雙花愈瘍方漱口液治療大腸癌化療相關口腔黏膜炎的機制研究

Study on the mechanism of Shuanghua Yuyang formula mouthwash in the treatment of chemotherapy?related oral mucositis of colorectal cancer

CHENG Jie， LIU Likun^*， YAO Xiaoli， GUO Tingting， HAO Shulan， WANG Xinwen， ZHANG Fupeng， ZHANG Qiang， LI Xinyu

Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine， Shanxi 030012 China

*Corresponding Author "LIU Likun，"E?mail："llkun133@126.com

Keywords""colorectal cancer；"Shuanghua Yuyang formula；"chemotherapy；"oral mucositis

摘要""目的：探究雙花愈瘍方對SD大鼠口腔黏膜炎愈合及血清、潰瘍組織腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細胞介素?6（IL?6）、白細胞介素?1β（IL?1β）表達的影響。方法：選取50只SD大鼠，隨機分為空白組、對照組及雙花愈瘍方3.375 g/kg（低劑量）組、6.750 g/kg（中劑量）組、13.500 g/kg（高劑量）組，每組10只。除空白組外，其余大鼠于實驗開始第1天和第3天接受腹腔注射5?氟尿嘧啶（60 mg/kg），然后用七氟烷麻醉SD大鼠，將浸透冰醋酸的棉球平放在大鼠右側頰膜上燒灼60 s，建立口腔潰瘍動物模型。各組在潰瘍治療前及治療后每天測量各組大鼠潰瘍面積。治療后7 d切取大鼠潰瘍組織，蘇木精?伊紅染色法（HE）染色觀察組織病理學變化，酶聯免疫吸附法檢測潰瘍組織和血清中TNF?α、IL?6和IL?1β的表達。結果：低劑量、中劑量、高劑量組均能降低SD大鼠血清和組織中炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6的水平（Plt;0.05），其中高劑量組效果更顯著。病理檢查顯示，各治療組潰瘍組織病變均有明顯減輕。結論：雙花愈瘍方具有較強的抑制炎癥反應的作用，可有效治療化療相關口腔黏膜炎。

關鍵詞""大腸癌；雙花愈瘍方；化療；口腔黏膜炎

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.20.023

化療相關性口腔黏膜炎是癌癥病人在接受化療過程中常見的嚴重并發癥之一，主要表現為口腔黏膜部位的紅腫和潰瘍^[1]，發生率為24.8%～67.0%^[2]，尤其以含5?氟尿嘧啶的化療，其發生率為50%以上^[3]，甚至發展成重度黏膜炎^[4]。其所導致的疼痛、味覺障礙、消化不良、無法進食等嚴重影響著腫瘤病人的生活質量和治療效果，還可能增加病人全身感染的概率，影響原發病治療進程，延長病人住院時間，為病人帶來更大經濟負擔。我國的口腔護理液種類繁多，護理指導不規范，研究水平總體相對不高^[5]。有效的防治手段常局限于特定的目標人群，不能廣泛推廣應用^[6]。本課題組前期研究發現，中藥雙花飲漱口液療效佳、病人舒適度高，能降低病人口腔黏膜炎的發生率、減輕病變程度、縮短愈合時間^[7]。為了進一步探討其作用機制，明確雙花愈瘍方的使用時機和使用頻次，以最佳證據給予有效的口腔護理指導、提高護理質量，為臨床護理提供新思路和新策略。本實驗通過建立SD大鼠口腔黏膜炎模型，將低中高劑量的雙花愈瘍方濃縮液均勻涂抹在潰瘍面上，從組織、分子層面進行分析，以期為臨床提供依據。本研究經山西省中醫藥研究院倫理委員會審批通過。

1 "材料與方法

1.1 主要藥物

雙花愈瘍方由山西省中醫藥研究院提供，主要由金銀花、蒲公英、淡竹葉、冰片、薄荷組成，先將金銀花、蒲公英、淡竹葉這3種藥材用蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火煎30 min，起鍋前5 min加入薄荷。將冰片研成細末，加入熬制好的中藥液中不斷攪拌使其溶解。用紗布過濾每次煎煮的藥液，將3次煎煮所得藥液濃縮至每毫升2 g 生藥，分裝后儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子α（TNF?α）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒，睿信生物RX302058R。大鼠白細胞介素?6（IL?6）ELISA試劑盒，睿信生物RX302856R。大鼠白細胞介素?1β（IL?1β）ELISA試劑盒，睿信生物RX302869R。氟尿嘧啶注射液，天津金耀藥業有限公司提供，H12020959。吸入用七氟烷，上海恒瑞醫藥有限公司提供，19122737。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）由賽文創新（北京）生物科技有限公司提供；甲醛固定液由山西省中醫藥研究院臨床藥理重點實驗室（實驗動物室）提供；二甲苯、蒸餾水、中性樹膠、蛋白甘油、無水乙醇、蘇木素等由耳鼻喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室提供。SD大鼠實驗動物生產許可證號：SCXK（晉）2019?0004，動物使用許可證號：SYXK（晉）2019?0007。

1.3 主要儀器

包括離心機（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司TD24?WS）、自動組織脫水機[櫻花醫療科技（泰州）有限公司VP1?JC]、組織包埋機（山西奧瑞鑫生物科技有限公司YD?6L）、生物組織石蠟切片機[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司]、攤片烤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司KD?H）。

1.4 實驗過程

1.4.1 大鼠分組

SD大鼠50只，隨機分為空白組、對照組（生理鹽水）及雙花愈瘍方3.375 g/kg組（低劑量）、6.750 g/kg組（中劑量）、13.500 g/kg（高劑量）組，每組10只。

1.4.2 造模和用藥

SD大鼠適應性飼養1周，正常飲食。除空白組外，各實驗組SD大鼠均在實驗開始第1天和第3天接受腹腔注射5?氟尿嘧啶（60 mg/kg）。然后吸入七氟烷麻醉SD大鼠，將棉球置于1 mL注射器前端，內徑約5 mm，底部與管口平齊，滴加50%的冰醋酸剛好可以浸透棉球，將注射器棉球平放在大鼠右側頰膜上燒灼60 s，建立口腔潰瘍動物模型，盡量使每只大鼠的創面大小及深度保持一致。黏膜損傷后48 h出現潰瘍，開始用藥。空白組常規喂養；對照組給予等量生理鹽水均勻涂在潰瘍面上；低劑量給藥組給予3.375 g/kg雙花愈瘍方濃縮液，每日1次，均勻涂在潰瘍面上，保證藥物在口腔內停留3 min；中劑量給藥組給予6.750 g/kg雙花愈瘍方濃縮液，每日1次，均勻涂在潰瘍面上，保證藥物在口腔內停留3 min；高劑量給藥組給予13.500 g/kg雙花愈瘍方濃縮液，每日1次，均勻涂在潰瘍面上，保證藥物在口腔內停留3 min。采用口腔潰瘍動物模型主要表現指標及分級表評價大鼠口腔潰瘍情況。

1.5 處理方法

1.5.1 病理切片的制作

用七氟烷麻醉大鼠后，手術刀切取各組大鼠的口腔黏膜組織，切取組織時刀剪要鋒利，切割時不能來回挫動，夾取組織時切勿擠壓組織塊。所取組織的體積為"0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，用PBS液將組織塊上的血液沖洗干凈后放入固定液中，將組織展平以盡可能維持原形。將標本放置在甲醛溶液里，浸泡至少24 h后進行脫水透明、浸蠟、包埋、切片。

1.5.2 蘇木精?伊紅（HE）染色

1）石蠟切片冷卻后先后放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟；2）依次在100%、95%、80%、70%乙醇中由高到低水化；3）蘇木精染色40 s，自來水清洗3～5次；4）用1%鹽酸乙醇分化，自來水清洗3～5次；5）伊紅染色40 s，自來水清洗3～5次；6）依次在70%、80%、95%、100%不同濃度乙醇中逐步脫水；7）在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明5 min；8）中性樹膠封片。

1.6 組織病理學觀察

取制備好的病理切片在顯微鏡下觀察組織變化。

1.7 大鼠心臟取血

以七氟烷麻醉大鼠后仰臥于平板，固定四肢，腹部以碘酊消毒后打開腹腔。用鑷子將腹腔臟器向左翻轉，輕輕撥開下方的脂肪，打開胸腔，找到心臟。然后用5 mL注射器穿刺，抽吸到血液后將針頭插入真空管內。采血完畢后，室溫靜置2 h后離心，取上清液，放入1.5 mL的離心管中，-4 ℃保存。

1.8 評價指標

1）各組大鼠攝食量變化：用藥前、用藥后1～7 d，每天早上用小型高精度電子稱稱每只大鼠的體重。2）大鼠潰瘍面積觀察：造模成功后、用藥后1～7 d，相機拍照記錄，觀察大鼠口腔潰瘍面積變化。3）潰瘍面積比較：造模成功后、用藥后1～7 d，使用游標卡尺測量潰瘍的最大橫徑、最大縱徑，計算潰瘍面積。4）血清炎癥因子水平：用藥后7 d，麻醉大鼠，采取心臟血液標本，測定血清炎癥因子水平。5）組織炎癥因子水平：用藥后7 d，麻醉大鼠，切取口腔黏膜組織，處理并測定組織炎癥因子水平。6）口腔潰瘍評分比較：造模成功后、用藥后1～7 d，每天早晨觀察大鼠黏膜變化，采用口腔潰瘍動物模型主要表現指標及分級表評價潰瘍得分。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示。檢驗方法采用單因素方差分析（One?way AVONA），組間比較用LSD?t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 各組大鼠攝食量變化

第1天～第3天，各組大鼠攝食量比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）。第4天開始，各組大鼠攝食量的變化出現差異，各用藥組比對照組口腔愈合效果更為顯著，其中高劑量組效果更好。見表1。

2.2 大鼠潰瘍面大體觀察

拍照記錄大鼠造模成功后的潰瘍面情況，對大鼠口腔潰瘍表面進行連續觀察，連續給藥7 d，結果顯示，空白組口腔黏膜完整、光滑，無明顯損傷。各實驗組潰瘍面積隨時間的延長均有縮小。

2.3 各組大鼠潰瘍面積比較

使用游標卡尺測量潰瘍的最大橫徑（d1）和最大縱徑（d2），計算潰瘍面積=π×d1×d2×1/4。第1天、第3天，各組大鼠潰瘍面積比較差異無統計學意義（Pgt;0.05）。第5天開始，給藥組較對照組潰瘍面積明顯縮小（Plt;0.05），其中高劑量組愈合速度最快。見表2。

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（見表3）

2.5 各組大鼠口腔潰瘍局部組織中炎癥因子水平比較（見表4）

2.6 各組大鼠口腔潰瘍評分比較（見表5）

2.7 大鼠主要癥狀體征觀察

正常空白組大鼠，活動正常，食欲良好，二便正常，背毛光澤，反應靈活。各潰瘍組大鼠治療7 d后，口腔潰瘍仍未愈合，低劑量組仍然出現黃白色假膜，飲水與體重稍顯增加；中劑量組口腔潰瘍顏色較正常黏膜偏紅，毛色較前光亮；高劑量組毛色基本恢復正常狀態，精神狀態明顯好轉。

2.8 潰瘍組織病理學觀察

光鏡下觀察可見空白組大鼠口腔黏膜結構完整，各層細胞輪廓清晰，形態正常，上皮下固有層為疏松結締組織，富含毛細血管，無明顯炎性細胞浸潤。對照組大鼠口腔黏膜上皮層細胞溶解壞死并發生脫落，黏膜固有層下還有密集的炎癥細胞浸潤。雙花愈瘍方高劑量組黏膜上皮組織趨于完整，有少量壞死組織，炎性細胞浸潤減少，上皮層下見大量成纖維細胞增生。低劑量組炎性細胞浸潤也有改善，但結締組織仍有大量炎癥細胞浸潤，中劑量組可見少量壞死組織及炎癥細胞浸潤，但沒有高劑量組減少明顯。

3 "討論

化療相關性口腔黏膜炎發病機制包括一系列生物學信號的傳導，尚未完全明確^[8]。Sonis等^[9]認為，主要原因是化療后口腔黏膜上皮細胞的生長遭到藥物毒性破壞，機體免疫功能下降，繼而發生炎癥、潰瘍。Hong等^[10]研究認為，化療引起的口腔黏膜炎與細菌菌群失調有關，菌群失調會加重化療所導致的口腔上皮組織的損傷，口腔黏膜炎的嚴重程度與5?氟尿嘧啶、唾液量增加和口腔粒細胞計數升高有關。隨著研究的不斷深入，人們對其發病機制的理解也不斷加深。在口腔黏膜炎期間，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號的激活可能在口腔微生物和上皮細胞之間的相互作用中起重要作用。在動物模型中，MAPK信號也被證明對腸黏膜炎有重要影響^[11]。因這些組織由胚胎的內胚層發育而來，Keefe等^[12]提出，口腔黏膜炎和腸道黏膜炎是由類似的機制引起的，這表明MAPK信號的激活也可能在口腔黏膜炎中起到關鍵作用。而一些對口腔黏膜有間接毒性的促炎因子也可促進口腔黏膜炎的發生，如TNF?α、IL?1β、IL?6^[13]。TNF?α和IL?6其含量高低與病情輕重密切相關，即潰瘍數目越多，潰瘍面積越大，TNF?α和IL?6含量越高^[14?15]。同時，TNF?α可誘導包括其自身在內的多種細胞因子的分泌，如IL?6、IL?1β等，進一步加重炎癥反應，損傷組織，不利于創面愈合^[16]。本研究結果顯示，雙花愈瘍方通過抑制血清中炎癥因子TNF?α、IL?6、IL?1β的釋放，進而調控炎癥反應，參與口腔黏膜組織修復。代良敏等^[17]將康復新液用于治療創傷性口腔黏膜炎大鼠模型的實驗，結果顯示，康復新液能夠降低大鼠潰瘍組織中TNF?α、IL?6和IL?1β的水平。吳子湘等^[18]將自制漱口水用于創傷性口腔潰瘍大鼠模型，能夠明顯降低大鼠血清炎癥因子TNF?a和IL?6的含量，與本研究結果相似。

口腔潰瘍是上皮的完整性發生破壞而引起的組織缺損，臨床上分為發作期、愈合期、間歇期且具有自限性^[19]。化療性口腔黏膜炎為化療開始后4～5 d口腔出現紅斑，7～10 d后潰瘍開始發展，在數量和規模上逐漸生長，然后合并，形成大型潰爛區^[20?21]，化療暫停后大約需2周的時間愈合^[22]。中醫藥作為一種治療手段，在腫瘤多學科綜合治療中的獨特優勢日益受到重視，許多基礎研究均表明具有抗炎功效的中藥或中成藥能夠抑制細胞凋亡，應用范圍廣泛。呂品等^[23]利用網絡藥理學和體外試驗研究發現，金銀花提取物能夠抑制IL?1β、IL?6的表達，發揮抗炎作用。毛葉勤等^[24]將蒲公英水提取物作用于結腸炎大鼠模型，發現其能夠抑制促炎細胞因子IL?2、IL?8、IL?17、TNF?α水平，減輕機體炎癥反應，提高促修復因子表達，促進黏膜愈合。郭妍^[25]在淡竹葉抗炎作用的研究中發現，淡竹葉水取物組、醇提物組具有明顯的抗二甲苯所致小鼠耳腫脹的作用，其藥效可與陽性藥地塞米松相比；在對淡竹葉鎮痛作用的研究中，將小鼠置于熱板上，以小鼠出現舔后足所需時間作為痛閾值，發現淡竹葉水提物組能明顯提高小鼠對疼痛的反應時間，說明淡竹葉具有抗炎、鎮痛作用。余煊等^[26]將薄荷的主要成分薄荷醇注入小鼠尾靜脈，發現其可以抑制核轉錄因子（NF?κB）和炎癥因子TNF?α的表達，發揮抗炎抑菌的作用。雙花愈瘍方是由金銀花、蒲公英、淡竹葉、薄荷等成分水煎而成。多味中藥聯合應用，具有扶正祛邪、標本兼治的作用，共同發揮清熱"解毒、抗菌消炎、鎮痛散腫、斂瘡生肌之功，從而達到促進創面愈合的治療作用。本研究結果顯示，用藥第7天大鼠口腔潰瘍顏色較正常黏膜偏紅，毛色較前光亮，飲食量、體重接近正常，精神狀態明顯好轉，說明潰瘍可能已經愈合。吳子湘等^[18]將自制漱口水用于治療創傷型口腔潰瘍SD大鼠模型，發現7 d后口腔潰瘍面積顯著縮小，雖未完全達到建模前水平但無明顯假膜，接近愈合，大鼠提前恢復正常生活，與本研究結論一致。

4 "小結

研究雙花愈瘍方在SD大鼠中的作用有利于臨床護理人員對化療相關性口腔黏膜炎病人的護理和指導，其作用機制主要與降低炎癥因子TNF?α、IL?6、IL?1β的表達、緩解黏膜細胞的病理改變有關。此外，使用雙花愈瘍方的大鼠均未出現相關的毒副反應，說明雙花愈瘍方不僅療效確切，而且安全可靠，經濟實用。

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（收稿日期：2023-11-25；修回日期：2024-08-03）

（本文編輯"蘇琳）