α7nAChR激動劑對膿毒癥小鼠腸損傷及線粒體自噬的影響

[摘要]"目的"研究α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAChR）激動劑PNU-282987對膿毒癥小鼠腸損傷及線粒體自噬的影響。方法"選取30只雄性C57BL/6J小鼠作為研究對象，分為對照組、模型組、PNU-282987組，每組10只。PNU-282987組在造模前1h和造模后2h分別給予1mg/kg"PNU-282987腹腔注射；造模后24h取回腸組織，采用蘇木精-伊紅染色觀察病理改變并進行Chiu’s評分，采用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色觀察線粒體自噬情況，采用Western"blot法檢測α7nAChR、自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈（microtubule-associated"protein"1"light"chain，LC）3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1、線粒體自噬相關蛋白PTEN誘導激酶（PTEN-induced"kinase，PINK）1及Parkin的表達水平；取血清和回腸組織，檢測白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10。結果"三組小鼠回腸組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin的表達水平比較，模型組小鼠高于對照組，PNU-282987組小鼠高于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。三組小鼠的Chiu’s評分比較，模型組小鼠高于對照組，PNU-282987組小鼠低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。PNU-282987組小鼠回腸組織中α7nAChR水平高于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論"α7nAChR激動劑PNU-282987改善膿毒癥小鼠腸損傷，分子機制可能是激活回腸組織線粒體自噬、減輕炎癥反應。

[關鍵詞]"膿毒癥；腸損傷；α7煙堿型乙酰膽堿受體；線粒體自噬

[中圖分類號]"R631""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.02.011

Effect"of"α7nAChR"agonist"on"intestinal"injury"and"mitochondrial"autophagy"of"sepsis"mice

FEI"Liping，"TANG"Kankai，"LIU"Fengqi，"CHEN"Zhidong

Department"of"Critical"Care"Medicine，"the"First"People’s"Hospital"of"Huzhou，"Huzhou"313000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"effects"of"α7"nicotinic"acetylcholine"receptor（α7nAChR）"agonist"PNU-282987"on"intestinal"injury"and"mitochondrial"autophagy"in"sepsis"mice."Methods"A"total"of"30"male"C57BL/6J"mice"were"divided"into"control"group，"sepsis"group"and"PNU-282987"group，"10"mice"each"group."In"PNU-282987"group，"1mg/kg"PNU-282987"was"injected"intraperitoneally"1h"before"and"2h"after"modeling，"respectively."Intestinal"tissue"were"taken"back"24h"after"modeling，"and"pathological"changes"were"observed"by"hematoxylin-eosin"staining"and"Chiu’s"score"were"made."Mitochondrial"autophagy"were"observed"by"uranium"acetate-lead"citrate"double"staining，"and"α7nAChR，"autophagy"marker"protein"microtubule-associated"protein"1"light"chain（LC）3-Ⅱ/LC3-Ⅰ"and"Beclin-1，"and"mitochondrial"autophagy-related"protein"PTEN-induced"kinase"（PINK）1"were"detected"by"Western"blot."Serum"and"ileum"tissues"were"taken"to"detect"interleukin"（IL）-1β，"IL-6，"IL-10."Results"Comparison"of"Beclin-1，"LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，"PINK"1"and"Parkin"in"the"mice"ileum"tissues"among"three"groups，"model"group"were"higher"than"control"group，"and"PNU-282987"group"were"higher"than"model"group，"the"difference"were"statistically"significant（Plt;0.05）."Comparison"of"mice"in"Chiu’s"score"among"three"groups，""model"group"was"higher"than"control"group，"and"PNU-282987"group"was"lower"than"model"group，the"difference"were"significant（Plt;0.05）."PNU-282987"group"α7nAChR"level"in"the"mice"ileal"tissue"was"higher"than"model"group，"the"difference"was"significant"（Plt;0.05）."Conclusion"α7nAChR"agonist"PNU-282987"improves"intestinal"injury"in"sepsis"mice，"activation"of"mitochondrial"autophagy"and"reduction"of"inflammation"in"ileum"may"be"the"related"molecular"mechanism.

[Key"words]"Sepsis;"Intestinal"injury;"α7"Nicotinic"acetylcholine"receptor;"Mitochondrial"autophagy

在膿毒癥發生、發展中，腸損傷可引起腸道菌群易位、宿主炎癥反應加劇，進而導致膿毒癥病情加重、多器官衰竭及死亡風險增加。乙酰膽堿是體內調控炎癥反應的重要神經遞質，迷走神經興奮引起節后纖維末梢釋放乙酰膽堿、作用于免疫細胞表明的乙酰膽堿受體并發揮減少促炎因子釋放、抑制炎癥反應的作用[1-2]。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAChR）是介導乙酰膽堿抗炎活性的重要乙酰膽堿受體亞型，在膿毒癥小鼠中切除迷走神經可減輕腸損傷，提示乙酰膽堿通路在膿毒癥誘導腸損傷中起保護作用。在巨噬細胞中敲低α7nAChR表達可加重炎癥反應、抑制線粒體自噬，提示α7nAChR具有抗炎活性[3]。PNU-282987是α7nAChR激動劑，在新生兒壞死性小腸結腸炎、膿毒癥相關肺損傷和腎損傷等模型中發揮抗炎和組織保護作用[4-6]；但PNU-282987對膿毒癥誘導腸損傷的影響及機制尚不清楚。本研究通過動物實驗觀察PNU-282987對膿毒癥小鼠腸損傷及線粒體自噬的影響，旨在探討α7nAChR激動劑在膿毒癥誘導腸損傷中的治療價值及分子機制。

1""資料與方法

1.1""實驗動物、藥品與試劑

C57BL/6J小鼠30只，雄性、6～8周齡、體質量（20±2）g，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0018。本研究經湖州市第一人民醫院倫理委員會批準[倫理審批號：倫審第（2021KYLL034）號]。α7nAChR激動劑PNU-282987購自美國MCE公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附法檢測試劑盒購自武漢賽洛菲生物科技有限公司；α7nAChR單克隆抗體、Beclin-1單克隆抗體、微管相關蛋白1輕鏈（microtubule-associated-protein"light"chain，LC）3單克隆抗體、PTEN誘導激酶（PTEN-induced"putative"kinase，PINK）1單克隆抗體、Parkin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2""動物分組、造模、給藥及取材

30只小鼠分為對照組、模型組、PNU-282987組，每組10只。對照組進行假手術操作，麻醉、開腹、顯露盲腸，但不結扎和穿孔。模型組、PNU-282987組通過盲腸結扎穿孔手術制備膿毒癥模型，小鼠禁食過夜后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉10ml/kg麻醉。沿腹白線做1cm切口，進入腹腔、顯露盲腸，將腸管輕柔拉出并用無菌縫線在盲腸1/2處結扎，在盲腸底部用22G注射器針頭穿刺，擠出腸腔內糞便并將腸管放回腹腔，逐層縫合切口。PNU-282987組參照文獻[6]，在造模前1h和造模后2h分別給予1mg/kg"PNU-282987腹腔注射，對照組和模型組在造模前1h和造模后2h分別給予等劑量生理鹽水腹腔注射。造模后24h進行取材，麻醉后經心尖取血1ml，離心分離血清并放置在–80℃保存；而后麻醉法安樂死小鼠，打開腹腔并在距回盲瓣3cm處剪取遠端回腸組織2cm，用于HE染色和透射電鏡觀察；剩余的近端回腸組織用液氮冷凍，放置在–80℃保存，用于促炎因子水平和蛋白表達水平檢測。

1.3""小鼠回腸組織的HE染色與透射電鏡觀察

將小鼠遠端回腸組織作蠟切片，采用試劑盒進行HE染色，在顯微鏡下觀察回腸組織病理改變，拍照記錄并按照Chiu’s標準[7]進行評分。將小鼠遠端回腸組織用2.5%戊二醛固定12h后進行醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡下觀察線粒體自噬情況。

1.4""小鼠血清及回腸組織中促炎因子與蛋白表達水平的

檢測

取–80℃保存的小鼠回腸組織，按照1mg回腸組織∶4μl磷酸鹽緩沖液∶10μl組織裂解液混合并勻漿，組織勻漿液離心后取上清，采用試劑盒進行酶聯免疫吸附法實驗，檢測IL-1β、IL-6、IL-10水平；另取血清樣本，采用試劑盒進行酶聯免疫吸附法實驗，檢測IL-1β、IL-6、IL-10水平。取–80℃保存的小鼠回腸組織約50mg，在沸水中變性10min，冰浴降溫后放置在–80℃備用。檢測蛋白表達水平時，取變性的蛋白樣本進行Western"blot法檢驗，電泳、濕轉聚偏二氟乙烯膜后孵育一抗，4℃過夜；次日室溫孵育二抗1h，最后滴加增強化學發光（enhanced"chemiluminescence，ECL）顯影液并在凝膠成像系統中顯影，用Image"J軟件對顯影得到的蛋白條帶進行灰度值計算。

1.5""統計學方法

采用SPSS24.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""小鼠回腸組織中的α7nAChR表達變化

模型組小鼠血清及回腸組織中的α7nAChR表達水平低于對照組，PNU-282987組小鼠回腸組織中α7nAChR表達水平高于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。

2.2""PNU-282987對膿毒癥小鼠回腸組織病理改變及Chiu’s評分的影響

對照組小鼠回腸組織的絨毛結構和腺體結構完整；模型組小鼠回腸組織的頂部絨毛出現剝脫，可見炎癥細胞浸潤；PNU-282987組小鼠回腸組織的絨毛結構損傷和腺體結構損傷較模型組減輕。模型組小鼠的Chiu’s評分高于對照組（Plt;0.05），PNU-282987組小鼠的Chiu’s評分低于模型組（Plt;0.05）。

2.3""三組小鼠血清及回腸組織中促炎細胞因子水平的比較

模型組小鼠血清及回腸組織中的IL-1β、IL-6水平高于對照組，IL-10水平低于對照組（Plt;0.05）；PNU-282987組小鼠回腸組織中的IL-1β、IL-6水平低于模型組，IL-10水平高于模型組（Plt;0.05），見表1。

2.4""PNU-282987對膿毒癥小鼠回腸組織的線粒體自噬影響

對照組小鼠回腸組織中線粒體呈橢圓形、外膜光滑，內部線粒體嵴形態完整，未見自噬體形成；模型組回腸組織中線粒體腫脹、外膜不規則、內部線粒體嵴斷裂，可見雙側膜結構包裹的線粒體；PNU-282987組小鼠回腸組織中線粒體腫脹減輕、內部線粒體嵴無明顯斷裂，自噬體包裹的線粒體減少，見圖1。

2.5""三組小鼠回腸組織中自噬標志蛋白與線粒體自噬相關蛋白表達的比較

三組小鼠自噬標志蛋白比較，模型組小鼠回腸組織中的Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平高于對照組，PNU-282987組小鼠的Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平高于模型癥（Plt;0.05）。三組小鼠的線粒體自噬相關蛋白比較，模型組小鼠回腸組織中的PINK1、Parkin蛋白表達水平高于對照組，PNU-282987組小鼠回腸組織中的PINK1、Parkin蛋白表達水平高于模型組（Plt;0.05），見圖2。

3""討論

膿毒癥病情危重且可累及全身多個器官并引起功能障礙。腸黏膜屏障損傷是膿毒癥發生、發展過程中常見的靶器官受累表現，腸內細菌及毒素、其他炎癥介質經受損引起全身炎癥反應加劇、多器官功能障礙風險增加，嚴重者進展為膿毒癥休克、甚至死亡[7-9]。目前，關于膿毒癥相關腎損傷、肺損傷的分子機制研究較多，但關于膿毒癥誘導腸損傷的認識不足，在膿毒癥治療的臨床實踐中缺乏腸損傷的有效干預手段。

膽堿能抗炎通路是體內重要的抗炎信號通路之一，乙酰膽堿作為該通路中發揮抗炎作用的神經遞質，通過與細胞表面的乙酰膽堿受體結合發揮抑制炎癥反應激活、減少促炎因子釋放的作用[10]。研究表明切斷迷走神經的方式阻斷乙酰膽堿的作用后，膿毒癥小鼠腸黏膜的炎癥反應顯著加劇，提示膽堿能抗炎通路參與膿毒癥誘導腸損傷的發生、發展[3]。α7nAChR是膽堿能抗炎通路中介導乙酰膽堿抗炎作用的重要受體[11-12]。細胞實驗顯示敲低α7nAChR表達可加劇巨噬細胞的炎癥反應，提示α7nAChR有抗炎作用。膿毒癥相關肺損傷、腎損傷大鼠模型中α7nAChR表達降低，PNU-282987可顯著改善膿毒癥大鼠的炎癥反應及肺損傷[11-12]。

本研究膿毒癥小鼠回腸組織中的α7nAChR表達水平降低，提示回腸組織中的α7nAChR抗炎活性削弱，進而引起膿毒癥小鼠出現腸損傷。本研究使用α7nAChR激動劑PNU-282987對膿毒癥小鼠進行干預，檢測結果顯示干預后膿毒癥小鼠的回腸病理改變減輕，血清及回腸組織中的促炎細胞因子水平均下降，表明α7nAChR在膿毒癥發生、發展過程中參與腸損傷，膿毒癥小鼠回腸組織中α7nAChR表達下降可導致腸黏膜損傷及炎癥反應加劇。

膿毒癥發生、發展過程中臟器功能損傷的發生可能與線粒體自噬障礙有關。自噬是通過清道夫作用清除受損細胞器、維持細胞穩態的生物學過程，線粒體自噬能保證線粒體在病理條件下正常完成調控能量代謝、活性氧生成、鈣離子穩態、細胞凋亡等功能，減輕病理條件引起的組織或細胞損傷。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化、Beclin-1表達增加是自噬激活的標志。PINK1和Parkin是兩種調控線粒體自噬的標志蛋白，前者主要定位于線粒體外膜、可觸發線粒體自噬，而后招募并活化Parkin；活化的Parkin使線粒體貼上Ub標記并被自噬受體識別、啟動自噬過程[13-14]。動物實驗表明膿毒癥相關腦損傷、心肌損傷、腎損傷模型中線粒體自噬水平增加，激活自噬減輕膿毒癥引起的臟器損害[15-17]。本研究膿毒癥小鼠回腸組織中的Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin表達水平均增加，透射電鏡下顯示線粒體嵴斷裂或消失，可見被雙層膜結構包裹的線粒體，以上結果均提示線粒體自噬發生激活；PNU-282987干預后，膿毒癥小鼠回腸組織的線粒體自噬進一步激活，提示α7nAChR對線粒體自噬有激活作用，膿毒癥小鼠回腸組織中α7nAChR表達下降可導致線粒體自噬障礙、腸黏膜損傷及炎癥反應加劇。

綜上，膿毒癥小鼠回腸組織中α7nAChR參與線粒體自噬及炎癥反應的調控，α7nAChR激動劑PNU-282987改善膿毒癥小鼠腸損傷，激活回腸組織線粒體自噬、減輕炎癥反應是可能的分子機制，α7nAChR激動劑PNU-282987有可能成為膿毒癥治療過程中治療腸損傷的潛在藥物。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–09–07）

（修回日期：2024–11–25）