蘇云金芽孢桿菌對茶尺蠖腸道細菌多樣性的影響

摘要：茶尺蠖（Ectropis obliqua）是茶葉上的重要害蟲，給茶葉產業帶來嚴重經濟損失。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）作為防治茶尺蠖的關鍵生物殺蟲劑，在茶尺蠖的綠色防控中發揮重要作用。為明確Bt處理對茶尺蠖幼蟲腸道菌群的影響，基于Illumina平臺，采用16S rDNA高通量測序技術對不同水平Bt懸浮液處理的茶尺蠖幼蟲腸道細菌的群落結構和種群多樣性進行比較分析。結果表明，使用低劑量Bt處理茶尺蠖幼蟲后，其腸道細菌組成與對照處理相比并未發生明顯變化；但在較高劑量Bt處理下，茶尺蠖幼蟲腸道細菌的群落多樣性及豐度顯著增加，表明茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落參與了對Bt侵染的響應。以上研究結果為深入探究Bt殺蟲機制提供依據，并為提高Bt殺蟲毒力提供新的思路。

關鍵詞：茶尺蠖；蘇云金芽孢桿菌；生物防治；腸道細菌；16S rDNAdoi：10.13304/j.nykjdb.2023.0794

中圖分類號：S476 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2025）02‐0141‐09

在長期的協同進化過程中，昆蟲與其腸道微生物形成了密不可分的互利共生關系[1]。寄主昆蟲為微生物提供穩定的生存環境和必要的營養物質[2‐3]，在影響微生物的群落結構和代謝活動的同時賦予腸道微生物種類多樣性和符合宿主特異性的特點[4‐5]。昆蟲腸道微生物是調控宿主生物學性狀的重要調節因子，參與調控宿主食物分解和營養獲取、解毒、免疫防御功能，促進昆蟲生長、生殖和發育[6-9]。研究表明，甘蔗害蟲小蔗桿草螟（Diatraea saccharalis）腸道中的克雷伯氏桿菌具有降解甘蔗殘余廢物的作用，能夠協助宿主對甘蔗的取食和利用[10]；舞毒蛾（Lymantria dispar）腸道中的不動桿菌屬細菌能夠降解山楊產生的酚苷類化合物，保護宿主在進食后不受有毒物質的影響[11]。腸道微生物群落在正常狀態下維持正常生長模式，一旦腸道環境改變或受外源物質的脅迫，腸道微生物為應對環境變化會發生變化，從而導致腸道微生物在種群密度、物種豐富度以及物種優勢度等方面產生差異[12‐13]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）是一種自然界普遍存在的革蘭氏陽性菌，對鞘翅目、雙翅目、鱗翅目等500多種昆蟲具有較好的殺蟲活性，是目前世界范圍內產量最大、應用最廣的生物殺蟲劑之一[14]。Bt的殺蟲作用是通過產生具有殺蟲活性的伴孢晶體，這種晶體可與昆蟲中腸上皮細胞的特異性受體結合，造成中腸膜穿孔、細胞溶解，最終導致昆蟲死亡[15]。研究表明，在Bt毒蛋白Cry2Ab 蛋白的影響下，捕食性昆蟲龜紋瓢蟲（Propylaea japonica）體內優勢共生菌的基因拷貝數會發生明顯變化[16]。但是，Bt毒蛋白是否會影響害蟲體內腸道微生物的多樣性及其組成，目前尚不得知。

茶尺蠖（Ectropis obliqua）屬鱗翅目（Lepidoptera）尺蠖蛾科（Geometridae），是為害茶葉的毀滅性害蟲[17]。茶尺蠖主要以幼蟲大量取食茶樹葉片為害，嚴重時將茶園茶樹的葉片和嫩芽吃光，使茶樹僅留禿枝，致使樹勢衰弱、耐寒力差、易受凍害，嚴重制約了茶葉的優質高效生產，常年造成茶葉產量損失約15%[18]。目前化學農藥仍是茶園防治尺蠖的重要手段，但其容易導致“3R”問題，即抗性（resistance）、再增猖獗（resurgence）和殘留（residue），不利于茶園的可持續發展。利用病毒、真菌和細菌進行生物防控是茶尺蠖綠色防控的關鍵[19-21]。Bt作為重要生物殺蟲劑，在茶尺蠖的綠色防控中發揮了重要作用[22]，通常和茶尺蠖核型多角體病毒混用對茶尺蠖具有較好的防治效果。但茶尺蠖受到Bt刺激后其腸道微生物是如何進行響應的，目前仍不清楚。

為明確Bt處理對茶尺蠖幼蟲腸道菌群的影響，本研究基于16S rDNA 序列的高通量測序技術，對不同劑量Bt處理后的茶尺蠖腸道微生物多樣性進行分析，為揭示昆蟲腸道微生物對微生物殺蟲劑的響應模式、茶尺蠖生物防治新靶標與新技術的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試蟲飼養

蘇云金芽孢桿菌novonest4菌株為湖北省生物農藥工程研究中心菌株資源庫保藏菌株，保藏編號為CCTCC NO： M2018443。供試茶尺蠖幼蟲由武漢科諾生物科技股份有限公司提供，在人工氣候養蟲室內使用茶樹嫩苗繼代飼養，選取3齡幼蟲為供試蟲源。飼養溫度為（25±1）℃，相對濕度為85%±5%，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試蟲處理及樣品采集

選取大小一致、生長健康的茶尺蠖3齡幼蟲，分別配制Bt 懸液（1×109 CFU·mL-1）及其50、100和200倍稀釋液。采用浸葉法[23]通過Bt懸液的50（Bt50）、100（Bt100）和200倍稀釋液（Bt200）浸泡茶樹嫩苗，以清水浸泡為對照（CK）；然后用浸泡后的茶樹嫩苗飼喂供試幼蟲。

試蟲處理24 h后收集茶尺蠖腸道組織，首先用75%乙醇對存活的茶尺蠖幼蟲進行表面消毒后；使用無菌水漂洗蟲體3次；然后在無菌操作條件下將幼蟲解剖并取出完整腸道；用無菌水緩慢清洗后取其腸道內容物，放入已加入1 mL PBS緩沖液的離心管中。每管收集15頭幼蟲的腸道組織，每處理3次重復。采集的茶尺蠖腸道樣品研磨均勻后冷凍保存于-80 ℃冰箱，用于后續試驗。

1.3 茶尺蠖腸道微生物DNA 提取與測序

使用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取茶尺蠖幼蟲腸道微生物總DNA，采用紫外可見分光光度計檢驗DNA的質量和含量后保存于-20 ℃待用。

以細菌基因組DNA 為模板，利用TransStartFastpfu DNA Polymerase （NEB， USA），使用帶Barcode的特異性引物擴增16S rDNA基因V3～V4高變區。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進行切膠回收；然后將回收產物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader（BioTek，FLx800）。根據熒光定量結果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合，采用Illumina 平臺TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，進行雙端測序。

1.4 數據分析

利用FLASH 軟件（v1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對測序獲得的原始數據進行截取和過濾，運用QIIME 軟件（Quantitative InsightsInto Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）剔除5’端引物錯配堿基數gt;1的序列、含有連續相同堿基數gt;8 的序列及嵌合體序列，即得到有效序列，用于后續分析。

使用QIIME 軟件，調用序列比對工具UCLUST，對獲得的有效序列按97% 的序列相似度進行歸并和OTU（operational taxonomic units）劃分，并選取每個OTU 中豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列，OTU 豐度矩陣中需去除稀有OTU。以Greengenes 數據庫（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）為參考數據庫進行物種注釋分析。使用QIIME軟件分別對每個樣本計算Chao指數、ACE指數、Shannon指數、Simpson指數，并用R軟件繪制稀釋曲線、Venn圖等，進行各分類上的生物類群統計。通過LEfSe（lineardiscriminant analysis effect size）聚類分析對樣本在科和目水平進行統計檢驗和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同 Bt 處理下茶尺蠖幼蟲腸道細菌的OTU分析

由圖1可知，隨著各樣本測序數量增大，曲線由起初的急劇增長逐步趨于平緩，表明所測序列能夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續增加測序深度已無法檢測到大量新OTU。由此說明，本次測序量充足，可充分反映所測茶尺蠖腸道細菌的物種廣度，可用于后續分析。

CK、Bt50、Bt100、Bt200處理茶尺蠖幼蟲腸道細菌的OTU 數量分別為153、200、137 和125，Bt50處理茶尺蠖幼蟲腸道細菌的OTU數量高于CK和其他Bt處理，細菌的種類也較其他處理更加豐富（表1）。

由圖2可知，4個處理共有的OTU數量為31，而CK、Bt50、Bt100和Bt200處理特有的OTU數量分別為64、104、36和45。綜上表明，不同Bt處理對茶尺蠖幼蟲腸道細菌組成存在顯著影響。

2.2 不同Bt 處理對茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落Alpha 多樣性的影響

Shannon 指數、Simpson 指數和Pielou_e 指數分別代表微生物群落的多樣性、豐富度和均勻度，使用QIIME軟件分析不同處理茶尺蠖腸道細菌群落的Alpha多樣性，結果如圖3所示。Bt50處理茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落的多樣性、豐富度和均勻度均最高。此外，Bt10和Bt200處理茶尺蠖腸道細菌群落的物種數量較CK 處理有所降低，而Bt50處理的物種數量顯著增加。綜上表明，Bt對茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落Alpha多樣性的影響因Bt劑量的不同而存在差異。

2.3 不同Bt 處理對茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落Beta 多樣性的影響

無度量多維標定法（non-metric multidimensionalscaling， NMDS， stresslt;0.2）統計是一種基于樣本距離矩陣的分析方法，通過降維處理展現樣本特定的距離分布，能夠有效反映不同樣本間細菌種類差異性，如圖4所示。不同Bt處理的數據散點獨立分開，即不同處理間均存在顯著差異，說明不同劑量Bt處理的茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落在種類組成上具有顯著差異。

2.4 不同Bt 處理對茶尺蠖腸道細菌種群組成和豐度的影響

不同Bt處理茶尺蠖腸道細菌群落在各分類水平上的物種組成如圖5所示。在門水平上，不同Bt處理茶尺蠖腸道的細菌群落組成與CK差異較小，優勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）（圖5A）；但隨著Bt劑量的增加，厚壁菌門的相對豐度呈現先升高后降低趨勢，而變形菌門的相對豐度表現為先降低后升高趨勢（圖5B）。在屬水平上，不同處理間腸道細菌群落的組成也沒有明顯差異，優勢菌屬均為腸球菌屬（Enterococcus）和沃爾巴克氏菌屬（Wolbachia）（圖5C）；此外，腸球菌屬的豐度隨Bt劑量的增加呈先上升后下降趨勢，而沃爾巴克氏菌屬的豐度表現出先降后升的趨勢（圖5D）。

2.5 不同Bt 處理后茶尺蠖幼蟲腸道樣本組間物種差異顯著性分析

為尋找不同樣本間具有統計學差異的生物標志物，采用LEfSe分析篩選出不同Bt處理茶尺蠖幼蟲腸道的特征微生物，結果如圖6所示。其中Bt50處理后茶尺蠖幼蟲的腸道細菌類群與其他處理相比差異較大，有23個類群存在顯著差異，其中γ-變形菌綱（Gamma Proteobacter）最具鑒別性；在CK處理中，有16個類群存在顯著差異，主要集中在沃爾巴克氏菌屬（Wolbachia）、無形體科（Anaplasmataceae）、立克次氏體目（Rickettsiales）、α-變形菌綱（AlphaProteobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。

3 討論

昆蟲體內存在豐富的共生菌群落，在長期的進化過程中，腸道微生物與其宿主形成了共生關系，對宿主的生長發育、繁殖及免疫等生理功能具有重要作用。昆蟲體內的共生菌種群動態受多種因素影響，如宿主生物型和地理種群、寄主植物種類、溫度等環境條件均能影響共生菌的感染[24]。本研究通過Illumina平臺采用16S rDNA高通量測序分析比較不同Bt處理下茶尺蠖幼蟲腸道共生菌的群落結構和多樣性，結果表明，高劑量Bt脅迫會顯著增加茶尺蠖幼蟲腸道共生菌的群落多樣性及豐度，暗示其腸道共生菌參與抵御蘇云金芽孢桿菌的侵染，能夠協同提高宿主對昆蟲病原細菌的免疫作用。

本研究表明，4個處理下茶尺蠖幼蟲腸道細菌群落中最主要優勢菌屬均為腸球菌屬，而腸球菌屬也是擁有Bt蛋白抗性的棉鈴蟲腸道共生細菌的優勢菌屬[25]。腸球菌為革蘭氏陽性菌，在自然界和昆蟲腸道中廣泛分布，是多種鱗翅目昆蟲如稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、菜青蟲（Pieris rapae）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、舞毒蛾等腸道中的優勢菌[26]。由于鱗翅目昆蟲的腸道大多為堿性環境，腸球菌可通過乙酸鹽的生成來平衡腸道pH，從而降低外界毒素對昆蟲的損害。研究表明，草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的食物從人工飼料轉換為寄主植物時，其通過調節腸球菌屬的相對豐度來降低食物變換帶來的不利影響[27]。大蠟螟（Galleria mellonella）幼蟲中腸的腸球菌數量會隨著抗菌肽基因表達水平的升高而增加，從而提高宿主抗性[28]。此外，腸球菌屬能夠降低Bt殺蟲蛋白對舞毒蛾和煙草天蛾（Manducasexta）的殺蟲活性[29‐30]。本研究結果表明，茶尺蠖幼蟲受Bt脅迫后，雖然腸球菌屬的相對豐度隨Bt劑量的增加呈先升高后降低趨勢，但與CK處理相比，Bt 處理下腸球菌屬的相對豐度均顯著增加，因此，腸球菌屬在茶尺蠖抵御外源細菌侵染過程中對宿主昆蟲起到一定的保護作用。

除腸球菌屬外，沃爾巴克氏菌屬在不同處理下的相對豐度也發生了明顯變化。Bt脅迫后，茶尺蠖幼蟲腸道中沃爾巴克氏菌屬的相對豐度顯著降低，一方面是由于 Bt作為昆蟲病原微生物侵入蟲體后激活了昆蟲的免疫系統，導致了對沃爾巴克氏菌的消除；另一方面Bt侵染后消耗了過多的營養物質，導致沃爾巴克氏菌的營養匱乏，從而使其豐度顯著降低。研究表明，沃爾巴克氏菌屬在對化學殺蟲劑敏感的茶尺蠖腸道菌群中的相對豐度高達36.69%，而在對聯苯菊酯抗性的茶尺蠖中僅占0.61%[31]。沃爾巴克氏菌是一種革蘭氏陰性胞內次生共生細菌，在節肢動物體內廣泛存在，并經卵傳播[32‐33]，其對宿主昆蟲的作用主要表現在3個方面：一是改變昆蟲適應環境的能力；二是通過胞質不親和、產雌孤雌生殖、雌性化或者殺雄作用等多種方式調控昆蟲生殖；三是調控媒介昆蟲對一些病毒病的復制和傳播能力[34-36]。然而昆蟲體內的沃爾巴克氏菌屬是否與宿主昆蟲自身的防御及免疫體系相關以及該菌屬如何調控昆蟲響應異源微生物的刺激仍有待進一步研究。

宿主腸道微生物受病原微生物感染發生改變的同時，其在病原微生物侵染過程中對殺蟲活性也會產生一定作用。在清除腸道共生菌的家蠶幼蟲中重建一種土著腸道菌后，家蠶幼蟲對Cry毒素的敏感性顯著提高，其死亡率增加約40%，說明該腸道菌對Bt的殺蟲效應具有增效作用[37]。然而對舞毒蛾研究發現，舞毒蛾幼蟲接種庫斯塔克亞種Bt菌株后，其腸道菌群數量明顯增加，但腸道菌群缺失時該Bt菌株對幼蟲仍具有致病力[38]。本研究基于16S rDNA測序發現，高劑量Bt處理對茶尺蠖幼蟲腸道的細菌組成造成顯著影響，且顯著增加其腸道共生菌的群落多樣性及豐度，由此推斷茶尺蠖幼蟲的腸道共生微生物可能參與抵御Bt的侵染，但Bt與腸道菌群之間的作用機制仍需進一步研究。

近年來，利用腸道微生物防治害蟲的新理論和新策略受到廣泛關注，其中，利用昆蟲沃爾巴克氏菌的胞質不相容性操縱細菌導致害蟲“不孕不育”，從而有效防控蚊媒疾病和農業蟲害已有相關實例[39-41]。然而相關技術在茶葉害蟲防治領域尚未展開應用，因此利用茶尺蠖關鍵腸道微生物、結合目前已有的生物防治手段是未來發展茶葉害蟲綠色防控的新思路之一，相關措施和策略仍有待進一步研究。

參 考 文 獻

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