肉雜雞肺炎克雷伯菌耐藥菌株的分離鑒定

司振書++張海濤++邵丹++秦飛燕

摘要：2015年6月中旬，山東省莘縣、高唐等地多個養殖場3日齡肉雜雞出現張口、伸頸、呼吸困難等癥狀，剖檢呼吸道無明顯病變，心臟、肝臟周圍及皮下有大量淡黃色膠凍樣滲出物，肝臟有大量點狀壞死，為確定病原，對發病雞的喉拭子進行了流感抗原性檢測；對病雞的肺臟進行了病毒分離培養；對其肝臟、心臟進行了細菌的分離培養、生化鑒定及藥敏試驗。結果表明，肉雜雞發病由金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的混合感染所致，針對無禽流感病毒和新城疫病毒的感染，采取了敏感藥物治療、消毒、加強飼養管理等綜合措施，7 d后，發病情況逐漸好轉，雞群15日齡時趨于穩定。

關鍵詞：肉雜雞；肺炎克雷伯菌；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥菌株

中圖分類號： S858.31文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0152-02

魯西小型肉雜雞是用快大型白羽肉雞的父母代父系公雞作父本，褐殼商品蛋雞作母本雜交而來，具有生長速度快、飼料報酬高、飼養周期短、料肉比低、肉質嫩、易加工、易成熟等特點，是制作脫骨扒雞的最理想原料，在山東聊城各縣（區）均具有較大養殖規模。2015年6月中旬，山東省莘縣、高唐等地多個肉雜雞養殖場相繼發生同樣疾病，3日齡小肉雞開始出現張口、伸頸、呼吸困難，生長發育受阻，剖檢呼吸道無明顯病變，心臟、肝臟周圍及皮下有大量的淡黃色膠凍樣滲出物，肝臟有大量點狀壞死。通過對雞苗來源與去向等調查排除了雞苗質量問題。采取病料進行細菌的分離培養，經鑒定分離到1株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和1株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），且肺炎克雷伯菌分離株對多種藥物具有耐藥性。

1材料與方法

1.1材料與設備

營養瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板由聊城大學動物預防獸醫實驗室制備。禽流感病毒（通用）抗原快速檢測卡，購于深圳真瑞生物科技有限公司；XK型自動細菌鑒定儀、腸桿菌鑒定試劑盒、葡萄球菌鑒定試劑盒等由山東鑫科生物科技有限公司提供；各種藥敏紙片，購于浙江杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2病料的采取

進行無菌操作，取發病肉雞的喉拭子、肺臟、肝臟、心臟。

1.3禽流感抗原檢測

將喉拭子立即用禽流感病毒抗原快速檢測卡進行檢測，操作方法按說明書進行。

1.4病毒的分離培養與鑒定

進行無菌操作，取少量肺臟樣品，放入滅菌的研磨器，加含雙抗的PBS研磨成10%～20%的懸液。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清，接種于4 枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，02 mL/胚，每12 h照胚1 次，棄去24 h內死亡胚，及時取出24～72 h死胚，于4 ℃冰箱過夜，72 h未死亡的全部取出置于冰箱內凍死，無菌收取尿囊液。用1%的雞紅細胞測定尿囊液有無血凝性；若無血凝性，則可排除新城疫病毒、禽流感病毒的感染；若有，則通過血凝抑制試驗進一步進行鑒定。

1.5細菌的分離培養

取肝臟、心臟分別接種營養瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂、麥康凱瓊脂平板，37 ℃恒溫培養24 h，觀察結果，挑取單個菌落進行純培養。

1.6細菌的形態染色觀察

將分離得到的細菌純培養物進行革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.7細菌的鑒定

將分離純化的細菌分別采用適宜的細菌鑒定試劑盒，通過XK型自動細菌鑒定儀進行鑒定，操作方法按說明書進行。

1.8藥敏試驗

挑取分離純化的細菌菌落，用滅菌的生理鹽水制成懸液，校正濃度為0.5 麥氏標準，用滅菌棉簽均勻涂布平板，貼上各種藥敏紙片，置于37 ℃恒溫箱培養，18 h后取出測量抑菌圈直徑。

2結果與分析

2.1禽流感病毒抗原檢測結果

經檢測，病雞喉拭子禽流感病毒抗原為陰性。

2.2病毒分離結果

接種病料的4 枚SPF雞胚孵化72 h均未死亡，對尿囊液進行HA檢測，均無血凝性。

2.3細菌的分離培養結果

從肝臟分離得到的細菌在營養瓊脂平板上形成光滑、隆起、圓整的橙黃色菌落；在高鹽甘露醇瓊脂上，形成淡黃色、光滑、濕潤、圓形的小菌落；在麥康凱瓊脂上不生長。從心臟分離得到的細菌，在營養瓊脂平板上形成光滑、濕潤、乳白色、凸起、濃厚黏稠的菌落；在麥康凱瓊脂平板上，菌落淡紅色，黏稠、膠狀；在高鹽甘露醇瓊脂上不生長。對分離得到的細菌進一步純化，最后獲得2 種細菌的純培養物。

2.4細菌形態染色特點

從肝臟分離到的細菌呈球形，革蘭氏染色呈陽性，多呈葡萄串狀，也有成對或短鏈狀排列的；從心臟分離到的細菌呈桿形，革蘭氏染色呈陰性，多單個存在。

2.5分離菌的鑒定結果

將分離得到的革蘭氏陰性桿菌用腸桿菌鑒定試劑盒進行檢測，各生化孔顯示，蕈糖+、蔗糖+、賴氨酸脫羧酶+、乳糖+、尿素酶+、靛基質試驗-、七葉苷+、丙二酸鹽+、鳥氨酸脫羧酶-、山梨醇+、OF+、水楊素+、枸櫞酸鹽-、肌醇+、精氨酸-、棉子糖+、β半乳糖+、甘露醇+，鑒定結果表明該菌為肺炎克雷伯菌，鑒定概率為99.99%。將分離到的革蘭氏陽性球菌用葡萄球菌鑒定試劑盒進行檢測，各生化孔顯示，乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、蕈糖、果糖等均為+，硝酸鹽-、鳥氨酸脫羧酶-、水楊苷-、纖維二糖-、β半乳糖-、精氨酸+、尿素酶試驗+、溶血+、棉子糖-、七葉苷-，鑒定結果表明該菌為金黃色葡萄球菌，鑒定概率為9999%。

2.6藥敏試驗結果

分離得到的肺炎克雷伯菌敏感藥及抑菌圈直徑分別為米諾環素23 mm、頭孢他啶18 mm，而對頭孢噻吩、頭孢呋辛、呋喃妥因、頭孢吡肟、萬古霉素、青霉素G、四環素、克林霉素等均耐藥；分離到的金黃色葡萄球菌的敏感藥及抑菌圈直徑分別為頭孢呋辛25 mm、丁胺卡那霉素24 mm、慶大霉素 22 mm、頭孢氨芐 21 mm、卡那霉素21 mm、環丙沙星20 mm，而對四環素、復方新諾明、克林霉素等耐藥。

3討論

病雞喉拭子禽流感病毒抗原檢測為陰性，可初步排除禽流感病毒的感染，SPF雞胚進行病毒的分離培養，收獲的尿囊液無血凝性，說明發病雞群無禽流感病毒、新城疫病毒的感染；從病雞肝臟及心臟分離到2 種細菌純培養物，根據其形態特征、培養特性及生化特點判斷，兩者分別為金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。據此可初步判斷，該發病由肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌混合感染所致。

肺炎克雷伯菌廣泛存在于自然界，也存在于動物的腸道、呼吸道和泌尿道中，為條件性致病菌[1]。當機體免疫力低下或長期使用抗生素時，引發人和動物的多種疾病。榮光等從發病瀕死的五指山豬體內分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種[2]；劉燕等從白頰長臂猿的膿液中分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種，該菌感染導致白頰長臂猿的膿腫、死亡[3]。肺炎克雷伯菌可引起人的肺炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫等，在家禽，能引起死胚、卵黃囊感染、呼吸道病、眼病、敗血癥和繁殖性疾病[1]。本次肉雜雞的發病可能由于養殖場飼養管理水平較差，日常消毒等環境控制措施不到位，給金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌以可乘之機，造成嚴重的經濟損失。

肺炎克雷伯菌感染家禽的病例報道較少，而對人感染的報道及研究較多。李振江等對256個肺炎克雷伯菌臨床分離株進行了耐藥性研究，結果表明該菌對抗菌藥物的耐藥性較高，49.0%的產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的菌株呈多重耐藥[4]。本次從肉雜雞分離到的肺炎克雷伯菌，除對米諾環素、頭孢他啶具有一定的敏感性外，對其他多種藥物均耐藥，呈現強的耐藥性，獸醫臨床應重視該菌的感染及流行情況，合理使用抗菌藥物。翁幸鐾等對1株耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥相關基因進行研究，該菌株對哌拉西林、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星等均耐藥，該菌耐藥與其攜帶獲得性耐藥基因TEM-1、SHV-11、aac（3）-Ⅱ等基因相關[5]。本次分離到的金黃色葡萄球菌則對多種藥物敏感，綜合2種病原菌的藥敏試驗結果，選用頭孢他啶進行治療，同時對所用器皿、工具、籠舍進行全面消毒，7 d后，發病情況逐漸好轉，15日齡時雞群趨于穩定。

參考文獻：

[1]中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所.獸醫微生物學[M]. 2版.北京：中國農業出版社，2013：179-181.

[2]榮光，趙軍明，侯冠彧，等. 五指山豬肺炎克雷伯菌肺炎亞種的分離及鑒定[J]. 西北農業學報，2011，20（10）：1-5.

[3]劉燕，趙京，張成林，等. 肺炎克雷伯氏菌致白頰長臂猿膿腫一例[J]. 野生動物，2011，32（3）：156-157.

[4]李振江，孫長貴，曾賢銘，等. 肺炎克雷伯菌醫院感染監測及耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志，2007，17（6）：737-739.

[5]翁幸鐾，糜祖煌. 多耐藥肺炎克雷伯菌獲得性耐藥基因及ompK36突變研究[J]. 中華醫院感染學雜志，2010，20（17）：2545-2548.