基層獸醫實驗室布魯氏菌病虎紅平板凝集與試管凝集試驗誤差分析

摘要：動物布魯氏菌病在基層實驗室一般通過血清學檢測，即虎紅平板凝集和試管凝集進行確診，本文對兩種檢測原理及影響因素進行了全面的分析和總結，以期提高檢測正確率從而提高布病檢疫凈化的效率，減少養殖戶經濟損失。

關鍵詞：布魯氏疾病、試管凝集、虎紅平板凝集、試驗誤差分析

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡稱布病，是由布魯氏菌侵入機體后，引起變態反應性的人獸共患的全身性傳染病?！吨腥A人民共和國動物防疫法》將其規定為乙類傳染病，農業農村部列為二類動物疫病病種。

1 流行病學調查及基層布病防控現狀

牛、羊、豬是引起疾病的主要病原菌，其中牛、羊傳播率較高。易感動物主要通過消化道、呼吸道、破潰皮膚或結膜等黏膜組織接觸到布魯氏菌，由于其具有易感性而造成感染。直接接觸主要發生在混牧、圈舍飼養、集貿市場交易和運輸過程中與患病動物接觸而造成感染，人也可通過接觸病畜臟器、血液、皮毛從而感染布?。婚g接接觸主要是被污染的圈舍、場地、水源、草料、飼養人員以及氣溶膠等多種途徑而感染布病。在流行病學調查中發現，除部分牲畜妊娠期出現流產、胎衣不下、乳房炎、睪丸炎、附睪炎等明顯癥狀，大多家畜成隱性發病，感染后通常不會表現出明顯的臨床癥狀，這也給布病防控凈化帶來了難度。養殖戶在養殖過程中不易察覺，感染此病后造成患者低熱、多汗、肌肉和關節酸痛、乏力或肝、脾、淋巴等組織不同程度的損傷，臨床癥狀多變且無特異性。因此，獸醫實驗室對家畜布病的確診、凈化至關重要。

近年來，為促進現代農業提檔升級，活畜禽調運和市場交易日趨頻繁，畜牧養殖業發展成為農民增收致富的“穩定器”，但布病在畜群和人類之間的感染率逐年程上升趨勢，嚴重威脅著畜牧業的發展和公共衛生事業，引起各級政府、獸醫行業管理部門和動物防疫機構的高度重視，甘肅省將其列為重點監測病種，采取“免疫接種為主、檢測凈化為輔”的方式，在免疫全覆蓋的基礎上，有針對性地對調引牛羊、引起人感染布病的重點區域和高流產率畜群以及其他可疑情況開展全群跟蹤監測，以及早發現并剔除陽性個體。因此，基層獸醫實驗室應堅持科技引領，加強防控能力建設，減少實驗誤差，提升檢測及鑒別診斷技術。

2 檢測確診方法

目前，基層實驗室依照《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646—2018）進行操作與判定：虎紅平板凝集試驗進行初步篩選，疑似陽性的樣品再使用試管凝集進行復檢，試管凝集試驗為陽性的，判定為感染動物[1]?；⒓t平板，價廉、快速簡便，適用于大批量初篩，但由于抗原特異性、溫度、試劑靈敏度等諸多因素的影響，出現假陽性較多，需進行試管凝集復檢，以確保判定準確，減少養殖戶經濟損失。

3 實驗原理

3.1 虎紅平板試驗原理（RBT）

所用抗原含有苯酚的酸性（PH3.6-3.9）粉色抗原，細菌抗原與相應的抗體（血清）混合后，在電解質參與下，抗原和抗體凝集成肉眼可見的凝集小塊。血清與虎紅平板凝集抗原等量（30 μL）混合后，4 min內若出現肉眼可見的凝集顆粒，判定為陽性（最低檢出限為22.22 IU/mL）。

3.2 試管凝集試驗原理（SAT）

試管凝集抗原與抗體（血清）混合，在電介質作用和37 ℃溫箱條件下作用24 h，抗原抗體形成復合物沉于試管底部，混合液清亮程度會發生變化，通過觀察混合液清亮程度，可判定是否存在布魯氏菌抗體。牛、駱駝、馬血清稀釋倍數為1：25至1：100，羊、豬血清稀釋倍數為1：50至1：400，當第二管試劑，即1：50（羊、豬1：100）出現“++”以上凝集時，該樣品判為陽性[2]（最低檢出限羊/豬為25 IU/mL，牛/駱駝/馬為50 IU/mL）。

4 共性影響因素分析

4.1 血清

畜禽采血分離血清是疫病監測、檢測、診斷和評估免疫效果的一項前提性工作，血清質量直接影響檢測結果。

4.2 采血管影響

采血管分為普通采血管與含肝素鈉抗凝劑采血管。普通采血管中不含抗凝劑，血液樣品采集凝血后離心，產生的上清液則為血清，而含有抗凝劑的采血管離心后，上清液則是血漿，前者在凝血的過程中，纖維蛋白原轉變成纖維蛋白塊，血清中無纖維蛋白，后者則與之相反。使用血漿試驗，纖維蛋白會與抗原結合，出現假陽性[3]。因此，采集樣品過程中應使用普通采血管，以避免出現假陽性。

4.3 血清質量

進行試驗的血清樣本應當無腐敗氣味、無溶血、透明清亮，樣品新鮮。血清分離分為自然析出法與離心機分離法，自然析出法獲得的血清質量更好，但要保證靜置時間大于1小時，血液樣本放置于20～37 ℃環境中，使纖維蛋白原收縮凝集，此時血液標本陽性率趨于穩定，降低假陽性率。因此，血液采集后應在凝血反應被激活、血液凝固后再移動樣品或者進行離心，降低纖維蛋白原與虎紅抗原、試管凝集抗原產生的非特異性凝集反應。

5 個性影響因素分析

5.1 虎紅平板試驗影響

第一，抗原靈敏度。診斷抗原用布病陽性參考血清國家標準品（1 000 IU/mL）標化，與0.5%苯酚生理鹽水1/45（22.22 IU/mL）稀釋的國家標準陽性樣品出現清晰地陽性反應，與1/55（18.18 IU/mL）稀釋的國家標準陽性血清不反應[4]。不同廠家的試劑對同一批樣品的檢測會產生差異，因此，抗原的質量對試驗的準確性有一定的影響，抗原靈敏度并不是越高越好，如果假陽性率過高，不僅會加大工作量，還會造成不必要的經濟損失。

第二，試劑樣品溫度。在2～8 ℃條件下保存，保質期為12個月，實驗室應按照規定的溫度儲存虎紅平板凝集試驗抗原，實驗室需要將抗原和血清恢復室溫（22±4 ℃）后使用，從冰箱中取出后立即試驗，則會導致實驗的敏感性降低。

第三，試驗操作。采用虎紅平板凝集試驗反應板進行檢測，減少試驗過程中反應板的影響。實驗前，應采用陰性對照樣本檢查虎紅試劑是否存在自凝現象，試驗過程中加入抗原和血清時應先分離，樣品加完后再用牙簽或木棍迅速混合均勻，涂布直徑為2 cm，避免反應時間過長或涂布直徑過大導致的假陽性。在自然光照下輕晃4 min判定結果，若4 min內為陰性，而4min后觀察為陽性，則最終判定為陰性，說明檢測樣本抗體濃度未達到最低檢

出限。

5.2 試管凝集試驗影響因素分析

第一，器皿及濕度?；鶎荧F醫實驗室布病試管凝集試驗現多采用一次性真空采血管，這樣不僅能夠減少實驗步驟，還能夠降低試管潔凈度帶來的試驗誤差。為確保在溫箱放置過程中因水分缺失造成的實驗誤差，產生氣溶膠，造成實驗室污染，反應過程中最好加蓋。

第二，5%石碳酸生理鹽水?？乖♂屢号c被檢血清稀釋使用5%石碳酸生理鹽水（羊使用5%石碳酸10%NaCL溶液），能夠抑制血清中IgM類抗體的凝集活性，檢測IgG類抗體，提高反應的特異性。同時，低濃度石碳酸有一定的抑菌作用，提高實驗的準確性。

第三，前帶現象的影響。試管凝集檢測過程中會出現稀釋度低的血清在管內不凝集，而稀釋度高的血清在管內出現凝集的現象，這叫做前帶現象。膠體粒子學說，是由于稀釋度低的血清中所含膠體粒子多，即抗體過剩，影響免疫復合物的形成，稀釋度高的所含膠體粒子少，所以出現了凝集，導致陰性或假陽性的結果。此時，需多采用幾個稀釋度進行復檢或者采用其他方法復檢[5]。

第四，試驗操作。試管凝集試驗加樣要注意將血清加到管底，稀釋吹吸次數盡量保持一致，同時，要避免氣溶膠產生（氣泡破裂等），加入抗原后震蕩混勻，比濁管制作與試驗同時進行，判定結果時應選擇自然光線。操作過程中需要注意的細節，在實驗室人員操作前要進行統一的培訓，減少人為操作過程中引起的實驗誤差，提高檢測結果的準確性。

6 檢測結果存在差異因素

虎紅平板凝集試驗檢出陽性樣品，試管復檢為陽性，則判定為布魯氏菌病陽性患病動物；試管復檢為陰性，判為陰性的樣品，可能是因為血漿引起的非特異性反應或抗體濃度在22.22-50IU/mL之間，造成不凝集現象。虎紅平板為陰性，試管為陽性的樣品，原因可能是小腸耶爾森等早期感染的IgM交叉反應或布魯氏菌病早期感染的IgM類抗體反應，引起凝集現象。

結語

虎紅平板與試管凝集試驗作為基層獸醫實驗室布病確診試驗，其準確性直接關系到養殖戶的經濟利益。因此，實驗室工作的專業技術人員在布病檢測前應進行崗前培訓，開展內部比對，確保在操作過程中保持一致，減少人為實驗誤差，實驗過程中注意血清樣品質量、溫度、稀釋液、前帶現象等因素影響，以防止出現假陽性結果。在檢測前應當加強抗原與樣品的檢查，確保樣品與實驗要求相符，從而提高檢測準確率?！?/p>

參考文獻：

[1] 全國動物衛生標準化技術委員會（SAC/TC 181）.動物布魯氏菌病診斷技術.GB/T 18646-2018[S].2018-02-06：1.

[2] 盧旺銀，王子堅.動物布魯氏菌病防治[M].蘭州：蘭州大學出版社，2023，7：119-120.

[3] 張智鵬.抗凝劑對動物布魯菌病虎紅平板凝集試驗的影響[J].動物醫學進展，2017，38（11）： 132-136.

[4] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農業出版社，2016：122.

[5] 張莉，王占輝，張永梅，等.影響布魯氏菌病抗體檢測的因素分析[J].醫學動物防制，2015，31（12）：1416+1433-1434.

收稿日期：2024-12-26

作者簡介：譚鎮陽（1995—），女，獸醫師。研究方向：動物防疫、獸醫實驗室檢測工作。