司振書++張海濤++邵丹++秦飛燕
摘要:2015年6月中旬,山東省莘縣、高唐等地多個養殖場3日齡肉雜雞出現張口、伸頸、呼吸困難等癥狀,剖檢呼吸道無明顯病變,心臟、肝臟周圍及皮下有大量淡黃色膠凍樣滲出物,肝臟有大量點狀壞死,為確定病原,對發病雞的喉拭子進行了流感抗原性檢測;對病雞的肺臟進行了病毒分離培養;對其肝臟、心臟進行了細菌的分離培養、生化鑒定及藥敏試驗。結果表明,肉雜雞發病由金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的混合感染所致,針對無禽流感病毒和新城疫病毒的感染,采取了敏感藥物治療、消毒、加強飼養管理等綜合措施,7 d后,發病情況逐漸好轉,雞群15日齡時趨于穩定。
關鍵詞:肉雜雞;肺炎克雷伯菌;金黃色葡萄球菌;分離鑒定;耐藥菌株
中圖分類號: S858.31文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2017)08-0152-02
魯西小型肉雜雞是用快大型白羽肉雞的父母代父系公雞作父本,褐殼商品蛋雞作母本雜交而來,具有生長速度快、飼料報酬高、飼養周期短、料肉比低、肉質嫩、易加工、易成熟等特點,是制作脫骨扒雞的最理想原料,在山東聊城各縣(區)均具有較大養殖規模。2015年6月中旬,山東省莘縣、高唐等地多個肉雜雞養殖場相繼發生同樣疾病,3日齡小肉雞開始出現張口、伸頸、呼吸困難,生長發育受阻,剖檢呼吸道無明顯病變,心臟、肝臟周圍及皮下有大量的淡黃色膠凍樣滲出物,肝臟有大量點狀壞死。通過對雞苗來源與去向等調查排除了雞苗質量問題。采取病料進行細菌的分離培養,經鑒定分離到1株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和1株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),且肺炎克雷伯菌分離株對多種藥物具有耐藥性。
1材料與方法
1.1材料與設備
營養瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板由聊城大學動物預防獸醫實驗室制備。禽流感病毒(通用)抗原快速檢測卡,購于深圳真瑞生物科技有限公司;XK型自動細菌鑒定儀、腸桿菌鑒定試劑盒、葡萄球菌鑒定試劑盒等由山東鑫科生物科技有限公司提供;各種藥敏紙片,購于浙江杭州天和微生物試劑有限公司。
1.2病料的采取
進行無菌操作,取發病肉雞的喉拭子、肺臟、肝臟、心臟。
1.3禽流感抗原檢測
將喉拭子立即用禽流感病毒抗原快速檢測卡進行檢測,操作方法按說明書進行。
1.4病毒的分離培養與鑒定
進行無菌操作,取少量肺臟樣品,放入滅菌的研磨器,加含雙抗的PBS研磨成10%~20%的懸液。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min,取上清,接種于4 枚10日齡SPF雞胚尿囊腔,02 mL/胚,每12 h照胚1 次,棄去24 h內死亡胚,及時取出24~72 h死胚,于4 ℃冰箱過夜,72 h未死亡的全部取出置于冰箱內凍死,無菌收取尿囊液。用1%的雞紅細胞測定尿囊液有無血凝性;若無血凝性,則可排除新城疫病毒、禽流感病毒的感染;若有,則通過血凝抑制試驗進一步進行鑒定。
1.5細菌的分離培養
取肝臟、心臟分別接種營養瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂、麥康凱瓊脂平板,37 ℃恒溫培養24 h,觀察結果,挑取單個菌落進行純培養。
1.6細菌的形態染色觀察
將分離得到的細菌純培養物進行革蘭氏染色,鏡檢觀察。
1.7細菌的鑒定
將分離純化的細菌分別采用適宜的細菌鑒定試劑盒,通過XK型自動細菌鑒定儀進行鑒定,操作方法按說明書進行。
1.8藥敏試驗
挑取分離純化的細菌菌落,用滅菌的生理鹽水制成懸液,校正濃度為0.5 麥氏標準,用滅菌棉簽均勻涂布平板,貼上各種藥敏紙片,置于37 ℃恒溫箱培養,18 h后取出測量抑菌圈直徑。
2結果與分析
2.1禽流感病毒抗原檢測結果
經檢測,病雞喉拭子禽流感病毒抗原為陰性。
2.2病毒分離結果
接種病料的4 枚SPF雞胚孵化72 h均未死亡,對尿囊液進行HA檢測,均無血凝性。
2.3細菌的分離培養結果
從肝臟分離得到的細菌在營養瓊脂平板上形成光滑、隆起、圓整的橙黃色菌落;在高鹽甘露醇瓊脂上,形成淡黃色、光滑、濕潤、圓形的小菌落;在麥康凱瓊脂上不生長。從心臟分離得到的細菌,在營養瓊脂平板上形成光滑、濕潤、乳白色、凸起、濃厚黏稠的菌落;在麥康凱瓊脂平板上,菌落淡紅色,黏稠、膠狀;在高鹽甘露醇瓊脂上不生長。對分離得到的細菌進一步純化,最后獲得2 種細菌的純培養物。
2.4細菌形態染色特點
從肝臟分離到的細菌呈球形,革蘭氏染色呈陽性,多呈葡萄串狀,也有成對或短鏈狀排列的;從心臟分離到的細菌呈桿形,革蘭氏染色呈陰性,多單個存在。
2.5分離菌的鑒定結果
將分離得到的革蘭氏陰性桿菌用腸桿菌鑒定試劑盒進行檢測,各生化孔顯示,蕈糖+、蔗糖+、賴氨酸脫羧酶+、乳糖+、尿素酶+、靛基質試驗-、七葉苷+、丙二酸鹽+、鳥氨酸脫羧酶-、山梨醇+、OF+、水楊素+、枸櫞酸鹽-、肌醇+、精氨酸-、棉子糖+、β半乳糖+、甘露醇+,鑒定結果表明該菌為肺炎克雷伯菌,鑒定概率為99.99%。將分離到的革蘭氏陽性球菌用葡萄球菌鑒定試劑盒進行檢測,各生化孔顯示,乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、蕈糖、果糖等均為+,硝酸鹽-、鳥氨酸脫羧酶-、水楊苷-、纖維二糖-、β半乳糖-、精氨酸+、尿素酶試驗+、溶血+、棉子糖-、七葉苷-,鑒定結果表明該菌為金黃色葡萄球菌,鑒定概率為9999%。
2.6藥敏試驗結果
分離得到的肺炎克雷伯菌敏感藥及抑菌圈直徑分別為米諾環素23 mm、頭孢他啶18 mm,而對頭孢噻吩、頭孢呋辛、呋喃妥因、頭孢吡肟、萬古霉素、青霉素G、四環素、克林霉素等均耐藥;分離到的金黃色葡萄球菌的敏感藥及抑菌圈直徑分別為頭孢呋辛25 mm、丁胺卡那霉素24 mm、慶大霉素 22 mm、頭孢氨芐 21 mm、卡那霉素21 mm、環丙沙星20 mm,而對四環素、復方新諾明、克林霉素等耐藥。
3討論
病雞喉拭子禽流感病毒抗原檢測為陰性,可初步排除禽流感病毒的感染,SPF雞胚進行病毒的分離培養,收獲的尿囊液無血凝性,說明發病雞群無禽流感病毒、新城疫病毒的感染;從病雞肝臟及心臟分離到2 種細菌純培養物,根據其形態特征、培養特性及生化特點判斷,兩者分別為金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。據此可初步判斷,該發病由肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌混合感染所致。
肺炎克雷伯菌廣泛存在于自然界,也存在于動物的腸道、呼吸道和泌尿道中,為條件性致病菌[1]。當機體免疫力低下或長期使用抗生素時,引發人和動物的多種疾病。榮光等從發病瀕死的五指山豬體內分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種[2];劉燕等從白頰長臂猿的膿液中分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種,該菌感染導致白頰長臂猿的膿腫、死亡[3]。肺炎克雷伯菌可引起人的肺炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫等,在家禽,能引起死胚、卵黃囊感染、呼吸道病、眼病、敗血癥和繁殖性疾病[1]。本次肉雜雞的發病可能由于養殖場飼養管理水平較差,日常消毒等環境控制措施不到位,給金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌以可乘之機,造成嚴重的經濟損失。
肺炎克雷伯菌感染家禽的病例報道較少,而對人感染的報道及研究較多。李振江等對256個肺炎克雷伯菌臨床分離株進行了耐藥性研究,結果表明該菌對抗菌藥物的耐藥性較高,49.0%的產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的菌株呈多重耐藥[4]。本次從肉雜雞分離到的肺炎克雷伯菌,除對米諾環素、頭孢他啶具有一定的敏感性外,對其他多種藥物均耐藥,呈現強的耐藥性,獸醫臨床應重視該菌的感染及流行情況,合理使用抗菌藥物。翁幸鐾等對1株耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥相關基因進行研究,該菌株對哌拉西林、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星等均耐藥,該菌耐藥與其攜帶獲得性耐藥基因TEM-1、SHV-11、aac(3)-Ⅱ等基因相關[5]。本次分離到的金黃色葡萄球菌則對多種藥物敏感,綜合2種病原菌的藥敏試驗結果,選用頭孢他啶進行治療,同時對所用器皿、工具、籠舍進行全面消毒,7 d后,發病情況逐漸好轉,15日齡時雞群趨于穩定。
參考文獻:
[1]中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所.獸醫微生物學[M]. 2版.北京:中國農業出版社,2013:179-181.
[2]榮光,趙軍明,侯冠彧,等. 五指山豬肺炎克雷伯菌肺炎亞種的分離及鑒定[J]. 西北農業學報,2011,20(10):1-5.
[3]劉燕,趙京,張成林,等. 肺炎克雷伯氏菌致白頰長臂猿膿腫一例[J]. 野生動物,2011,32(3):156-157.
[4]李振江,孫長貴,曾賢銘,等. 肺炎克雷伯菌醫院感染監測及耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志,2007,17(6):737-739.
[5]翁幸鐾,糜祖煌. 多耐藥肺炎克雷伯菌獲得性耐藥基因及ompK36突變研究[J]. 中華醫院感染學雜志,2010,20(17):2545-2548.