藥（本公司提供，重粉，批號：HAOYS-14264）；甲酸（科隆化學，批號：2022102402）；乙腈（西隴科學，批號：2303061）；碳酸氫銨（西隴科學，批號：2203142）；二甲亞砜（科隆化學，批號：2022110901）；磷酸二氫鉀（西隴科學，批號：2010221）；氫氧化鈉（西隴科學，批號：珠2211081）；分析純水（Sartorius）；制備純水（唐氏康寧）。

色譜儀LH-40及LC20AD（Shimadzu公司）；高效液相飛行時間質譜聯用儀（Agilent公司）；Bruker AVANCE NEO 400MHz核磁檢測儀器（Bruker公司）；Agilent 1290 LC amp; Agilent Q-TOF G6545B質譜檢測儀器（Agilent公司）；冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；制備超純水系統（成都唐氏康寧科技發展有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平（天津鈺恒電子科技有限公司）；分析天平（Mettler公司）；分析純水儀（Sartorius公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

使用Shimadzu LC20AD儀器對阿莫西林原料藥和分離得到的目標雜質進行HPLC純度檢測。色譜柱：Agilent SB-C8色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：6.8 g/L磷酸二氫鉀溶液（使用20%氫氧化鈉水溶液調節pH至5.0）；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0～5 min，100% A；5～25 min， 100%～94%A；25～40 min，94%～84% A；40～50 min，84% A；50～51 min，84%～100% A，51～60 min，100% A）；流速：2 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：40 ℃。

2.2 制備色譜條件

使用Shimadzu LH-40 Prep-HPLC從阿莫西林原料藥中分離純化出目標雜質。

第一次純化，色譜柱：Phenomenex Luna C18"（150 mm×25 mm，10 μm）；流動相A：0.225%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0～2 min，0 B；2～10 min，0～20% B；10～10.1 min，20%～100% B；10.1～12.5 min，100% B；12.5～12.6 min，100%～0 B）；流速：0～2 min，15 mL/min；2～12.6 min，30 mL/min；檢測波長：220 nm和254 nm；柱溫：室溫。

第二次純化，色譜柱：Phenomenex Gemini C18（150 mm×30 mm，5 μm）；流動相A：3 mmol碳酸氫銨水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0～1 min，0 B；1～5 min，0 B；5～13.5 min，0～30% B；13.5～13.6 min，30%～100% B；13.5～13.6 min，30%～100% B；13.6～15.6 min，100% B；15.6～15.7 min，100%～0 B；15.7～16.5 min，0 B）；流速：0～1 min，15 mL/min；1～16.5 min，30 mL/min；檢測波長：220 nm和254 nm；柱溫：室溫。

2.3 雜質的分離純化

每次取10 g阿莫西林重粉原料（未知雜質含量為0.059%），加入水25 mL、二甲亞砜45 mL和5%的甲酸溶液8 mL溶解得到澄清透明的溶液，濾過后作為待分離的原樣品溶液。

取上述配置好的原樣品溶液通過Prep-HPLC方法進行第一次的純化。目標雜質在8.90～9.30 min（紅色虛線方框所標記，確定目標雜質位于該保留時間段）被洗脫出來，Prep-HPLC色譜圖如圖1所示。

第一次純化后得到的目標餾分迅速進行凍干，純度為9.23%（歸一化法）。將所得的目標雜質使用純水溶解后，通過第二次的純化。目標雜質在12.95～13.35 min

（紅色虛線方框所標記，確定目標雜質位于該保留時間段）被洗脫出來，Prep-HPLC色譜圖如圖2所示。

第二次純化得到的目標餾分按照第一次分離純化的冷凍干燥法進行處理。為了保證樣品的純度，將凍干后固體樣品放置在氮氣柜中保存，重復上述分離純化工作，待富集后得到目標雜質總量為18.5 mg，

取10 mg進行相關檢測。

使用Shimadzu LC20AD儀器對阿莫西林原樣品及分離純化后得到的目標雜質進行HPLC純度檢測，目標雜質純度為90.27%（歸一化法），阿莫西林重粉原料HPLC檢測分析如圖3所示。

將阿莫西林原樣品、分離純化后得到的雜質樣品，以及原樣品和雜質樣品的混合物進行HPLC檢測定位，雜質保留時間與原樣品中待鑒的未知雜質一致，如圖4所示。

2.4 結構鑒定

分離純化出來的雜質經HRMS質譜、NMR波譜分析確證其結構如圖5所示，下面就結構鑒定過程進行闡述。

2.4.1 HRMS質譜分析

對分離純化后得到的目標未知雜質進行HRMS檢測。通過一級質譜檢測此雜質的MS值為380.1288[M+H]+ （calcd. for C17H22N3O5S+： 380.1275），確定分子式為C17H21N3O5S，與確證的化學結構一致（圖5）。

2.4.2 NMR波譜分析

1H-NMR和13C-NMR分別顯示未知雜質具有18個非活潑氫，以及15組碳信號，DEPT135顯示8組1級或3級碳和1組2級碳，NMR波譜數據總結于表1中。

1H-NMR顯示δH 1.44和δH 0.95積分為3，表明存在1個甲基s峰和1個甲基t峰，為（H-17，H-29）。低場區δH 6.70，δH 7.19分別存在積分為2的d峰，表明存在1，4取代苯環信號（H-1， H-3， H-4， H-6）。

HSQC及DEPT135顯示δH 0.95與δC 11.3直接相連，δH 1.71與δC 30.9直接相連，提示為1個甲基（-CH3）和1個亞甲基（-CH2）相連；δH 5.40（H-10）， δH 5.30（H-13）， δH 4.53（H-7）， δH 4.05（H-14）分別與δC 57.6（C-10）， δC 66.3（C-7）， 57.0（C-7）， δC 73.6（C-14）直接相連，提示為4個連N的次甲基（-CH）。

1H-1H COSY結合HSQC譜可以確定分子中存在4個自旋耦合片段：-CH（1）-CH（6）-， -CH（3）-CH（4）-， -CH（10）-CH（13）-， -CH（28）-CH（29）-， HMBC譜中H-1和C-3， C-5， H-6和C-2， C-4的一系列相關信號可以確定C-1， C-2， C-3， C-4， C-5， C-6組成一個六元環（環A）。H-28， H-17和C-14， C-15， H-14和C-13， C-23的相關信號與阿莫西林結構（圖6）比對可以確定C-13， C-14， C-15 和N， S組成一個五元環（環C），且C-28， C-17連接在C-15上，C-23連接在C-14上。H-13與C-11， H-10與C-11， H14與C-11的HMBC相關信號可以確定C-10， C-11， C-13和N組成一個四元環（環B），且通過C-13， N-12與環C駢合。最后通過H-10與C-8， H-7與C-6， C-8的相關信號可以確定環B與環A通過C-7， C-8， -NH-連接在一起。1H-1H COSY與1H-13C HMBC的關鍵相關信號，也見圖7。

綜合以上核磁解析數據，可判定化合物的平面結構如圖5所示。

目標雜質相較于阿莫西林分子結構中增加一個手性中心（C-15），NOESY譜圖中H-17未與H-13出現相關信號，H-28與H-13a有弱相關，H-14a與H-17有強相關，而與H-28/H-29未見相關，推測H-14a與H-17處于分子同側，結構如圖8。

2.4.3 結構確證

通過核磁共振圖譜1H-NMR、1H-1H COSY、NOESY、13C-NMR、DEPT、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC的相關信號解析出目標未知雜質的結構，結合（+）-ESI-TOF譜中觀察到m/z為380.1278，正是[M+H]+的離子峰，與目標雜質的分子式 （C17H21N3O5S）匹配；另外，其MS/MS碎片峰也與圖5所示的結構一致（圖9）。

2.5 結果與討論

本研究采用阿莫西林重粉原料藥制備分離得到了未知雜質，并通過質譜、核磁和HPLC對未知雜質的結構進行了表征和確證。確定了未知雜質結構為（2S，3R，5R，6R）-3-甲基-3-乙基-6-[（R）-（-）-2-氨基-2-（4-羥基苯基）乙酰氨基]-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3.2.0]庚烷-2-甲酸，即阿莫西林C3位上的一個甲基被乙基替代后形成了五元環3-甲基-3-乙基二取代阿莫西林的衍生物（圖5）；這個雜質系首次從阿莫西林原料藥中分離鑒定[10，12]。

結合原料藥中該未知雜質的鑒定的結構特點，主要差異是在阿莫西林中6-APA部分C3位上的一個甲基替代為乙基，形成一個五元環3-甲基-3-乙基二取代的6-APA衍生物。結合阿莫西林的制備工藝分析，該工藝從6-APA到阿莫西林中涉及到的酶促反應，從機理上分析不可能促使阿莫西林中6-APA部分C3位上的甲基轉變為乙基[13]。因此，最有可能是該未知雜質由在發酵制備6-APA過程中引入的3-甲基-3-乙基二取代的6-APA衍生物，其進一步與D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽溶液在酶作用下進行縮合反應產生的工藝副產物。

據2021年專利CN112480143A報道[14]，該類化合物與已知的抗微生物劑相比具有更好的殺菌活性、更寬的作用譜、更好的耐藥性和更少的副作用，但合成上存在一定的難度。此雜質的發現為其生物合成提供了線索。該未知雜質為阿莫西林支鏈取代基上變化的產物，與阿莫西林屬同系物，屬于EMA《抗生素中相關雜質質量標準制定》指導原則中指出的與阿莫西林結構密切相關的一般雜質，無新的高毒性結構，可在原料質量控制過程中適當放寬限度。本研究的結果為青霉素類藥物中同系物雜質的控制提供了研究方法，也為該類雜質合理的質控限度提供了制定的依據。

參 考 文 獻

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