2022～2023年福建省三明地區A型輪狀病毒分子流行病學調查分析

摘要：為了解福建省三明地區A群豬輪狀病毒的流行情況及分子特征，對2022～2023年福建省三明地區55家規?；i場的4 356份糞便樣品進行檢測，用熒光定量PCR的方法調查RVA流行率，并對RVA陽性樣本進行VP7基因擴增、測序使用MegAlign 軟件進行同源性分析，利用MEGA11.0構建系統進化樹。

關鍵詞：A型輪狀病毒；調查分析；流行病學

輪狀病毒（Porcine Rotavirus，PoRV）屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是引起幼齡仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一[1]。病毒粒子有3層衣殼，最外層為VP7和VP4。根據VP7和VP4的特異性不同，PoRV可以分成2個血清型，分別為G型（VP7型）和P型（VP4型）[2]。G型和P型之間可以產生不同的組合，不同組合型之間的PoRV毒株誘導的交叉保護力低[3]，至今為止PoRV已經確立為35個G型基因型和50個P型基因型[7]。輪狀病毒基于VP6抗原性不同分為10個基因型（A-J），其中輪狀病毒A型（Porcine Rotavirus A， RVA）可以感染人和動物，也是導致產房仔豬腹瀉最常見的亞型，占到商品豬腹瀉的90%以上[4-5]?，F已有證據表明RVA不僅能在種間傳播而且已經有豬RVA毒株感染到人的案

例[6]。該病目前尚無有效的治療藥物，雖然部分疫苗公司開發了相應的疫苗，但是由于RVA的多基因型，導致該病不能很好地被控制。本研究擬對福建省三明地區10個縣市55家豬場進行RVA篩查，并對陽性樣品進行VP7基因測序和分析，希望能為了解三明地區豬群RVA的感染情況和當前優勢基因型流行情況并為豬場防控該病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及采樣原則

2022年8月～2023年9月對福建省閩西三明地區10個縣（市、區）的55家規?；i場開展樣本收集（表1）。場內樣本按照配額采樣策略，規定每1 000頭母豬采集定位欄母豬8～10頭、產房母豬8頭、產房仔豬和保育豬各15～20頭、中大豬10頭、公豬3～5頭，不足1 000頭的按1 000頭樣本采集。根據研究需求，個體樣本基于風險采樣，每個階段盡可能有腹瀉的樣品，共采集糞便樣品4 356份，其中腹瀉樣品1 568份。所有樣品按等體積比加入無菌PBS液，反復凍融3次后放入離心機，4 ℃條件下5 000 r/min離心2 min取上清液置于-20 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒購自濟凡生物科技（常州）有限公司；豬輪狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒購自廣州維伯鑫生物科技有限公司；HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DL2000 Plus DNA Marker 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機（Legend Micro 21R）、實時熒光定量PCR儀（Quant Studio 3）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；全自動核酸提取儀（GeneRotex）：西安天隆科技有限公司；電泳儀（DYCP-31DN）：北京六一生物科技有限公司；Gene Scope V1.80 凝膠成像系統：上海山富科學儀器有限公司。

1.4 引物設計

用于檢測RVA的引物根據GenBank所公布RVA流行株和經典毒株的保守區域為模板，采用SnapGene設計VP7基因特異性擴增引物（表2）。所有引物均為福建尚亞生物技術有限公司合成。

1.5 樣品熒光定量PCR檢測及結果判定

使用濟凡抽提試劑盒及配套核酸提取儀提取核酸，熒光定量PCR按操作說明書進行操作。

1.6 RVA VP7基因擴增與測序

對于RVA熒光定量PCR檢測陽性豬場核酸進行VP7基因擴增，反應體系為：20 μmol/L上下游引物各0.5μL、PCR Mix 12.5 μL、混合酶1.25 mL、RNA5 μL、無酶ddH2O 5.25μL，混合均勻。反應后取5 μLPCR產物經1.2%的瓊脂凝膠電泳，將陽性擴增產物送福建尚亞生物技術有限公司測序。

1.7 RVA VP7 基因型鑒定及序列分析

將測序的VP7基因序列采用MegAlign 和MEGA11.0等軟件與GenBank（表3）中參考序列進行分析，以判定與參考序列的同源性。

2 結果

2.1 檢測結果

第一，豬場糞便RVA檢測情況：2022～2023年間共檢測福建省三明地區55家規模豬場糞便樣品4 356份，全部樣品做RVA檢測，共檢測出陽性樣品755份，陽性比例為17.33%。其中腹瀉樣品1 568份，RVA陽性為732份，陽性率為46.68%（見表4）。

第二，不同縣（市）來源的樣品RVA陽性率：對福建省三明地區10個縣市共采樣55家（場），其中35家（場）檢測出RVA陽性。不同縣市來源的樣品RVA陽性率差異較大，其中明溪縣陽性率最高為31.05%，陽性家（個）感染率為80%，三元區樣品陽性率最低為9.09%，結果見表5。

第三，不同豬群RVA感染情況：通過對不同豬群糞便樣品的檢測，定位欄母豬、產房母豬、保育豬、中大豬和公豬5個豬群中RVA陽性率為：產房仔豬陽性率最高為24.48%，公豬糞便陽性率最低為5.91%，保育豬陽性率為20.71%，產房母豬陽性率的13.75%高于定位欄母豬的7.88%，提示產房母豬和仔豬存在相互傳染的可能，結果見表6。

2.2 VP7基因遺傳進化分析分型

第一，VP7 基因RT-PCR電泳圖：以VP7-F/R 為上下游引物擴增目的片段 VP7，擴增產物經凝膠電泳鑒定，結果顯示成功擴增目的片段與預期相符，見圖1。

第二，基于VP7基因分型及系統進化分析：將測序所得到14株RVA VP7基因序列與GenBank中已知基因型的代表毒株通過MEGA11.0軟件進行遺傳進化分析，結果顯示（圖2）：共測到4種基因型，其中G9為優勢基因型（71.43%），G3、G4和G5分別占比14.29%、7.14%和7.14%。通過MegAlign 軟件對測序所獲10株G9基因序列與8株參考G9基因型的核苷酸進行同源性分析，VP7核苷酸同源性在74.4%～100%（圖3）。SM230306-002和SM230306-004、SM240110-1和SM0153-1、SM20230201和SM20230202相近豬場分離到的毒株同源性100%。

3 討論

福建省三明地區2022～2023年規?；i場糞便樣本RVA陽性率為17.8%，腹瀉樣本陽性率為45.7%，提示本病為豬群腹瀉的主要原因。本研究糞便樣品RVA陽性率低于何曉明[6]等2021～2022年檢測的云南、貴州、廣東、廣西、江西和湖南6省86個規?；i場樣品的27.89%。但腹瀉樣本RVA陽性率與Qiao[7]等2022年對我國230家豬場中的25 768份腹瀉樣品檢測的51.15%陽性率相近，由于采樣數量和地區的不同，RVA流行率在1.5%～82.4%，尤其是安徽省樣本陽性率可達82.4%。樣本來源包括腸道樣本和肛拭子樣本，腸道樣本的檢出率高于肛拭子樣本。此外，與保育豬和母豬相比，RVA感染在仔豬中更為常見[8]。

仔豬感染后表現為精神、食欲缺乏，逐漸出現嘔吐等癥狀，隨病情嚴重會發生腹瀉，產黃色、灰色或黑色以及水樣或糊狀樣糞便，更甚者糞便會伴有黏液或血液，嚴重者死亡[9]。本研究產房仔豬RVA 陽性率為21.93%，顯著低于李國平[9]等1999年檢測的福建省10日齡以內拉稀仔豬66%的陽性率?？傮w而言，近年來隨著規?；i場越來越多，產房仔豬腹瀉樣品中RVA陽性率雖然有所降低，但仍然處于較高水平，況且RVA對仔豬健康影響較大，對規?；i場造成的損失不容忽視。

本研究根據Genbank上RVA的VP7基因序列設計了一對用于VP7基因擴增的特異性引物，擴增片段大小為309 bp。對擴增出的14份RVA樣本進行VP7基因測序，與28個參考毒株構建遺傳進化樹，發現14份序列分別為G3、G4、G5和G9型，G9型占比71.43%，為本地區主要流行基因型。此研究與谷拉強[10]等2022～2023年對我國部分地區A群輪狀病毒分子流行病學檢測G9型RVA占比為75.0%一致。本研究的10株G9型基因序列同源性在75.9%～100%，尤其是SMFC20230508和SMFC20230509、SMSX230110-1和SMJL230153-1、SMTN23-1和SMTN23-2 等從相近豬場分離到的毒株同源性為100%，提示輪狀病毒對距離相近的豬場有較強的傳染性。

4 結論

近年來三明地區多次從國外引種，并保持多病種陰性。但是由于RVA人畜共患且傳染性強，基因型復雜多樣等特點為豬場防控本病帶來不小壓力。通過本研究可以了解福建省三明地區RVA流行情況和優勢基因型，為本地區輪狀病毒防控提供參考。■

參考文獻：

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[10] 谷拉強，陶 然，程 曦，等.2022—2023年我國部分地區豬A群輪狀病毒分子流行病學調查分析[J].南方農業學報，2023，54（10）：3083-3091.

收稿日期：2024-11-19

作者簡介：陳小麗（1982—），女，本科。研究方向：動物傳染病。