金環胡蜂蟲草來源真菌的分離鑒定及其代謝產物的抗菌、抗炎活性評價

摘要：目的 探究金環胡蜂蟲草的蟲生真菌及內生真菌的多樣性，篩選出具有抗菌、抗炎活性的真菌，為活性天然藥物的開發提供微生物資源。方法 通過稀釋涂布法從金環胡蜂蟲草有性型蟲生真菌的子座和子實體、菌核組織以及蟲體三部分分離純化真菌。采用分子生物學方法對子座和子實體部位以及蟲生真菌、內生真菌進行ITS rDNA序列分析，并構建系統發育樹以確定種屬分類情況。以馬鈴薯葡萄糖培養基（potato dextrose agar， PDA）對所有真菌進行小規模培養。以6株病原細菌為指示菌，通過牛津杯瓊脂擴散法檢測真菌代謝產物粗提物的抗菌活性。并構建脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型，對粗提物進行抗炎活性篩選。結果 有性型的蟲生真菌與蜂頭線蟲草屬真菌Ophiocordyceps sphecocephala的同源性最高（gt;98%）。從子座、子實體和菌核組織分離獲得33株蟲生真菌，蟲體分離獲得21株內生真菌。這54株真菌經鑒定隸屬于2門，4綱，9目，11科，16屬。活性檢測結果顯示，10株真菌粗提物表現出對不同病原細菌的抑制作用，38株真菌粗提物具有不同程度的抗炎活性。結論 金環胡蜂蟲草具有豐富的蟲生真菌及內生真菌物種，其代謝產物具有抗菌、抗炎活性，這為后續活性先導化合物的發現提供了有價值的微生物資源。

關鍵詞：金環胡蜂蟲草；真菌；抗菌活性；抗炎活性；分子鑒定；系統發育樹

中圖分類號：Q965.9 文獻標志碼：A

Isolation and identification of fungi from Vespa mandarinia Smith Cordyceps sensu lato and evaluation of the antibacterial and anti-inflammatory activity

of their metabolites

Cui Guzhi， Wang Mingming， Yang Dasong， and Yang Yinhe

（Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical Ramp;D， College of Pharmacy， Dali University， Dali 671000）

Abstract Objective To investigate the diversity of entomogenous and endophytic fungi in Vespa mandarinia Smith Cordyceps sensu lato and the fungi with antibacterial and anti-inflammatory activity were screened out to provide microbial resources for the development of active natural drugs. Methods Fungi were isolated and purified from the stroma， fruiting body， and sclerotia tissue of teleomorph entomogenous fungi from Vespa mandarinia Cordyceps sensu lato， and the insect body using the dilution coating method. The ITS rDNA sequences of stroma， fruiting bodies， entomogenous fungi， and endophytic fungi were analyzed using molecular biological methods. Phylogenetic trees were constructed to determine the taxonomy of these species. All the fungi were cultured on potato dextrose agar medium on a small scale. The antibacterial activity of the crude extract of metabolites from the fungi were detected by an Oxford Cup agar diffusion assay with 6 pathogenic bacteria as an indicator strain. And the RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） were used as an inflammatory model to screen the anti-inflammatory activity of the crude extract of metabolites. Results The teleomorph entomogenous fungi had the highest homology with Ophiocordyceps sphecocephala （gt;98%）. 33 strains of entomogenous fungi were isolated from the stroma， fruiting body， and sclerotia tissues. Twenty-one strains of endophytic fungi were isolated from the insect body. The 54 strains of fungi were identified to belong to 2 phyla， 4 classes， 9 orders， 11 families， and 16 genera. The results of the activity test showed that the crude extracts of 10 strains of fungi had different inhibitory effects on pathogenic bacteria. 38 strains of fungal crude extracts exhibited varying degrees of anti-inflammatory activity. Conclusion Vespa mandarinia Smith Cordyceps sensu lato were rich in entomogenous and endophytic fungi. The metabolites of these associated fungi exhibited antibacterial and anti-inflammatory activity， offering valuable microbial resources for the discovery of active lead compounds.

Key words Vespa mandarinia Smith Cordyceps sensu lato; Fungi; Antibacterial activity; Anti-inflammatory activity; Molecular identification; Phylogenetic tree

天然產物由于具有廣泛的生物活性、新穎的分子骨架和獨特的作用機制，長期以來都是先導化合物發現的重要來源[1]。微生物憑借其物種和基因的多樣性以及次生代謝產物的結構新穎性、高活性、易于發酵調控等諸多優勢，而成為天然產物研究的熱點。趨同的環境和重復的研究使得來源于微生物的新天然藥物的發現率逐年降低[2]。在實驗室常規條件下，仍還有約99%的微生物難以培養，其中的活性物質還有待進一步研究開發[3]。因此，尋找新的特境微生物資源是進行先導化合物發掘的關鍵。

蟲草是寄生于無脊椎動物、少數真菌、黏菌和植物上的肉座菌目真菌，是廣義蟲草（Cordyceps sensu lato）的總稱[4]，其生境特殊，在一定的自然環境條件下才能生長形成。蟲草菌是一類十分重要的食用和藥用真菌資源，是蟲生真菌的一個重要類群，蟲生真菌寄生在昆蟲和其他節肢動物體內，可引起寄主的疾病或死亡。據報道全世界蟲草菌約1000種，我國目前報道的約100種[5]。在長期的進化過程中，昆蟲與微生物保持多樣性的內（共）生關系，這些微生物對宿主昆蟲具有重要的生存意義。研究者將昆蟲來源的蟲生真菌和內生真菌應用于藥學研究，發現蟲生真菌能產生結構豐富的次生代謝產物，具有抗菌[6]、抗炎[7]、抗癌[8]和免疫抑制[9]等多種活性。據綜述報道，近年來發現的昆蟲共生菌次生代謝產物中，75%的新化合物來源于真菌[10]。以上結果表明昆蟲相關真菌的次級代謝產物是先導性化合物的重要來源且具有生物活性，揭示了其作為新藥來源的可能性[11]。

胡蜂是胡蜂科胡蜂亞科胡蜂屬昆蟲，在我國已報道的胡蜂有17種，是全世界胡蜂屬種類最多，分布最廣的國家[12]。其中很多獨特的胡蜂種屬集中分布于云貴高原，是云南省的優勢資源。胡蜂作為一種傳統的民族藥物，其藥用價值在古今民族藥著上都有記載，如唐《新修本草》《本草綱目》《中國民族藥志要》和《傣藥》等，其中《中國藥典》2020年版一部記載：“胡蜂酒為景頗族驗方，可以祛風除濕，用于風濕閉阻所致的痹病，急性風濕病、風濕性關節炎”[13]。位于德宏州的景頗族傳統采用胡蜂及其蟲草泡制的酒來預防和治療類風濕性關節炎，暗示了胡蜂及其蟲草中含有能治療類風濕關節炎 （rheumatoid arthritis， RA）的有效成分。進一步實驗研究顯示，在膠原誘導的類風濕關節炎大鼠模型中，胡蜂提取物通過降低炎癥因子和類風濕因子的表達，調節和改善T細胞亞群比例的紊亂而對RA發揮治療作用[14]。金環胡蜂 （Vespa mandarinia Smith） 是胡蜂中體型最大，性情最兇猛的捕食性肉食昆蟲，俗稱“虎頭蜂”[15]，具有重要的營養價值和藥用價值。目前對金環胡蜂的研究主要集中于礦質元素[15]、無機金屬元素[16]、氨基酸的多樣性分析[17]、蜂毒成分[18-19]、蜂毒泡酒[20]、養殖技術[21]以及其蟲體的線粒體基因組[22]和轉錄組學[23]分析等方面。

云南具有種類豐富的胡蜂蟲草資源，鑒于目前尚未有金環胡蜂蟲草及其相關真菌，包括蟲生真菌和內生真菌在抗菌、抗炎作用方面的研究報道。本課題組于2021年從云南省德宏傣族景頗族自治州盈江縣采集獲得金環胡蜂蟲草，先對其進行形態學觀察，對有性型蟲生真菌子座以及分離純化獲得的54株蟲生真菌和內生真菌進行分子生物學鑒定以及系統發育分析，以6株病原細菌為指示菌，檢測真菌代謝物提取物的抗菌活性，篩選出具有抗菌活性的真菌，并進一步以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激小鼠巨噬細胞 RAW 264.7建立體外炎癥模型，檢測真菌代謝物粗提物的抗炎活性，篩選出具有抗炎活性的真菌。本研究有助于豐富對藥用昆蟲金環胡蜂蟲草相關真菌資源的認識，也為后續進一步開發利用金環胡蜂蟲草真菌資源中的藥用活性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲草、病原細菌與細胞

2021年8月，金環胡蜂蟲草樣本采集于云南省德宏傣族景頗族自治州盈江縣卡場鎮 （24.962992°N，97.85493°E）。

6株病原細菌包括：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus （ATCC25923）、大腸埃希菌Escherichia coli （ATCC25922）、糞腸球菌Enterococcus faecalis （ATCC47077）、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa （ATCC9027）、鼠傷寒沙門菌Salmonella typhimurium （BNCC103281）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methieillin-resistant Staphylococus aureus， MRSA）（ATCC43300）均由昆蟲生物醫藥研發重點實驗室菌種儲藏庫提供。

RAW 264.7小鼠巨噬細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

主要培養基包括真菌分離純化用培養基：馬鈴薯葡萄糖固體（potato dextrose agar，PDA）培養基；抗菌活性篩選培養基：PDA培養基、LB培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）、BHI培養基（北京陸橋技術股份有限公司）。細胞培養基：DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清，青霉素：100 U/mL-鏈霉素：0.1 mg/mL，武漢普諾賽生命科技有限公司） 。

藥品試劑包括陽性藥鹽酸萬古霉素（vancomycin hydrochloride）、氯霉素（chloramphenicol） （上海阿拉丁試劑有限公司）、地塞米松（dexamethasone， dex）（大連美侖生物技術有限公司），以及青鏈霉素混合液。

主要試劑包括乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸（天津市風船化學試劑科技有限公司），真菌基因組提取試劑盒及PCR相關試劑（天根生化科技有限公司），通用引物為上海元莘生物醫藥科技有限公司、北京六合華大基因科技有限公司合成。MTT（北京索萊寶科技有限公司），NO檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

主要設備包括徠卡體式顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），振蕩培養箱（上海旻泉儀器有限公司），生化培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司），電子天平（杭州萬特衡器有限公司），My Cycler PCR（美國BIO RAD），CYY-7C電泳儀電源（北京市六一儀器廠），水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），CO2培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司），倒置顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司），光吸收酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.3 金環胡蜂蟲草的形態學鑒定

對采集的金環胡蜂蟲草，先測定其有性型蟲生真菌子座和子實體的長度和直徑，以及寄主金環胡蜂的體長。再用體式顯微鏡觀察蟲生真菌的子座和子實體的形態特征，并觀察金環胡蜂的形態特征，進行記錄拍照。

1.4 有性型蟲生真菌的分子生物學鑒定

為了確定從金環胡蜂蟲體長出的有性型蟲生真菌的分類，選取3只金環胡蜂蟲草的6根子座和子實體為測序樣本，每只蟲草各有兩根子座、子實體。

采用硅基質吸附柱法從菌體樣本中抽提DNA，選擇ITS4和ITS5引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）對真菌的ITS片段進行擴增。PCR反應體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板（ng/μL）1 μL，超純水補足至50 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40個循環。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海元莘生物醫藥科技有限公司進行基因測序。

1.5 蟲生真菌和內生真菌的分離和純化

以金環胡蜂蟲草為研究對象，采用PDA培養基分離純化蟲生真菌和內生真菌。選取20只個體完整、形態良好的金環胡蜂蟲草。在無菌條件下用75%乙醇進行表面消毒后，解剖為子座和子實體、菌核和蟲體等3部分。各部分加無菌水研磨后稀釋成3個濃度，涂布于含青鏈霉素混合液的PDA培養基上進行真菌的培養，設空白對照組。28 ℃下培養觀察菌絲生長，挑選不同形態菌絲轉接至新平板繼續純化，多次傳代后獲得單一菌株，各菌株用40%甘油作為凍存液保存于-80 ℃，備用。

1.6 真菌的分子生物學鑒定及系統發育分析

采用分子生物學的方法對分離獲得的54株真菌進行鑒定。參照真菌DNA試劑盒提取真菌基因組DNA，并對其進行ITS rDNA基因擴增的檢測、測序和比對。使用真菌通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對真菌的ITS片段進行擴增。

PCR反應混合物（25 μL）中含有模板（100 ng/μL純化DNA樣品）2 μL，每種引物1 μL，CR Mix 21 μL。PCR條件為：96 ℃初始變性5 min，96 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃最后延長10 min。擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger一代測序。

將ITS序列與NCBI數據庫中的高同源序列進行比對，使用MEGA-7軟件基于Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹，并通過bootstrap值評估樹的可靠性。根據序列同源性和系統發育分析確定菌株分類，最終將各菌株的序列提交至GenBank獲取登錄號。

1.7 真菌的小規模培養及提取物制備

無菌條件下，將54株純化真菌接種至PDA培養基，每株各10個平板，28 ℃培養14 d。連同真菌與培養基切割成1 cm的小塊，使用乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸=80：15：5（V：V：V）的配比液依次浸泡3、2和1 d，過濾并濃縮提取代謝產物，用于后續抗菌和抗炎活性檢測。

1.8 真菌提取物的抗菌活性測試

采用牛津杯瓊脂擴散法[24]檢測不同真菌提取物的抗菌活性。用甲醇將粗提物、鹽酸萬古霉素和氯霉素的濃度分別調整為20 mg/mL、150 μg/mL和150 μg/mL。在LB液體培養基中接種MRSA、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鼠傷寒沙門菌和銅綠假單胞菌，在BHI液體培養基中接種糞腸球菌，振蕩培養4 h （37 ℃， 180 r/min），使用麥氏比濁管調整病原細菌濃度為（3～5）×106 CFU/mL。取100 μL菌懸液用三角涂布棒均勻涂布在LB和BHI瓊脂培養基上，用無菌鑷子輕輕將牛津杯 （直徑8 mm） 放在平板上。分別取100 μL各菌株提取物、抗生素及陰性對照甲醇加入各牛津杯。將平板放置于4 ℃冰箱中4 h，讓牛津杯內所有液體滲透到培養基里。再于37 ℃下培養12 h。觀察并記錄抑菌圈直徑，每組進行3次平行實驗，結果以（x±s）表示。

1.9 真菌提取物的體外抗炎活性測試

1.9.1 RAW 264.7細胞的培養

采用DMEM高糖培養基（10%胎牛血清，1%的青鏈霉素混合液）培養RAW 264.7細胞，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，將從培養箱取出的培養皿放于無菌臺面上，吸棄培養皿中原有的培養液，加入2 mL PBS清洗2次，已去除細胞碎片和未貼壁的細胞。為了使貼壁較強的RAW 264.7細胞洗脫下來進行傳代培養，參考文獻[25]，實驗加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液消化1 min 30 s，然后迅速加入2 mL完全培養基進行終止消化，鏡下看到細胞變圓、間隙增大后，輕輕將細胞吹落，收集細胞懸液，將細胞懸液轉移至無菌離心管中，轉速為1200 r/min離心4 min。離心結束后，棄去胰酶和培養基，加入2 mL新鮮培養基輕輕混勻，便于后續實驗操作。

1.9.2 細胞存活率測定

以MTT法篩選真菌提取物對RAW 264.7細胞無生長抑制作用的濃度[26]。選取對數生長期的RAW 264.7細胞，用胰酶消化后制成1×105 個/mL的細胞懸液接種于96孔板中，設置空白組、正常組及給藥組。給藥組和正常組每孔接種100 μL細胞懸液，空白組僅加入等體積的培養基，培養24 h。給藥組加入100 μL的代謝提取物（終濃度設置1、10和100 μg/mL），正常組和空白組加入等體積的培養基，每組3個復孔，進行3次平行實驗對照。培養24 h后，每孔加入20 μL"5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h。吸去孔板中溶液，每孔加入150 μL DMSO溶解藍紫色的甲瓚結晶。振蕩搖勻，490 nm處測定各孔的光密度值（A值），計算細胞存活率，計算公式如下：

1.9.3 抗炎活性測定

將RAW 264.7細胞以1×105個/孔接種于96孔板孵育24 h后，設定正常組（正常生長的RAW 264.7細胞）、炎癥模型組（含1 μg/mL的LPS）、地塞米松組（200 ng/mL Dex與1 μg/mL LPS共同處理）、給藥組（1 μg/mL真菌提取物與1 μg/mL LPS共同處理）。繼續培養24 h后取細胞上清液，按照一氧化氮試劑盒說明書進行操作，560 nm處測定A值，繪制標準曲線，并計算各孔中NO含量。

1.9.4 數據分析

采用GraphPad Prism 9.0繪圖，用SPSS 27.0軟件進行統計學分析，實驗結果以（x±s）表示，組間數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Plt;0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 金環胡蜂蟲草的形態學特征

蟲生真菌的子座和子實體從成年胡蜂的頭部、胸部或尾部生長出來，它可以是單生的或叢生的，不分枝，棍棒狀（圖1C），頂部有一個圓形或鈍的頭部。長度從3～6 cm不等，直徑從0.1～0.2 cm （圖1B）。新鮮時為黃褐色，干燥后為棕色。寄主為金環胡蜂成蟲，體長3.0～4.0 cm（圖1A）。觀察成年金環胡蜂，其體大型，黃色，斑紋黑色；頭部：橫寬、光滑、發亮、毛稀，除復眼、上頓端齒為黑色外，其余均呈棕黃色；胸部：前胸背板前緣中央隆起，兩肩角明顯；腹部：光滑、發亮，胸、腹部均具稀淺刻點和棕色短毛，根據以上形態特征[27]，鑒定蟲體為金環胡蜂（Vespa mandarinia Smith）。

2.2 有性型蟲生真菌分子生物學的鑒定結果

通過對金環胡蜂主要蟲生真菌的6個子座、子實體部位進行ITS rDNA測序，將獲得的ITS rDNA基因片段與NCBI數據庫中的序列進行BLAST比對。結果表明，這些基因序列與蜂頭線蟲草屬真菌Ophiocordyceps sphecocephala的基因序列具有最高的相似性（gt;98%）。由此可見，蟲生真菌與O. sphecocephala的親緣關系最近。根據獲得的ITS rDNA基因片段序列和具有較高相似性的其他物種的基因序列，基于鄰接法構建了ITS單基因的系統樹（圖2）。由圖2可見，蟲生真菌和O. sphemocephala在同一分支上，表明它們的遺傳學距離是最接近的。將ITS rDNA序列提交至GenBank，獲得的登錄號分別為：PP001797～PP001802。

2.3 蟲生真菌和內生真菌的分離和純化結果

結合稀釋涂布法，從金環胡蜂蟲草蟲生真菌的子座和子實體、菌核組織以及蟲體成功分離純化出54株真菌。其中，從金環胡蜂蟲體內分離到21株（38.89%）真菌，編號為：VMF2、VMF4-VMF8、VMF10-VMF17、VMF19、VMF21-VMF26；從子座和子實體部位分離到24株（44.44%）真菌，編號為：VMFST1-VMFST3、VMFST5-VMFST19、VMFST22-VMFST27；從菌核組織分離到9株 （16.67%）真菌，編號為：VMFSC1-VMFSC9。結果表明，金環胡蜂蟲草中含有豐富的蟲生真菌和內生真菌資源。部分真菌在PDA固體培養基上的生長形態如圖3所示。

2.4 真菌分子生物學鑒定及系統發育分析結果

將54株真菌的ITS rDNA基因序列與NCBI數據庫中的序列進行BLAST比對，選擇代表性的16屬34種，基于鄰接法構建的系統發育樹（圖4）表明，這54株真菌隸屬于：2門（子囊菌門Basidiomycota和擔子菌門Ascomycota），4綱（散囊菌綱Eurotiomycetes， 糞殼菌綱Sordariomycetes， 座囊菌綱Dothideomycetes， 傘菌綱Agaricomycetes），9目（散囊菌目Eurotiales， 肉座菌目Hypocreales， 炭角菌目Xylariales， 糞殼菌目Sordariales， 錐毛殼目Coniochaetales， 間座殼菌目Diaporthales， 枝孢菌目Cladosporiales， 多孔菌目Polyporales， 銹革孔菌目Hymenochaetales），11科，16屬。據文獻[28]報道，Resinicium屬在科的分類位置尚未完全明確。在屬水平上，青霉屬為優勢菌屬，占50.0%，其次是曲霉屬（11.1%）、籃狀菌屬（7.4%） 和木霉屬（7.4%）（表1）。因此，從金環胡蜂蟲草分離的內生真菌和蟲生真菌具有豐富的微生物類群。54株真菌的ITS rDNA序列提交至NCBI數據庫，登錄號為：OQ784276-OQ784296，OQ792123-OQ792145，OQ863604，OQ784161-OQ784169。

2.5 抗菌活性測試結果

對54株真菌的發酵提取物進行抗菌活性測試，結果如表2所示，有10株真菌的代謝提取物具有不同程度的抑菌活性，編號分別為VMF13、VMF17、VMF22、VMF24、VMF25、VMFST18、VMFST19、VMFST24、VMFSC2和VMFSC3。其中對部分細菌抑菌活性較強（抑菌圈直徑≥15 mm） 的有6株，分別為VMF17、VMF22、VMF24、VMF25、VMFST19和VMFST24。有3株真菌VMF17、VMF22和VMF25的代謝粗提物對4種及以上不同的病原細菌具有廣譜抗菌活性，而真菌VMF24和VMFST18的代謝提取物對3種不同的病原細菌具有廣譜抗菌活性。值得注意的是，有10株真菌的代謝物都表現出不同程度的抗MRSA活性，其中VMF22和VMF24的代謝產物抗MRSA活性最強，抑菌圈直徑均大于20 mm。結果表明，金環胡蜂蟲草相關真菌具有一定的抗菌活性，尤其具有顯著的抗MRSA活性，為后續深入研究真菌代謝產物中的抗菌活性成分提供了重要的微生物資源。

2.6 體外抗炎活性測試結果

采用MTT法檢測樣品對RAW 264.7細胞存活率的影響，進而確定抗炎實驗的樣品濃度水平。結果如圖5所示，給藥濃度為10和100 μg/mL時，RAW 264.7細胞存活率顯著低于正常組且具有統計學差異 （Plt;0.05），表明這兩個給藥濃度對RAW 264.7細胞生長有抑制作用；在給藥濃度為1 μg/mL時，給藥組細胞存活率與正常組相比沒有顯著差異，提示該濃度對RAW 264.7細胞生長沒有抑制作用。因此，后續采用1 μg/mL的給藥濃度開展抗炎實驗。

以LPS誘導RAW 264.7細胞建立炎癥模型，本研究對54株金環胡蜂蟲草相關真菌提取物的抗炎活性進行篩選。結果如圖6所示，與正常組相比，模型組的NO含量顯著上升，具有統計學差異（Plt;0.001），表明LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型構建成功。54株真菌中有38株真菌對RAW 264.7細胞產生NO表現出不同程度的抑制作用，其中15株真菌代謝粗提物對RAW 264.7細胞產生NO的抑制作用最強，表現出顯著的抗炎活性，其編號分別為VMF6、VMF7、VMFSC4、VMFSC5、VMFSC6、VMFST7、VMFST9、VMFST12、VMFST14、VMFST15、VMFST16 、VMFST17、VMFST24、VMFST25、VMFST26；23株真菌代謝粗提物則表現出較強的抗炎活性；剩余的16株真菌不顯示抗炎活性。

3 討論

微生物是新型活性天然產物發現的重要來源。來源于冬蟲夏草和蛹蟲草里的活性成分蟲草素，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和調節免疫等多種生物活性[29]。進一步的研究表明，蟲草素具有抑制NO生成，發揮抗炎作用[30]。也有學者從蟬蟲草子實體樣品的乙酸乙酯提取物分離純化獲得抗菌活性化合物[31]。還有研究報道了從1株阿爾泰蟲草中分離到對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用的青霉屬內生菌[32]。以上研究表明蟲草來源相關真菌中具有挖掘抗菌和抗炎等多種活性成分的潛力。

本研究對金環胡蜂蟲草的蟲生真菌和內生真菌進行分離培養，獲得54株形態有差異的真菌，這些真菌共歸屬為2門，4綱，9目，11科，16屬（表1），說明該特色生境中可培養的真菌資源比較豐富。但由于在人工條件下培養，真菌營養環境較為單一，難以模擬金環胡蜂蟲草所處的自然生態環境，仍有真菌未被分離培養，有的真菌經培養凍存后，未能成功復活。利用分子生物學方法對有性型蟲生真菌的子座、子實體進行了鑒定，經BLAST比對，鑒定其為蜂頭線蟲草屬真菌。從實際分離獲得的真菌來看，研究沒有鑒定出蜂頭線蟲草屬真菌的無性型。并不是所有的真菌都適合在人工培養條件下生長，不同的營養、溫度和光照條件會影響真菌的出現率。如何獲得蟲草菌的無性形態，以及該菌株能否人經工培養轉化為具有子座和子實體的有性形態，值得今后深入研究。后續可以采用不同的分離培養基和培養條件，以期獲得更多的金環胡蜂蟲草相關真菌資源。自然界中，已有研究報道來源于蟲草的蟲生真菌具有多菌定殖的現象，如野生蟬花（蟬蟲草）和新古尼異蟲草的子座也存在多菌定殖[33-34]。該研究從金環胡蜂蟲草的子座、子實體部位共分離獲得24株真菌，表明其蟲生真菌也存在多菌定殖，這些真菌占比達到約44%，顯示出了蟲生真菌的物種多樣性。

本研究對金環胡蜂蟲草相關真菌進行分離純化，獲得形態有差異的真菌54株，對真菌代謝產物粗提物進行抗菌活性篩選，結果顯示有10株真菌的粗提物對病原細菌具有不同抑制作用，其中真菌VMF17、VMF22、VMF25粗提物對4株及以上病原細菌具有不同程度的抑菌活性，VMF22粗提物還具有顯著的MRSA抑制作用（表2）。VMF22經鑒定為擴展青霉屬Penicillium expansum真菌，有文獻報道[35]擴展青霉主要代謝產物有擴展青霉素、球毛殼菌素、吲哚生物和聚酮等，具有較好的抑菌作用。本研究獲得的這些抗菌活性真菌，為后續尋找新型抗菌天然產物提供了有價值的菌種資源。

炎癥反應是機體應對有害刺激的一種防御性反應，但過度和持續性炎癥反應嚴重影響機體的健康，炎癥因子的過度釋放可對機體造成嚴重損傷[36]。在炎癥反應中，NO是重要的炎性介質之一，參與和介導炎性反應，過量的產生NO會加重炎癥反應對機體的損傷。研究認為NO是體內重要的細胞因子，在炎癥反應中能夠介導產生炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1等，具有細胞毒作用加劇炎癥反應[37-38]，因此，抑制NO的產生能夠抑制炎癥反應，減少炎癥對機體的損傷，是抗炎的主要途徑之一。實驗通過LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW 264.7建立體外炎癥模型，檢測54株真菌代謝物粗提物對細胞中NO的抑制作用，結果顯示54株真菌中有38株真菌的代謝產物粗提物對RAW 264.7細胞表現出不同程度的NO抑制作用。其中兩株具有顯著抗炎活性的真菌VMFST24和VMFST26經鑒定均為青霉屬真菌，已有研究顯示青霉屬真菌可產生具有抗炎活性的次級代謝產物[39-40]。暗示著本研究發現的具有顯著抗炎活性的15株真菌，蘊藏著挖掘抗炎活性分子的潛力。

4 結論

本研究從金環胡蜂蟲草分離獲得54株真菌，經鑒定隸屬于2門，4綱，9目，11科，16屬。其中抗菌活性菌有10株，抗炎活性菌有38株。結果揭示了金環胡蜂蟲草含有豐富的真菌資源，這些相關的蟲生真菌和內生真菌具有產生抗菌、抗炎活性代謝產物的巨大潛能。該研究為后續進一步挖掘這些真菌中的活性次級代謝產物及其作用機制提供了菌種資源，也為蟲草來源真菌天然藥物的研發提供了新的思路。

參 考 文 獻

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