α-亞麻酸通過調節Th17減輕鮑曼不動桿菌感染小鼠的肺部炎癥

摘要：目的 探究α-亞麻酸（ALA）在鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii， AB）小鼠肺炎中的作用機制。方法 12只BALB/c小鼠隨機分成野生組和肺炎組，分別利用靶向代謝組學技術和轉錄組學技術分析野生組和肺炎組小鼠的血清和肺組織中差異代謝物和差異基因。另取18只BALB/c小鼠隨機分為空白組（vehicle組）、A. baumannii感染組（A. baumannii組）和實驗組（A. baumannii+ALA組）?？瞻捉M和A. baumannii感染組給予普通飲食28 d，實驗組給予定制飼料（含5% ALA）喂養28 d，第28天時A. baumannii感染組和實驗組給予鮑曼不動桿菌懸液滴鼻，空白組給予PBS緩沖液滴鼻。24 h后取小鼠肺組織，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學變化、酶聯免疫吸附（ELISA）法測定肺組織炎癥因子；流式細胞術和免疫熒光技術檢測肺組織輔助性T細胞17（Th17）比例。體外評估ALA對于Th17細胞的影響時，設立ALA組（添加100 μmol/L ALA）和對照組（添加相同體積PBS）并用流式細胞術分析Th17細胞比例。結果 代謝組學顯示，肺炎組小鼠血清的ALA水平顯著低于野生組[（3.19+0.76） μg/mL比（10.32+1.75） μg/mL， Plt;0.0001]。轉錄組學顯示，肺炎組小鼠的肺組織IL-17信號通路中有32個差異基因，其中包括28個上調基因和4個下調基因。在添加ALA的小鼠實驗組中，實驗組肺組織病理感染嚴重程度相比于A. baumannii感染組明顯減輕，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-17A水平和Th17細胞比例相比于A. baumannii感染組有明顯降低（均Plt;0.05），IL-6和IL-10水平相對于A. baumannii感染組明顯升高（均Plt;0.05）。在體外分化實驗中，ALA組Th17細胞比例明顯低于對照組（Plt;0.05）。結論 AB肺炎小鼠血清ALA水平低下，補充ALA后通過抑制Th17分化，對鮑曼不動桿菌所致肺炎具有保護作用，提示膳食補充ALA對鮑曼不動桿菌感染的控制具有一定益處。

關鍵詞：鮑曼不動桿菌；α-亞麻酸；Th17細胞；IL-17A

中圖分類號：R563.1 文獻標志碼：A

α-linolenic acid alleviates pulmonary inflammation induced by Acinetobacter baumannii by modulating Th17 cell

Zhang Ding，" Zhang Hui，" Zhu Yunzhu， Li Jiabin， and Ye Ying

（Department of infectious diseases， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022）

Abstract Objective To investigate the mechanism of α-linolenic acid on A. baumannii-infected pneumonia in mice. Methods A total of 12 BALB/c mice were randomly divided into two groups： The wild group and the pneumonia group. The differential metabolites and genes in the serum and lung tissues of the wild group and pneumonia group were analyzed by targeted metabonomics technology and RNA sequencing technology， respectively. In addition， 18 BALB/c mice were randomly divided into three groups： The blank group （vehicle group）， the A. baumannii-infected group （A. baumannii group） and the experimental group （A. baumannii +ALA group）. The vehicle group and A. baumannii group were given the regular diet for 28 days，" while the A. baumannii+ALA group was given customized feed （including 5% ALA） for 28 days." On day 28， the A. baumannii group and the A. baumannii+ALA group were given A. baumannii through intranasal infection， and the vehicle group was given phosphate buffer solution through intranasal administration. After 24 hours， the lung tissues were collected. Histopathological changes in lung tissues were determined by using hematoxylin and eosin staining. Pulmonary inflammatory cytokines were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Flow cytometry analysis and immunofluorescence techniques were performed to determine the proportion of T helper cells 17 （Th17） in lung tissue. To evaluate the effect of ALA on Th17 cells in vitro， the ALA group （adding 100 μmol/LALA） and the control group （adding the same volume of PBS） were set up and analyzed by flow cytometry analysis. Results Metabonomics showed that the serum ALA level in the pneumonia group was significantly lower compared with the wild group [（3.19+0.76） μg/mL vs. （10.32+1.75） μg/mL， Plt;0.0001]. Transcriptomics showed that there were 32 differential genes in the IL-17 signaling pathway in the lung tissues of mice in the pneumonia group， including 28 up-regulated genes and 4 down-regulated genes. Compared with the A. baumannii group， the A. baumannii+ALA group alleviated pulmonary histopathological condition， the expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-17A and the percentages of Th17 cells were decreased （all Plt;0.05）. The expression levels of IL-6 and IL-10 in the A. baumannii+ALA group were higher than those in the A. baumannii group （all Plt;0.05）. The percentages of Th17 cells in the A. baumannii+ALA group were lower than that in" the A. baumannii group （Plt;0.05） in vitro experiments. Conclusion The serum ALA level was low in A. baumannii pneumonia mice and the supplementation of ALA could protect A.baumannii pneumonia by inhibiting Th17 differentiation， suggesting that dietary supplementation of ALA had benefits in the control of A. baumannii infection.

Key words Acinetobacter baumannii; α-linolenic acid; Th17 cells; IL-17A

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）是一種需氧的革蘭陰性條件致病菌，是引起呼吸機相關性肺炎和膿毒癥院內感染的主要病原菌。因為其多重耐藥性和高達42.6%的死亡率[1]，已經被世界衛生組織列為需緊急控制的重要病原體之一[2-3]。深入研究鮑曼不動桿菌的致病機制對控制其流行與治療非常重要。病原體感染和脂肪酸代謝密切相關。ω-3系多不飽和脂肪酸，尤其是α-亞麻酸（α-linolenic acid， ALA）已被證明具有顯著的抗炎作用[4]。細胞因子在宿主對細菌感染的防御中起著重要作用。白介素17（IL-17）是一種細胞因子，在一些細菌感染如肺炎克雷伯桿菌，金黃色葡萄球菌[5-6]發揮保護作用。然而，在幽門螺桿菌、結核分枝桿菌以及流感病毒中，IL-17可以加重組織損傷[7-9]。本研究構建了AB誘導的小鼠肺炎模型，利用多組學和分子實驗技術綜合闡明了ALA在AB感染過程中通過減少Th17起到減輕肺部炎癥的作用。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、細胞及材料

1.1.1 動物

野生型BALB/c雌性小鼠購自安徽省實驗動物中心（中國合肥）。飼養于安徽醫科大學無特定病原體動物房中，實驗動物許可證：SYXK（皖）2022-001。飼養室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，保證12 h光照。小鼠籠盒、墊料、飼料和飲用水經過高溫高壓消毒滅菌處理。每周更換2次墊料。所有實驗操作均遵循安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準，倫理審批號：LLSC20200224。

1.1.2 菌株

使用高毒力菌株Ab5075，由浙江大學邵逸夫醫院俞云松教授贈送。

1.1.3 主要試劑和儀器

α-亞麻酸（批號：463-4-0-1）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；普通小鼠飼料（批號：XT19004）和定制小鼠飼料（批號：XT19008）購自南京協同生物公司；環磷酰胺（批號：H20110407）購自上海百特醫療用品貿易有限公司；膠原酶D（批號：05401020001）和DNase試劑（批號：1014159001）購自瑞士Roche公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：1217202）、白介素（IL）-6 ELISA試劑盒（批號：12106021）、IL-10 ELISA試劑盒（批號：1211002）、IL-17 ELISA試劑盒（批號：1211702）均購自上海達科維有限公司；小鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號：2M-KMLJM211201）購自于南京卡米洛生物工程有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4抗體（批號：100511）、藻紅蛋白（PE）-17A抗體（批號：506903）、多甲藻-葉綠素-蛋白復合物（PerCP）-CD45抗體（批號：103129）和活性紫（BV）510-CD3抗體（批號：100234）均購自上海達科維有限公司；RPMI 1640培養基（批號：11875119）購自美國Gibco公司；細胞刺激混合液（由40.5 μmol/L的佛波酯、669.3 μmol/L的離子霉素和2.5 mg/mL的布雷非德菌素A構成）（批號：423303）購自美國BioLegend公司；CD4+ T細胞分選試劑盒（批號：B90001）購自美國Sellcek公司；流式分析儀（美國BD Biosciences公司）；酶標儀（美國Bio-BAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌肺炎模型及分組

12只6～8周齡雌性BALB/c小鼠按隨機數字表法分成兩組，野生組和肺炎組。使用的菌株為Ab5075，滴鼻前4 d需腹腔注射環磷酰胺（300 mg/kg），使用1%的戊巴比妥麻醉，待小鼠深度麻醉后，肺炎組使用微量進樣器分別鼻內接種1.2 mL/kg的5×107 CFU/mL的細菌懸浮液。野生組使用微量進樣器分別鼻內滴加相同體積的PBS，再垂直放置4 min后，小鼠保持30°臥位直到恢復意識，感染24 h后采集各組血液和肺組織分別進行靶向代謝組測序和轉錄組測序。

1.2.2 肺組織轉錄組學

采集小鼠新鮮肺組織使用Trizol法提取RNA。再將RNA分解為長度300 bp左右的片段，以RNA為模板，用6堿基隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板進行第二鏈cDNA的合成，文庫構建完成后，采用PCR擴增進行文庫片段富集，之后根據片段大小進行文庫選擇，文庫大小在450 bp。再通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行質檢，再對文庫總濃度及文庫有效濃度進行檢測。然后根據文庫的有效濃度以及文庫所需數據量，將含有不同Index序列（各樣本加上不同的Index，最后根據Index區分各樣本的下機數據）的文庫按比例進行混合。混合文庫統一稀釋到2 nmol/L，通過堿變性，形成單鏈文庫。建庫之后，采用第二代測序技術（next-generation sequencing，NGS），基于Illumina測序平臺，對這些文庫進行雙末端（paired-end，PE）測序，再經過數據過濾和質量評估，將測序數據與參考基因組數據進行比較。再使用HTSeq統計比對到每一個基因上Read Count值，作為基因的原始表達量并使用TPM對表達進行規范化。使用R語言分析數據，符合條件表達差異倍數 |log 2 Fold Change|gt;1且顯著性Plt;0.05的基因認定為差異基因，并進行KEGG富集分析。

1.2.3 血清代謝組學

由上海派諾森公司對AB小鼠血清中的脂肪酸進行代謝組學分析，向樣本中加入1%的硫酸甲醇，充分混勻，80 ℃水浴鍋水浴30 min，取出后冷卻，加入正己烷萃取，再加入5 mL水（4 ℃）洗滌，3500 r/min離心10 min，吸取上清700 μL，向上清中加入無水硫酸鈉粉末混勻，1200 r/min離心5 min，吸取上清液加入水楊酸甲酯混勻，取上清檢測，使用色譜柱Thermo TG-FAME毛細管柱進行GC-MS檢測。

1.2.4 ALA治療方法及分組

18只4周齡雌性BALB/c小鼠隨機分組為空白組（vehicle組，n=6），A. baumannii感染組（A.baumannii組，n=6）和實驗組（A. baumannii+ALA組， n=6）?？瞻捉M和A. baumannii感染組使用普通飲食28 d，實驗組使用ALA（含5% ALA）飲食28 d，第25天腹腔注射環磷酰胺（300 mg/kg），第28天，A. baumannii感染組和實驗組鼻內接種濃度為1.2 mL/kg的5×107 CFU/mL Ab5075菌懸液，空白組鼻內接種相同體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution， PBS）。24 h后采集各組肺組織樣本檢測病理情況、菌載量、炎癥因子水平和Th17細胞比例。

1.2.5 肺組織病理切片制備

處死小鼠后取出完整肺組織，放入4%多聚甲醛固定，再依次進行脫水透明、浸蠟包埋、切片展片、脫蠟染色，最后用中性樹膠封片。

1.2.6 肺組織菌載量

取定量肺組織加入預冷的PBS緩沖液，在研磨機研磨120 s，連續梯度稀釋鋪于LB平板上，37 ℃孵育過夜后計數。

1.2.7 ELISA檢測肺組織細胞因子

取新鮮肺組織稱重，加入等比例的PBS和鋼珠，使用研磨機研磨4次，每次60 s ，再以5000 r/min離心10 min，取上清置于新管中并加入蛋白酶抑制劑，取適量上清采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測細胞因子濃度，操作步驟嚴格按照說明書進行，根據吸光度值計算含量。

1.2.8 肺組織細胞分離

取新鮮肺組織，加入消化液（含0.5 mg/mL膠原酶D和20 μg/mLDNase 的RPMI 1640培養基）后，以37 ℃和200 r/min震蕩30 min，再通過100 μm的細胞濾網獲取單細胞懸液，細胞刺激混合液刺激5 h后可加入抗體染色并使用流式細胞儀上機。

1.2.9 流式細胞分析Th17細胞比例

取單細胞懸液，加入FITC-CD4抗體，PerCP-CD45抗體和BV510-CD3抗體染色，經固定、破膜后加入抗小鼠PE-IL-17A抗體進行Th17細胞染色，流式細胞儀上機分析。

1.2.10 免疫熒光觀察Th17細胞比例

取新鮮肺組織，加入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，EDTA進行抗原修復后加入3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，再使用CD4抗體、IL-17A抗體和二抗做相應的標記，切片圖像為數字切片掃描儀掃描。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，計數免疫熒光抗體標記的陽性細胞數。

1.2.11 原代T細胞的分離培養及分組

取小鼠脾臟制備單細胞懸液，再使用小鼠CD4+ T細胞分選試劑盒分選出Na?ve CD4+ T細胞。培養板需預先5 μg/mL的CD3抗體過夜孵育，RPMI 1640培養基中添加5 μg/mL的CD28抗體、50 ng/mL的IL-6、1 ng/mL的TGF-β1、5 ng/mL的IL-23 10 μg/mL的IL-4抗體及10 μg/mL的干擾素（IFN）-γ抗體4 d。上述細胞隨機分為對照組和ALA組，ALA組給予100 μmol/L亞麻酸處理，對照組給予同體積PBS處理。第五天經過刺激后加入抗體染色，使用流式細胞儀上機分析Th17細胞比例。

1.3 統計分析

采用SPSS 27.0.1統計軟件分析數據，正態分布資料采用x±s表示；總體比較行單因素方差分析，各組間多重比較行LSD-t檢驗；Plt;0.05為差異有統計學意義。非正態分布，均以M（Q1，Q3）表示，采用Mann-Whitney U檢驗進行兩組比較。雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肺炎組小鼠與野生組小鼠體內脂肪酸含量比較

OPLS-DA分析圖顯示肺炎組和野生組小鼠血清脂肪酸代謝譜不同，熱圖表明：相比于野生組，肺炎組小鼠血清中有18種脂肪酸的豐度具有顯著差異，且均呈下調水平（圖1A～B）。火山圖顯示：兩組血清中只有這18種脂肪酸豐度具有差異，其他31種脂肪酸豐度沒有差異（圖1C）。在差異脂肪酸中差異性較大的主要是長鏈不飽和脂肪酸，如ALA、油酸、異油酸、二十二碳五烯酸（DPA）和巖芹酸等（圖1D～H），其中ALA已經被證明具有抗炎作用，我們猜想肺部炎癥是否與ALA降低有關。

2.2 ALA減輕AB誘導的肺損傷

在感染細菌后，A.baumannii感染組的肺損傷程度明顯高于空白組[3.00（2.50，3.00）比0（0，0.5），Plt;0.05]。實驗組（含ALA飼料喂養）的肺組織炎癥和病理評分相比于A. baumannii感染組[1.00（1.00，2.00）比3.00（2.50，3.00）分，Plt;0.05]明顯降低（圖2A）；肺部炎癥因子，如TNF-α、IL-1β和IL-17A有明顯下降，IL-6和IL-10呈上升趨勢（表1）；但是肺內的細菌負荷沒有明顯改變[（650.00±91.65） CFU/mouse比（536.70±32.15） CFU/mouse，Pgt;0.05）]（圖2B）。因此ALA在AB引起的肺部感染中起保護作用，可以減輕肺損傷，但不是通過清除細菌途徑。

2.3 鮑曼不動桿菌感染后肺組織轉錄組學分析

在轉錄組分析中，相比于野生組，肺炎組共檢測到2468個差異基因，1430個上調基因，1038個下調基因（圖3A），并對差異基因進行KEGG富集，選擇前20個差異性較大的通路制作氣泡圖（圖3B），如TNF-α信號通路、細胞因子受體通路和IL-17信號通路等，其中IL-17信號通路發生明顯改變，有28個上調基因，4個下調基因，整體呈上調水平。這與感染AB后小鼠肺組織內IL-17A提高的結果一致，也驗證了IL-17A在AB感染中重要性。而在補充ALA后，IL-17A的水平出現明顯的降低，我們推測ALA是否可以影響IL-17A的水平。

2.4 ALA降低肺組織中Th17細胞比例，并抑制Na?ve T cells向Th17細胞分化

免疫熒光技術和流式細胞術檢測結果顯示，實驗組與A. baumannii感染組相比{[（106.00±42.19）個/HPF比（233.60±44.42）個/HPF，Plt;0.01]和[（1.00±0.16）%比（1.70±0.46）%，Plt;0.01]}肺組織內的Th17細胞的比例明顯降低（圖4A～C和E）。體外細胞培養時， ALA處理組相比于對照組的T細胞向Th17分化的比例明顯降低[（5.47±1.26）%比（8.08±1.51）%，Plt;0.05）]（圖4D和F）。綜上所述，ALA可以通過抑制Th17細胞的分化而減輕AB感染導致的肺部炎癥。

3 討論

本研究通過靶向代謝組學分析顯示，與對照組小鼠相比，AB肺炎小鼠ALA豐度發生顯著降低。額外添加ALA可以顯著改善AB感染小鼠肺組織病理炎癥和炎癥因子水平。此外，ALA通過抑制Th17細胞分化，發揮抗炎作用。綜上所述，本研究目的是探究補充ALA對鮑曼不動桿菌肺部感染患者的治療益處。

AB主要感染一些免疫功能低下的患者，常造成肺部感染和菌血癥。相比于其他不動桿菌，鮑曼不動桿菌的毒力因子更強，被免疫細胞吞噬時具有更強的抵抗力[10]，因此，AB入侵時，LPS會持續地激活TLR4受體觸發大量中性粒細胞涌入[11]，造成細胞因子風暴和敗血癥綜合征，由于患者免疫功能低下，死亡率增加。因此減少細胞因子過度激活對于提高生存率有重要意義。此外菌載量似乎并不是感染的關鍵因素，在耗竭小鼠體內的巨噬細胞后，肺組織的菌載量明顯升高，但小鼠并沒有出現死亡[12]。本實驗結果亦如此，實驗組和對照組的肺組織菌載量無明顯差異，但是炎癥情況明顯減輕。

病原體感染和脂肪酸代謝緊密聯系，一些病原體如結核分枝桿菌，新型冠狀病毒和流感病毒入侵后，宿主血清中多數游離脂肪酸會發生下調[13-15]，可能是因為病原體可以直接利用宿主體內的脂肪酸，如病毒和金葡菌[13，16-17]，也可能是需要消耗更多的脂肪酸以維持cGAS-STING通路的平衡[18]。ALA屬于ω -3脂肪酸，具有顯著的抗炎作用，最新研究表明，ALA可以抑制線粒體內過量ROS產生，減輕自噬損傷[19]。ALA也被證明抑制NF-kB活化，減少TNF-α， IL-1β等細胞因子表達[4]，截至目前，ALA在炎癥性腸病，哮喘和動脈粥樣硬化中都發揮著保護作用[20-22]。此外，ω-3系脂肪酸具有抗不動桿菌的潛力[23]。本實驗結果亦提示，在AB肺炎小鼠組，血清中ALA水平顯著降低，再補充ALA后，肺部炎癥明顯減輕。

IL-17在宿主防御病原體的呼吸道感染中起著重要作用[24]，但是在脆弱擬桿菌和盲腸結扎誘導的膿毒癥模型中，中和IL -17治療可防止膿腫形成，提高生存率[25-26]。同樣，IL-17是AB感染時的重要致病因子[27]。在AB感染中檢測到IL-17[28]，接種AB重組外膜蛋白A可誘導IL-17反應[29]。IL-17的主要功能之一是將中性粒細胞募集到感染部位[24]，持續的中性粒細胞募集會攻擊宿主組織并導致嚴重的炎癥[30]。因此抑制IL-17是可以被認為是治療AB感染導致組織損傷的方法。本研究顯示：AB肺炎感染組，Th17信號通路發生明顯上調。在補充ALA之后，肺組織內Th17細胞和細胞因子IL-17明顯降低，在體外Th17分化時添加ALA，也會抑制Th17細胞分化。這些結果表明，ALA可能是通過抑制Th17細胞分化來發揮保護作用。

本研究顯示，AB肺炎的減輕是ALA通過抑制Th17分化產生的，ALA如何影響Th17細胞的機制尚不清楚，此外，是否有其他免疫因子也被影響而促進這種保護作用，仍有待進一步研究?？傊?，本研究通過小鼠AB肺炎模型發現AB感染后ALA水平降低，補充ALA通過抑制Th17細胞分化發揮作用降低了肺部炎癥，這是應對AB感染治療的一條新思路。

參 考 文 獻

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