CRISPRCas 系統在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的研究進展

摘要：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種食品安全級微生物，現已廣泛應用于工業發酵。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）介導的基因組編輯技術在以枯草芽孢桿菌為底盤細胞的微生物代謝工程研究中發揮了重要作用。介紹了CRISPR‐Cas系統的免疫應答機制和分類以及枯草芽孢桿菌中CRISPR-Cas9基因組編輯的3種類型，重點總結了最新的CRISPR開發和設計策略，以期為優化現有的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統提供參考，從而提高枯草芽孢桿菌的工業化應用潛能。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；基因編輯；CRISPR-Cas9；CRISPR-Cpf1；PAM無依賴doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0260

中圖分類號：Q812 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2025）02‐0024‐09

枯草芽孢桿菌主要分布于土壤及腐敗的有機物中[1]，具有清晰的遺傳背景和成熟的基因工程操作技術，因此一直被用作模式微生物[2‐3]。它具有很強的蛋白分泌能力，并且不會產生內毒素等有害物質，因此被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證為GRAS（generally recognized as safe）菌株，是食品安全級微生物[4‐5]；除此之外，由于其生長速度快、蛋白分泌能力強、不易被噬菌體感染以及在基因操作過程中沒有明顯的密碼子偏好性，常被用于工業發酵[5-7]，特別是在淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等酶制劑的生產中有著廣泛的應用。

近年來，隨著基因工程技術和分子生物學等的發展，啟動子工程、輔因子工程、基因回路、途徑酶組裝和基因編輯等多種研究策略和工具被用以枯草芽孢桿菌底盤細胞的構建，進行透明質酸[8]、七稀甲萘醌[9]、N-乙酰氨基葡萄糖[10]、核黃素[11]和母乳寡糖[12] 等生物制品的高效合成。其中CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）介導的基因編輯系統被廣泛用于構建枯草芽孢桿菌底盤細胞以進行酶制劑等生物制品的高效合成。CRISPR是細菌和古菌抵御外來病毒入侵的一種獲得性免疫系統，如今已發展成為基因工程中強大的基因編輯工具[13]。CRISPR 基因編輯系統是通過sgRNA 引導Cas蛋白（如Cas9、Cpf1等）定位到靶基因位點，隨后Cas蛋白在基因組的特定位點對DNA進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，在同源性定向修復過程中通過同源臂將特定修飾的片段引入基因組，從而實現基因的敲除、插入或突變[14]。

枯草芽孢桿菌中建立了多種基于CRISPR‐Cas的基因編輯系統（CRISPR‐Cas9/Cpf1 等）。Zhang等[15]通過構建包含靶標特異性的sgRNA、Cas9和同源修復模板的多合一CRISPR‐Cas9編輯系統，敲除了枯草芽孢桿菌中與孢子形成相關的5個基因，獲得的突變株在發酵過程中，由于孢子萌發率大幅降低，重組蛋白得以穩定生產，胞外分泌的β-環糊精糖基轉移酶活力達到277.8 U·mL-1，是未改造前的2.5倍。張春曉等[16]通過CRISPR/Cpf1編輯系統，對枯草芽孢桿菌中的d-丙氨酸消旋酶基因da1 進行了敲除，實現了β-甘露聚糖酶的食品級表達，酶活力達到17 601.3 U·mL-1。本文介紹了CRISPR-Cas 系統的機制和分類，并總結了3種基于CRISPR-Cas9的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統構建方法，最后展望了新興的CRISPR 系統開發和設計策略，為提高枯草芽孢桿菌的工業化應用提供新的見解。

1 CRISPRCas系統簡介

作為新一代基因組編輯工具的關鍵技術，CRISPR‐Cas系統在細菌和古生菌中發揮著適應性免疫機制作用。CRISPR‐Cas免疫應答包括3個主要階段：適應、表達和干擾。在適應階段，外源DNA 片段（protospacer）被識別并整合在CRISPR基因座區域中的2個相鄰重復之間，形成CRISPR陣列，protospacer 相鄰基序（protospacer adjacentmotif，PAM）是存在于protospacer近端的一小段保守核苷酸，用作獲取DNA片段的識別基序。在表達階段，CRISPR陣列被RNA聚合酶轉錄成前體CRISPR RNA（pre-crRNA），再被Cas 蛋白進一步切割成小的crRNA。crRNA包含1個部分重復序列和1個來自外源DNA片段并與之互補的單個間隔區。在干擾階段，Cas蛋白與crRNA‐外源DNA復合物結合并切割DNA片段，干擾病毒復制并為宿主細胞提供免疫力。

如圖1所示，根據干擾階段效應蛋白的組成和具體的響應模式，CRISPR‐Cas系統可分為2類（class），6型（type）[17]。第1類CRISPR‐Cas系統目前多發現于古細菌中，其特點是系統編碼的多個Cas蛋白會構成效應復合體與CRISPR 一起發揮作用；與其不同的是，第2類CRISPR‐Cas 系統中的Cas蛋白往往是具有多結構域的單一蛋白，較第1類CRISPR系統的組成更簡單。因此，目前基于CRISPR的基因編輯系統絕大部分都是由第2類CRISPR 系統改造而來的，其中應用最為廣泛的是第2類的第Ⅱ型——CRISPR‐Cas9系統[18]。

2 基于CRISPRCas9的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統構建

枯草芽孢桿菌中建立了多種基于CRISPR‐Cas的基因編輯系統，并且都取得了較好的應用效果。CRISPR‐Cas9系統為許多領域的研究帶來了新發展[19]，Ⅱ型CRISPR‐Cas9 系統已被證明可以在枯草芽孢桿菌中引入點突變、基因缺失和插入，并被廣泛應用于代謝工程和合成生物學領域。根據CRISPR‐Cas9 系統中供體DNA、Cas9 和gRNA 表達的設計策略，可以將枯草芽孢桿菌CRISPR‐Cas9系統分為3種不同類型，分別是單質粒系統、雙質粒系統和基因組整合型[20]（表1）。

2.1 單質粒CRISPRCas9基因組編輯系統

基于單個質粒編碼的基因組編輯系統已經被開發應用于各種原核生物和真核生物。Altenbuchner[21]報道了一種用于單質粒枯草芽孢桿菌基因組的編輯系統，不僅可以高效地進行基因組編輯，還克服了反向篩選方法的局限性。該系統通過將Cas9、gRNA、供體DNA和其他元件共同連接到同一載體骨架，構建了單質粒體系，其中Cas9和gRNA分別由1個誘導型啟動子和1個強組成型啟動子啟動轉錄。

單質粒基因編輯系統具有較高的基因編輯效率，因此可以應用于工業枯草芽孢桿菌的改造。Zou等[31]構建了一個“多合一”的CRISPR‐Cas9單質粒系統，縮短了枯草芽孢桿菌一輪編輯周期。該系統能夠實現100%的單基因缺失和點突變效率以及96%的基因插入效率。由于所有元件均整合在1個質粒載體上，載體太大導致轉化效率低，研究人員將質粒消化成片段，使用分子凝結劑PEG4000輔助連接質粒片段后轉化入枯草芽孢桿菌，轉化效率較直接轉化提升了2～3 個數量級。單質粒介導的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統在枯草芽孢桿菌中的應用結果表明，該系統在枯草芽孢桿菌的基因組改造中具有巨大的潛力。

單質粒基因編輯系統不僅可以實現枯草芽孢桿菌基因組的高效編輯，更重要的是，可以降低宿主菌株的適應性負擔，從而提高工程菌株的存活率。但是使用單質粒系統需要多步、多次構建質粒，大大降低了基因編輯系統的內在效率，而且單質粒系統的同源重組效率在很大程度上取決于同源修復模板的長度。綜上所述，單質粒介導的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統在枯草芽孢桿菌的基因工程改造中仍存在一定的局限性。

2.2 雙質粒CRISPRCas9基因組編輯系統

雙質粒基因編輯系統是一種基于CRISPRCas9的、更靈活的基因組編輯系統，已經開始應用于枯草芽孢菌的基因組編輯，在該系統中，Cas9、gRNA 和供體DNA 被分別構建到2 個不同的載體質粒中，最后在宿主菌株體內結合進行基因組編輯，其中第1個質粒用于產生Cas9蛋白，第2 個質粒用于傳遞gRNA 轉錄模板和供體DNA模板。

Lim 等[28]開發了一種基于CRISPR‐Cas9的高效雙質粒基因編輯系統，并對枯草芽孢桿菌基因組中8 個胞外蛋白酶基因進行了精準的基因缺失。在這個雙質粒系統中，Cas9 基因被連接到pHCas9載體中以產生Cas9蛋白，2個sgRNA——靶基因sgRNA （sgRNAct）、自靶向sgRNA （sgRNAst）及用于同源定點修復的供體DNA 被連接到pG2載體中，以對靶位點進行相應操作。將pHCas9載體和pG2載體先后轉入枯草芽孢桿菌后發現，在多輪的枯草芽孢基因組編輯中，8個胞外蛋白酶基因的敲除效率都達到了90% 以上，其中bpr、nprB、wprA 的敲除效率達到了100%。由此表明，該系統可以在枯草芽孢桿菌基因組的連續編輯中對靶基因實現高效率刪除。

雙質粒介導的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統極大地促進了枯草芽孢桿菌基因組編輯研究的發展，然而雙質粒系統也存在諸多局限性，如在基因工程操作過程中存在不穩定性，可能會增加宿主菌株的適應性負擔，并且在迭代基因組編輯中需要耗費大量時間來消除質粒。

2.3 基于CRISPRCas9的基因組整合

為了克服潛在的質粒不穩定、轉化效率低和在宿主菌株上引入代謝負擔等問題，Westbrook等[30]構建了一個基于CRISPR‐Cas9的基因組整合工具箱來編輯枯草芽孢桿菌基因組，結果表明，該基因組整合工具箱可以對枯草芽孢桿菌實現單基因的插入與敲除以及連續基因組的編輯和靶向轉錄抑制，是一種連續有效的綜合基因組編輯工具箱。在這個基因組整合工具箱中，擴增出了thrC 5’端與3’端間的同源長度，并插入到相應的bpr 同源長度中，構建了gRNA 傳遞載體PAW002-2[32]；為了提高轉化效率，并使質粒易于在大腸桿菌中復制繁殖，利用枯草芽孢桿菌的araE/R 啟動子系統[33] 構建了載體PAW004-2，以驅動gRNA 的轉錄；選擇lacA 位點進行Cas9 的基因組整合[34]。此外，將每個gRNA分別構建了單gRNA傳遞載體和多gRNA傳遞載體，最后，將這些gRNA傳遞載體線性化后轉化枯草芽孢桿菌，結果顯示，單基因敲除效率為100%，雙基因敲除效率為85%，單基因插入效率為69%（插入片段長度為2.9 kb）[30]。該方法是CRISPR‐Cas9系統在枯草芽孢桿菌中同時敲除2個基因的首次報道。

與其他CRISPR‐Cas9系統相比，該基因組整合工具箱提高了轉化效率和編輯效率。然而，盡管基于CRISPR‐Cas9的基因組整合在枯草芽孢桿菌基因組編輯中展現了較高的編輯效率，但該工具箱需要1個酶切連接步驟將新的gRNA序列插入gRNA傳遞載體，并需要一輪重疊延伸PCR生成編輯模板，其操作過程非常繁瑣，因此，基于CRISPR‐Cas9的基因組整合在操作便利性方面仍有改進和優化的余地。

3 枯草芽孢桿菌CRISPR 開發和設計策略

不同遺傳操作方法的應用提高了對枯草芽孢桿菌基因組的認識和利用，其中CRISPR‐Cas9系統是最實用、最高效的基因組編輯方法，為點突變、基因敲除、基因插入提供了有效的解決辦法[28，30]。然而，利用CRISPR‐Cas9系統對枯草芽孢桿菌進行基因組編輯仍處于初步階段，由Cas9-gRNA 復合物引起的DNA 雙鏈斷裂修復可能很慢，以至于影響宿主細胞在被CRISPR‐Cas9系統轉化后的存活。此外，有些系統構建了多個質粒來實現基因組編輯，需要額外的操作來減少這些質粒對宿主菌株的代謝負擔，同時確保工程菌的安全性。因此，完善和拓展CRISPR 系統在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的應用還有以下幾個方面的工作要做。

3.1 開發用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的不同CRISPR 核酸酶

Cas9 蛋白與crRNA/tracrRNA 雙鏈結合成復合物，以介導侵入性雙鏈DNA 的序列特異性切割，其中crRNA指導切割特異性，而Cas9蛋白中的2個核酸酶活性位點介導切割以產生DNA雙鏈斷裂[18，35]。大量對Cas9蛋白結構特征的研究促進了切割特異性更高的Cas9編輯變體的發展[36-39]。Hirano等[36]對來自新兇手弗朗西斯菌（Francisellanovicida）的FnCas9進行了特征分析，并開發了一個能夠識別5’-YG’PAM 而不是原來的5’-NGGPAM的變體，增加了基因組編輯可用目標空間，即任何CG或TG后面的目標序列都容易被gRNA：FnCas9復合物靶向。此外，還可以使用其他具有不同PAM偏好的CRISPR核酸酶來增加基因組編輯的可用目標空間。

與Cas9 蛋白類似，Cpf1 蛋白是2 類CRISPR‐Cas系統中由單鏈RNA引導的內切酶，它起源于普氏菌屬（Prevotella）或弗朗西斯菌屬（Francisella）。與Cas9蛋白不同的是，Cpf1蛋白特異性識別前間隔序列5’端的TTTN PAM[40-42]，且Cpf1：crRNA 復合物的形成只需要1個crRNA，并在目標DNA上切割產生5個核苷酸突出的黏性末端[42‐43]，但Cas9：crRNA/tracrRNA 復合物的形成不僅需要crRNA，還需要1 個tracrRNA，并在目標DNA上切割產生平末端[18]。此外，Ran等[43]發現，CRISPR/Cpf1 的初級轉錄產物pre-crRNA 由Cpf1蛋白自身加工成熟，不需要RNase Ⅲ的參與，因此使用Cpf1 核酸內切酶進行基因組編輯可以是Cas9核酸內切酶之外的另一種選擇。Wu等[27]對CRISPR/Cpf1系統進行工程設計，構建了一種功能強大的枯草芽孢桿菌多基因編輯和調控系統（CAMERS-B），該系統可實現雙基因框內敲除、多點突變或單基因一次插入，效率可達100%。同時，Ran 等[43]還發現Cas9 中的1 個核酸酶活性位點（RuvCD10A或HNHH840A）發生突變，會得到不能切割DNA 的dCas9或者只能切割一條DNA 的nCas9，導致不能產生原來的平末端，該特性可以減少脫靶效應，并增強某些生物的同源重組修復。為了完善CRISPR系統在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的應用，應針對不同的、可相互替代的CRISPR核酸酶進行全面優化，提高編輯效率并彌補現有基因操作方法的不足。

3.2 開發用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的自靶向CRISPRCas系統

盡管CRISPR‐Cas免疫系統能嚴格區分自身DNA與外源DNA，但仍能夠在細菌中發現自靶向間隔子（self-targeting spacers）[44]。一般情況下，宿主細胞的命運是死亡或嚴重生長遲緩、或去除自身靶點以保證繼續存活[44-46]，然而，Hale等[47]報道，自靶向CRISPR‐Cas系統及其宿主生物在某些條件下可共同存在。在這種特殊情況下，RNA 切割CRISPR‐Cas系統的crRNA引導其crRNA靶向并切割crRNA轉錄所在位點的短逆轉錄本。Zou等[31]構建的枯草芽胞桿菌CRISPR‐Cas9“多合一”單質粒系統，結合自靶向sgRNA 進行迭代編輯，一輪編輯周期僅2.5 d，是單質粒系統中最快的迭代編輯系統，在質粒上設計了Pspo0A嚴格控制下的自靶向sgRNA 用于清除質粒，效率可達90%，加速了枯草芽胞桿菌的工程細胞構建。Lim等[28]利用雙質粒系統構建了一種高效、連續的枯草芽孢桿菌基因組編輯方法，該方法在pG2載體上連接了2個sgRNA—— 靶基因sgRNA （sgRNAct）和自靶向sgRNA （sgRNAst），其中sgRNAct 在生長階段引導Cas9切割靶基因，sgRNAst在孢子體階段引導Cas9切割sgRNA以清除質粒，由此產生的無sgRNA細胞進入下一輪編輯。該系統成功地在多輪編輯中刪除掉8 個胞外蛋白酶基因，表明自靶向的CRISPR‐Cas系統在枯草芽孢桿菌基因組編輯中有巨大的應用潛力。此外，Zhang等[48]報道了一種基于內源性I-B型CRISPR‐Cas系統的高效酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）基因組編輯工具，該工具顯著降低了CRISPR‐Cas的毒性，并提高了轉化效率。雖然這種調控機制和自靶向系統的作用原理尚不清楚，但這些結果揭示了利用內源性CRISPR‐Cas系統調控枯草芽孢桿菌基因表達的可能性。內源性CRISPR‐Cas系統是一種理想的基因組編輯工具，它可以減弱經典CRISPR 系統（如Ⅱ型CRISPR‐Cas9 系統）的潛在脫靶效應和毒性。

3.3 開發不限于PAM 的枯草芽孢桿菌CRISPRCas9系統

CRISPR激活（CRISPR activation， CRISPRa）和CRISPR 抑制（CRISPR interference， CRISPRi）為基因表達調控提供了基礎，但主要應用于真核生物，特別是缺乏原核CRISPRa研究[49]，這可能是由于細菌激活元件需要精確的空間定位和與目標啟動子的距離才能起作用，但基于Cas9的CRISPR工具只與NGG PAM序列相鄰的位點結合。這些情況阻礙了Cas9引導的激活元件精確介導細菌中內源基因表達的上調。

Walton等[50]構建了首個幾乎可以識別整個基因組序列的spCas9突變體——SpRY，它不再需要特定的PAM 序列。Klanschnig 等[51]用不依賴于PAM 的Cas9 變體SpRY 和噬菌體蛋白MCP 融合轉錄激活因子SoxS組合成CRISPRa，克服了PAM的限制，該工具被稱為SMS；與之前報道的CRISPRa比較，SMS可以不依賴PAM上調大腸桿菌的報告基因質粒庫；用scRNA（細胞質小RNA）替換gRNA 破壞MCP 與SoxS 的相互作用，實現SMS 在非NGG PAM 位點上的下調；同時使用scRNA和gRNA實現多基因表達控制；此外，還成功地利用SMS上調了內源基因和整合在大腸桿菌基因組上的gfp 基因。這項研究是CRISPRa在原核生物基因表達調控研究中的重要進展，為枯草芽孢桿菌等原核生物的基因組編輯研究提供了新的方向。

3.4 枯草芽孢桿菌高通量基因組修飾系統的開發

目前，在各種宿主細胞中構建的多種CRISPR-Cas9系統具有高效的基因組編輯能力，是適合開發和優化微生物細胞工廠的高通量技術。最近，Ronda等[52]將CRISPR‐Cas9和MAGE（multiplexautomated genome engineering）技術相結合，創造了一種高效、快速的大腸桿菌基因組工程方法CRMAGE（CRISPR‐Cas9 and λ Red recombineeringbased MAGE technology），使用CRMAGE 對大腸桿菌中3個基因組靶標進行基因重組，重組效率為96.5%～99.7%。Garst等[53]報道了CRISPR‐Cas9結合大量平行寡聚體的合成可以在全基因組范圍內實現跟蹤編輯，并基于此創造了CREATE（CRISPR enabled trackable genome engineering）基因組編輯方法，這是一種高效的基因組編輯策略，其通過大量平行寡聚體的合成構建CREATE 文庫，可以在大腸桿菌的基因組中進行大規模的精準編輯。Liang 等[54]在大腸桿菌中使用CREATE策略生成640個單獨的核糖體結合位點變體，然后利用這些單獨的變體構建了組合文庫用來選擇生產異丙醇的最佳變體，與常規方法相比，CREATE策略可在較短時間內完成近1 000株大腸桿菌變體的合理構建和試驗，并通過組合修飾提高異丙醇產量。此外，Bao 等[55] 開發了一種CRISPR‐Cas9和同源定向修復輔助的基因組規模工程方法（CHAnGE），該方法可以在酵母中快速輸出數萬個特定的遺傳變異。在CHAnGE系統中，98% 以上的目標序列被有效編輯，平均頻率為82%。由此表明，CRISPR‐Cas9 系統在高通量技術的發展中具有廣闊的前景，為合理設計的枯草芽孢桿菌菌株的構建和測試以及生產改良提供了技術支持。此外，還應基于高通量技術開發更強大的多基因修飾系統，以增強枯草芽孢桿菌基因組編輯的全域性。

3.5 系統弱化CRISPR-Cas 編輯低重組效率細菌

細菌基因組編輯通常依賴于Cas核酸酶切割未編輯的細胞染色體DNA來反篩出發生編輯的細胞。然而，編輯通常需要高重組和轉化效率，這在大多數菌株中是不具備的。即使是在模式菌中，有時也難以實現更大的插入、多重編輯或建庫。

近期，Collias等[56]發現CRISPR驅動的同源重組可以通過降低DNA靶向活性提升轉化子數量和編輯效率，從而在不同細菌中實現編輯。降低DNA 靶向活性可以通過改變gRNA 的序列結構（ 使用CRISPR 陣列加工得到crRNA，再與tracrRNA相互作用，而非直接使用sgRNA）或表達強度；使用切割活性降低的核酸酶或設計減毒gRNAs（attenuated gRNAs，atgRNAs）擾動核酸酶結合支架、非典型PAMs或錯配等來實現。這些修飾極大地增加了存活細胞數量，甚至提高了不同類型的Cas9和Cas12a在大腸桿菌和產酸克雷伯氏菌中的編輯效率。其中，最有效的方法是atgRNA，這種方法不需要重組酶，并且在不犧牲編輯效率的情況下增加了存活細胞數量。因此，減弱DNA 靶向提供了一種不同的方法來實現CRISPR驅動的細菌基因編輯，為枯草芽孢桿菌基因組編輯提供了新思路。

3.6 CreLoxP位點重組系統與CRISPRCas9基因編輯系統聯用

Cre‐LoxP系統是源于P1噬茵體的DNA重組體系，由Cre重組酶和相應的LoxP位點組成，它能導致重組發生在特定的DNA序列處（LoxP位點），該系統可以將外源基因定點整合到染色體上或將特定DNA片段刪除[57]，因此在枯草芽孢桿菌基因組的連續編輯中被廣泛應用于微生物菌株的代謝改造。

為了提高枯草芽孢桿菌基因組編輯的穩定性，并擴大其應用，Cai等[58]提出了Cre‐Cas系統的新概念，該系統將Cre‐LoxP 和CRISPR‐Cas9結合為一種簡便有效的方法。攜帶表達盒的整合載體通過單交叉同源重組整合到枯草芽孢桿菌染色體上，然后pHT-Cre質粒表達Cre重組酶去除lox66和lox71位點兩側的選擇標記，并將lox66和lox71位點之間的復制子重組為單個lox72位點。當不再需要外源基因表達盒時，使用輔助質粒pHPGCas9-gRNA，通過CRISPR‐Cas9 系統將表達盒移除并自我修復至其原始狀態。為了驗證該系統，使用T7和角蛋白酶表達盒，依據抗性基因的丟失或維持來評估自我修復效率，結果顯示自我修復效率都在97%以上[58]。這一系統為枯草芽孢桿菌基因組編輯提供了新思路。

4 結語

枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌的重要模式菌種，在醫藥、食品、農業和生物材料等行業有著廣泛的應用，如疫苗、酶制劑、飼料添加劑及其他生物化學品的生產。基于CRISPR 基因編輯系統，構建高效的枯草芽孢桿菌底盤細胞是提高其工業化應用的有效策略之一。然而，盡管枯草芽孢桿菌在工業上有著廣泛的應用，但是與大腸桿菌的工業化應用相比，在基因工程改造方法層面還存在不少差距，其中，在對枯草芽孢桿菌基因組編輯的應用中，枯草芽孢桿菌質粒構建效率低，是目前新方法應用需要突破的瓶頸之一。

隨著系統生物學、合成生物學及其他相關學科的快速發展，多學科的交叉結合應用將成為枯草芽孢桿菌底盤細胞設計與構建的重要方向。未來的研究應著眼于通過不同輔助技術的創造性和靈活性使用來解決枯草芽孢桿菌基因組編輯目前存在的問題，在保證遺傳操作中枯草芽孢桿菌高重組率的同時，提高載體構建效率，并采用創新的方法和策略，使現有的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統全面優化，這將大大提升枯草芽孢桿菌的工業應用潛能和范圍。

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