SRD5A2對兔顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和類固醇激素合成相關(guān)基因表達的影響

摘 要： 旨在探討類固醇5α還原酶 2（steroid 5 alpha reductase" SRD5A2）對新西蘭母兔卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）的增殖、凋亡以及合成類固醇激素基因表達的影響。本研究選取健康的4～6月齡性成熟的雌性新西蘭白兔，分離兔卵巢GCs，利用FSHR進行鑒定，進行SRD5A2基因的過表達和干擾，利用CCK-8、流式細(xì)胞技術(shù)和qRT-PCR方法檢測GCs增殖、凋亡和類固醇激素合成相關(guān)基因表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔 SRD5A2基因CDS全長為765 bp，編碼252個氨基酸。在GCs中過表達/敲低SRD5A2后，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HIF1A的表達水平極顯著降低/升高，INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達水平極顯著升高/降低（P＜0.01）。進一步，過表達/敲低SRD5A2后顯著促進/抑制GCs增殖，并抑制/促進凋亡（P＜0.05）。結(jié)果表明，SRD5A2基因影響了合成類固醇激素基因的表達和顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，并參與新西蘭兔卵泡發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞： SRD5A2；顆粒細(xì)胞；卵巢；增殖；凋亡

中圖分類號：S829.1"""" 文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0259-10

Effect of SRD5A2 on the Expression of Genes Related to Proliferation， Apoptosis

and Steroid Hormone Synthesis in Rabbit Granulosa Cells

WANG" Lei BAI" Shaocheng WANG" Sen BAO" Zhiyuan CAI" Jiawei LIU" Yan2，"" ZHAO Bohao WU" Xinsheng CHEN" Yang^1*

（1.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China;

2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 31002" China）

Abstract： "The purpose of this study was to investigate the effects of steroid 5 alpha reductase 2 （SRD5A2） on proliferation， apoptosis of granulosa cells， and the expression of genes related to steroid hormone synthesis in granulosa cells （GCs） of New Zealand White female rabbits. Healthy sexually mature female New Zealand White rabbits aged 4 to 6 months were selected. GCs were isolated from the rabbit ovaries and identified using follicle-stimulating hormone receptor （FSHR）. Overexpression and knockdown of the SRD5A2 gene were performed. The proliferation， apoptosis of GCs， and the expression of genes related to steroid hormone synthesis were detected using CCK-8， flow cytometry， and quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） methods. The full-length coding sequence （CDS） of the rabbit SRD5A2 gene was 765 bp， encoding 252 amino acids. After overexpressing/knocking down SRD5A2 in GCs， qRT-PCR analysis revealed that the expression level of HIF1A was extremely significantly decreased/increased， while the expression levels of INHBB， HSD17B GDF9， and BMP15 were extremely significantly increased/decreased （Plt;0.01）. Furthermore， overexpressing/knocking down SRD5A2 significantly promoted/inhibited GCs proliferation and inhibited/promoted apoptosis （Plt;0.05）. These findings indicate that the SRD5A2 gene affects the expression of genes related to steroid hormone synthesis， as well as the proliferation and apoptosis of GCs， and is involved in the follicular development process in New Zealand White rabbits.

Key words： SRD5A2; granulosa cells; ovary; proliferation; apoptosis

*Corresponding author：CHEN Yang， E-mail： yangc@yzu.edu.cn

雌性的生育潛力主要由卵巢卵泡的發(fā)育和生長決定。相較于生殖潛力較低的動物，生殖潛力較高的動物卵巢中通常展現(xiàn)出更成熟的卵泡和更高的排卵率^［1］。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）被認(rèn)為是女性生殖系統(tǒng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，參與卵泡的正常生長以及雌激素的產(chǎn)生，是影響母畜生育能力的重要因素之一^［2-3］。GCs促進卵泡生成并維持卵巢內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性^［4-5］，其功能活動異常可能會對繁殖效率產(chǎn)生重大影響^［6］。研究發(fā)現(xiàn)山羊卵巢GCs發(fā)生增殖或凋亡現(xiàn)象會顯著影響卵泡的發(fā)育過程^［7］。SMAD7基因可抑制山羊卵巢GCs的增殖，促進其凋亡，從而影響卵泡發(fā)育^［8］。

類固醇5α還原酶（steroid 5 alpha reductase，SRD5A）位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要作用是將睪酮轉(zhuǎn)化為具有更強生物活性的二氫睪酮^［9］。SRD5A存在兩種同工酶，即SRD5A1和SRD5A2^［10-11］。類固醇5α 還原酶2（steroid 5 alpha reductase" SRD5A2）基因表達相對具有組織或細(xì)胞特異性，與生殖系統(tǒng)和前列腺組織的發(fā)育有關(guān)^［12］。Cheng等^［13］研究了中國14例5α還原酶缺乏癥患者，大多數(shù)患者表現(xiàn)為生殖器官發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn)，SRD5A缺乏后男性表現(xiàn)為性別畸形癥狀，女性則表現(xiàn)出生育能力減弱^［14］，或者生殖器性別不清^［15］。通過分析不同生育階段黑山羊和藏山羊的卵巢組織表達譜，發(fā)現(xiàn)SRD5A2可能與黑山羊的高繁殖力有關(guān)^［16］。但SRD5A2基因?qū)ν寐殉睪Cs增殖和凋亡的調(diào)控功能尚不清楚。本試驗旨在探究SRD5A2對新西蘭母兔GCs增殖、凋亡及合成類固醇激素相關(guān)基因的影響，分析該基因在母兔卵巢中的潛在影響和調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分離與鑒定

試驗動物選擇健康的4～6月齡性成熟的雌性新西蘭白兔。采集卵巢組織，收集含有GCs的卵泡穿刺液，低速離心后，倒掉上清液。向離心管中加入DMEM/F12培養(yǎng)基（15%胎牛血清；1%雙抗），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO 2條件下培養(yǎng)。

利用FSHR免疫化學(xué)法鑒定GCs細(xì)胞。將分離細(xì)胞接種到6孔板上培養(yǎng)，室溫條件下，4%多聚甲醛固定30 min，然后用TritionX-100處理，室溫條件下再用1% BSA封閉1 h。加入1∶250稀釋后的Anti-FSHR，4 ℃孵育過夜。加入1∶2 000稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，DAPI對細(xì)胞核染色，并在熒光顯微鏡下觀察。

1.2 SRD5A2過表達載體構(gòu)建與siRNA合成

為構(gòu)建SRD5A2的過表達載體，對擴增的SRD5A2基因片段和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒進行雙酶切（EcoRⅠ和XbaⅠ），將回收的SRD5A2基因片段與線性化的pcDNA3.1（+）載體片段按一定比例混合，利用Exane ^"Ⅱ進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，進行菌落PCR鑒定，將陽性克隆進行測序驗證，并提取質(zhì)粒備用。同時，設(shè)計兔SRD5A2 siRNA序列3條，由蘇州吉瑪基因（上海）合成（表1）。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測

進一步利用網(wǎng)站和相關(guān)軟件對SRD5A2蛋白進行生物信息學(xué)預(yù)測，包括蛋白質(zhì)理化特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位情況、磷酸化位點、結(jié)構(gòu)域預(yù)測等，具體信息見表2。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

GCs生長密度達到70%時，接種到24孔板中。按照說明書配制轉(zhuǎn)染試劑A和轉(zhuǎn)染試劑B。轉(zhuǎn)染試劑A為Opti-MEM加pcDNA3.1-SRD5A2質(zhì)粒或siRNA，轉(zhuǎn)染試劑B為 Opti-MEM加lip 2000。配制好后靜置5 min，隨后將A和B試劑混合并吹打混勻，靜置20 min。加入到細(xì)胞中，進行CCK-8、流式細(xì)胞和qRT-PCR等相關(guān)試驗。

1.5 總RNA的提取

GCs用預(yù)冷的PBS洗兩遍，加入RZ，常溫靜置5 min。加入200 μL氯仿，震蕩后靜置5 min。4 ℃、12 000 r·min^-1離心10 min，吸取最上面的水相。加入0.5倍體積無水乙醇混勻，離心30 s。加入500 μL去蛋白液RD后離心30 s，再加入500 μL漂洗液PW離心30 s，漂洗。12 000 r·min^-1 空離2 min，通風(fēng)晾干。溶解后，測定RNA濃度及純度，置 -80 ℃保存。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據(jù)NCBI上SRD5A2和HIF1A、 INHBB、HSD17B1、GDF9和 BMP15等相關(guān)基因的信息，設(shè)計定量引物（表3），GAPDH為內(nèi)參基因。采用2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒20 μL反應(yīng)體系，具體參考試劑盒說明書。

1.7 細(xì)胞增殖

采用CCK-8法檢測GCs細(xì)胞增殖情況。將GCs細(xì)胞懸液均勻地分配到96孔板中，每孔分配100 μL。隨后，在0、24、48、72 h向每孔中加入10 μL的CCK-8試劑。放回培養(yǎng)箱中孵育2.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度（OD值）。

1.8 細(xì)胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒檢測GCs的細(xì)胞凋亡水平。用TrypLE消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。加入適量的結(jié)合緩沖液，吹打重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC和PI染色液，輕輕混勻。室溫下避光孵育10 min，加 Binding Buffer，流式細(xì)胞儀進行檢測。用FlowJo軟件統(tǒng)計Q2和Q4區(qū)域細(xì)胞數(shù)量來計算凋亡率。

1.9 統(tǒng)計分析

qRT-PCR的數(shù)據(jù)利用2^-△△Ct法進行計算。數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 25中的單因素ANOVA方差分析和T檢驗進行差異顯著性分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，*P＜0.05為差異顯著，**P＜0.01為差異極顯著。用GraphPad prism 9制圖。

2 結(jié) 果

2.1 SRD5A2基因克隆和過表達載體構(gòu)建

經(jīng)凝膠電泳和測序發(fā)現(xiàn)，擴增片段大小為765 bp，與目的片段大小一致，序列同源性100%（圖1A）。隨后構(gòu)建過表達載體，經(jīng)雙酶切鑒定得到兩個條帶（約為5 000 bp和750 bp）（圖1B）。測序驗證為目的條帶，表明pcDNA3.1-SRD5A2載體成功構(gòu)建。

2.2 生物學(xué)信息分析

基因CDS全長765 bp，SRD5A2蛋白由252個氨基酸構(gòu)成，分子式為C 1361H 2028N 334O 328S 9，蛋白分子量為28605.65，其中亮氨酸占比最高（13.8%），且疏水氨基酸多于親水氨基酸，表明其具有疏水性（圖2A）。理化特性上，SRD5A2蛋白的等電點為9.53，帶正電荷的氨基酸有22個，帶負(fù)電荷的有11個，脂肪族氨基酸指數(shù)高達98.78，穩(wěn)定性較好（不穩(wěn)定性指數(shù)39.54），親水性略低（總平均親水性0.437）。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈構(gòu)成（圖2B），三級結(jié)構(gòu)呈彎曲螺旋狀（圖2D）。磷酸化預(yù)測顯示，該蛋白有21個潛在的磷酸化位點（圖2C）。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，SRD5A2蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2E）。通過CDD工具分析，發(fā)現(xiàn)它含有一個PMET家族的結(jié)構(gòu)域（圖2F）。將兔SRD5A2蛋白序列與牛、馬、豬等11個物種進行同源性對比，發(fā)現(xiàn)兔單獨為一支，與牛、豬、驢、馬、彌猴、人、黑猩猩較為接近，與雞最遠（圖2G）。

2.3 兔卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定

采集兔卵巢組織，分離出GCs并培養(yǎng)，原代細(xì)胞呈梭形，傳代后細(xì)胞為多邊形。免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞膜上FSHR表達，證實所分離細(xì)胞為兔GCs（圖3）。

2.4 SRD5A2基因?qū)︻惞檀技に睾铣上嚓P(guān)基因的調(diào)控作用

為了進一步分析SRD5A2的功能，在GCs中進行了SRD5A2的過表達和敲低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-SRD5A2過表達載體和3對SRD5A2 siRNA均能極顯著調(diào)控SRD5A2在GCs中的表達（P＜0.0 圖4A，4C）。其中siRNA-508的敲低效果最好，故選此用于后續(xù)試驗。在GCs中過表達和干擾SRD5A2后，發(fā)現(xiàn)過表達SRD5A2基因能夠極顯著下調(diào)HIF1A和上調(diào)INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達（P＜0.0 圖4B）；而干擾SRD5A2基因極顯著上調(diào)HIF1A和下調(diào)INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達（P＜0.0 圖4D）。

2.5 SRD5A2基因影響新西蘭兔GCs的增殖與凋亡

分析SRD5A2對GCs增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，SRD5A2過表達后，顯著或極顯著增加了GCs在24～72 h的增殖水平（P＜0.05；P＜0.01），并極顯著抑制了GCs的凋亡水平（P＜0.0 圖5A）；而SRD5A2敲低后，顯著或極顯著降低了GCs在24～72 h的增殖水平（P＜0.05；P＜0.01），并極顯著提高GCs的細(xì)胞凋亡率（P＜0.0 圖5B）。說明SRD5A2可以促進卵巢GCs的增殖，抑制GCs凋亡。

3 討 論

類固醇激素是一類四環(huán)脂肪烴化合物，又稱甾體激素，是動物體內(nèi)最主要的一類性腺激素，負(fù)責(zé)參與動物的生殖調(diào)控。SRD5A2是一種位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的微粒蛋白，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮（DHT），在性別分化以及雄激素的生成中發(fā)揮重要作用。在雌性動物中，DHT抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促進小腔卵泡的發(fā)育^［21-22］。當(dāng)該酶發(fā)生缺陷時會影響機體的生殖能力^［23］。本研究發(fā)現(xiàn)SRD5A2蛋白特性不穩(wěn)定、疏水且保守。

GCs在卵泡生長、黃體形成中至關(guān)重要，其增殖與分化是檢查卵巢功能的重要指標(biāo)^［24］。在GCs中，SRD5A2的過表達與干擾可調(diào)控HIF1A、INHBB、HSD17B1、GDF9及BMP15等基因表達，這些基因在卵泡成熟^［25］、激素平衡^［26］、細(xì)胞凋亡^［27］及胚胎質(zhì)量^［28］等過程中發(fā)揮作用。HIF1A參與卵泡形成，通過調(diào)節(jié)卵泡血管發(fā)育來影響卵泡發(fā)育^［29］。INHBB由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)卵泡刺激素（FSH）水平，進而影響受精機會，同時在輸卵管和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達，對早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要^［30］。HSD17B1基因敲除小鼠繁殖力下降，黃體生成受阻，孕酮濃度降低^［31］。GDF9和BMP15作為轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員，在卵泡生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用^［32］。GDF9由卵母細(xì)胞分泌，調(diào)控卵巢卵泡生長發(fā)育^［33-34］。BMP15則是顆粒細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，促進GCs增殖和生殖干細(xì)胞分化，與繁殖性狀緊密相關(guān)^［35-36］。研究發(fā)現(xiàn)，SRD5A2在GCs中的表達變化直接影響上述基因的表達模式，影響母兔卵泡發(fā)育。

在卵泡發(fā)育過程中，GCs的增殖促進卵泡成熟，而GCs的凋亡會引發(fā)卵泡閉鎖^［37］。在形態(tài)學(xué)上，在閉鎖的早期階段，發(fā)生細(xì)胞凋亡的GCs主要位于顆粒層的內(nèi)表面，而不是精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞的內(nèi)膜層和外膜層^［38］，表明GCs的凋亡在卵泡閉鎖中起作用^［39］。因此，GCs細(xì)胞是否凋亡決定了是否卵泡閉鎖，從而決定了母畜的生育能力是否降低。為了探究SRD5A2基因在新西蘭母兔卵巢GCs增殖與凋亡過程中的作用，本研究采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測了GCs的增殖能力和凋亡比例。結(jié)果表明，當(dāng)SRD5A2基因過表達時，GCs的增殖顯著增強，細(xì)胞凋亡則受到明顯抑制；而干擾該基因的表達，GCs的增殖受到抑制，凋亡則顯著提升。研究發(fā)現(xiàn)過表達SRD5A2顯著促進了羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，這與本研究結(jié)果一致^［40］。研究進一步揭示了該基因通過調(diào)控與類固醇激素合成相關(guān)的基因表達，進而影響新西蘭母兔卵巢GCs功能，最終影響卵巢發(fā)育。

4 結(jié) 論

SRD5A2基因能夠促進GCs的增殖且抑制其凋亡，并調(diào)控合成類固醇激素相關(guān)基因的表達，從而參與新西蘭母兔卵巢卵泡發(fā)育過程。

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（編輯 郭云雁）