小鼠股動脈結扎誘導下肢缺血后骨質疏松癥的動物模型構建與評價

摘要：本研究旨在建立與評價小鼠股動脈結扎誘導下肢缺血后骨質疏松癥的動物模型。7周齡C57BL/6J雄性小鼠按每組10只隨機分為造模組和對照組。在股動脈主干近端進行雙重結扎小鼠作為造模組；僅切開皮膚小鼠作為對照組。術后，分別比較小鼠下肢血流、小鼠行為學和小鼠骨量的變化。本研究結果表明成功構建小鼠股動脈結扎誘導下肢缺血后骨質疏松癥模型，該模型骨丟失較明顯。

關鍵詞：股動脈結扎；缺血；骨質疏松癥；動物模型

意外事故所致骨損傷逐年上升，由此而開展的骨折、截骨術也越來越普遍。各種原因引起的血管系統損傷難以恢復或不完全恢復。血管功能的異常破壞，引起血流供應減少導致骨骼中傷口及其周圍區域內血氧供給長期降低（氧分壓范圍為0至10 mmHg）[1]。隨著全球人口老齡化的加劇，創傷性外傷和骨折等事件發生率顯著增加。長期活動受限使得下肢局部組織血液供應不足，氣體交換失衡，最終導致骨組織局部缺氧。血管附近的成骨細胞和破骨細胞相互密切作用以保持骨量和結構[2]。在缺氧條件下，破骨細胞會啟動一系列分子和生理上的適應性調整，以維持其生存和功能[3]。因此，靶向低氧環境下的破骨細胞生成研究可能是血管—骨偶聯的潛在方向。

目前，探究血供異常組織缺血缺氧導致骨質疏松癥的動物模型尚無明確報道。為探究缺血缺氧后對局部組織骨量的影響，我們擬建立小鼠股動脈結扎誘導下肢缺血后骨質疏松癥模型進行研究，對其活動能力、下肢骨量進行統計分析以評價本實驗模型的成功建立。

1 材料和方法

1.1 時間及地點

實驗于2024年4～6月在廣西醫科大學動物實驗中心完成。

1.2 材料

一 實驗動物 C57BL/6J小鼠20只，SPF級，7周齡，雄性，體重18±2 g。隨機分組，5只/籠，12 h的光照與12 h的黑暗交替周期，自由采食飲水。實驗操作嚴格遵循實驗動物倫理標準，并經廣西醫科大學實驗動物管理委員會、實驗動物倫理委員會批準。實驗動物購自廣西醫科大學動物實驗中心。實驗動物生產許可證號為 SYXK（桂）2020-0004。實驗倫理編號（NO.202403013）。

二 主要儀器設備 Micro-CT skyscan1170（美國Bruker公司）；激光散斑血流成像儀（中國深圳瑞沃德公司）；顯微手術器械（重慶奧特光學儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

一 實驗分組：20只小鼠適應性喂養7 d后按照隨機數字表法分為左股動脈結扎組和對照組，每組10只。

二 模型制備：所有實驗小鼠在造模前12 h禁食、不禁水。

第一，左股動脈結扎組：腹腔注射1.25% 阿佛丁（0.2 mL/10 g），待小鼠進入麻醉狀態后，小鼠左側下肢剃毛，仰臥體位固定于手術臺，碘伏酒精消毒待開創皮膚，縱向于大腿內側腹股溝部做一長約1.0 cm切口，暴露內側肌肉，鈍性分離股動脈，自股動脈主干近端起進行雙重結扎，后將兩個結扎點中間血管離斷。最后，使用5-0縫合線縫合筋膜層和皮膚層。小鼠右側下肢則切口后縫合。

第二，對照組：小鼠雙側下肢切口后縫合。

三 激光散斑血流成像儀觀察術后小鼠下肢血流量變化

術后第0、7、14天對造模組小鼠進行下肢血流檢測，造模組小鼠進行麻醉，雙下肢剃毛，碘伏酒精消毒，使用激光散斑血流成像儀檢測雙側下肢血流信號，掃描記錄5 s內雙側下肢血流灌注（perfusion unite，PU）值。比較造模組小鼠左側與右側下肢的PU值。

四 術后小鼠行為學觀察與評估

待小鼠適應環境后，每次將小鼠取出置于另一空籠中，手部輕敲鼠籠的一側產生聲響與震動，觀察小鼠活動能力和狀態，對兩組小鼠的反應能力及活動范圍進行綜合評估。觀察記錄人員按照表1的準則進行小鼠活動能力簡易標準化評定。以下計分以2人計分的平均值作為分析數據。

五 Micro-CT掃描觀察小鼠術后脛骨骨量變化

兩組小鼠在術后第28天時，用1.25% 阿佛丁（0.2mL/10克）腹腔注射麻醉，采取頸椎脫臼法處死。使用CT儀（Bruker Skyscan）對小鼠脛骨進行掃描，掃描參數為：旋轉步長0.4，電壓50 kV，像素尺寸9μm，0.5mm鋁制濾波器，源電流500μA。掃描完成后通過利用CTAn和CTVoL軟件對掃描數據進行三維建模分析。選取脛骨遠端生長板上方1～1.5mm骨小梁作為感興趣區域進行分析。我們對骨小梁體積/組織體積（Trabecular Volume/Tissue Volume， BV/TV），骨小梁厚度（Trabecular thickness， Tb.Th），骨小梁數量（Trabecular Number， Tb.N）和骨小梁分離度（Trabecular Separation， Tb.Sp）進行了計算。

六 石蠟切片HE染色觀察兩組小鼠骨量變化

處死小鼠后，我們制作了小鼠的石蠟切片，染色前先進行脫蠟。將切片用蠟筆畫圈后加入蒸餾水水合切片。吸出蒸餾水加入蘇木素染液5 min，蒸餾水漂洗切片，放入分化液分化30 s，漂洗切片。放入伊紅Y染色30 s。染色完成后脫水封片。顯微鏡獲取圖片。

1.4 統計學處理

使用Prism Software 9.5 對實驗數據進行統計分析及量化繪圖。統計方法選用獨立樣本t檢驗。所有實驗數據均以平均值±標準差表示。P值為＜0.05被認為是有統計學上的顯著差異。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析

參與動物實驗的20只小鼠均未死亡，全部進入實驗數據分析。

2.2 股動脈結扎誘導下肢缺血（FAL）小鼠模型的成功構建

研究期間，我們運用激光散斑血流成像儀檢測左股動脈結扎組小鼠雙側下肢血流變化情況，術后，造模組小鼠左側結扎下肢血流信號明顯弱于右側下肢血流信號，左側下肢血管離斷明顯（圖1A）；左側下肢PU值（圖1B）顯著低于右側下肢PU值。同樣地，術后第7、14天左側下肢PU值（圖1C、D）明顯低于右側下肢PU值。基于以上實驗分析，我們認為成功構建了FAL小鼠模型。

A：激光多普勒成像檢測造模組小鼠雙下肢血流變化情況；B-D：造模組小鼠第0、7、14天下肢血流灌注量統計。

2.3 術后兩組小鼠行為學變化

造模組小鼠術后行為學表現為步態紊亂、跛行、舔舐左側下肢及手術切口、左側下肢出現懸掛、活動減少等，且術后的活動能力均隨時間延長而逐漸增強。FAL組小鼠的步態與活動能力于術后第11天基本恢復正常水平，于術后第14天完全恢復對照組小鼠活動水平（圖2）。

2.4 FAL小鼠發生骨丟失

為了評估FAL小鼠骨微結構的變化，我們使用Micro-CT掃描小鼠脛骨并分析了脛骨遠端，結果發現FAL小鼠與對照組相比出現明顯的骨丟失和骨微結構的改變；如（圖3A）所示。骨參數數據的統計學定量分析結果與Micro-CT結果一致，與對照組相比，FAL組BV/TV（圖3B），Tb.N（圖3C）出現明顯下降，Tb.Th（圖3D）沒有顯著的變化趨勢，Tb.Sp（圖3E）明顯升高。這些結果都表明FAL小鼠發生了骨丟失。

A：兩組小鼠左側脛骨Micro-CT的代表性圖像；B-D：兩組小鼠骨微參數BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp定量分析（n=4）。

2.5 FAL小鼠發生骨丟失

同樣地對兩組小鼠骨組織進行了HE染色，與Micro-CT結果一致，造模組小鼠骨量明顯下降（圖4）。

A：兩組小鼠左側脛骨HE染色的代表性圖片（n=4 ）。

結語

血液供應不足導致骨組織細胞處于缺氧環境當中，缺氧是骨質疏松癥和類風濕性關節炎這些疾病的常見特征。此外，已知與缺氧相關的許多因素，包括能量代謝的變化、酸堿平衡等都會影響骨代謝。缺氧導致線粒體能量產生不足和活性氧過多，從而損害線粒體功能，導致骨穩態被破壞[4]。許多證據表明，缺氧誘導途徑在介導骨代謝變化中起著不可或缺的作用。基于相關研究報道，我們猜想下肢血管損傷導致的局部組織缺血缺氧可能會導致骨質疏松癥。

血管的再生是骨再生和骨代謝的一個研究熱點，但缺乏一種能有效模擬股動脈損傷后缺血所致骨質疏松癥的標準化實驗動物模型[5]。目前，動脈結扎缺血模型常被用于心血管疾病研究，但對于血管損傷缺血導致骨質疏松癥的研究鮮有報道[6]。對于下肢由于缺血缺氧導致骨丟失的研究中，尚沒有適宜的造模方法。因此，本研究致力于建立一個穩定模擬下肢動脈血流受阻導致局部缺血缺氧的動物模型。常見的動物如兔、大鼠、小鼠、犬等常作為研究下肢缺血疾病的動物模型[7]。考慮到小鼠具有來源方便、成本低、飼養周期短等優勢，因此以小鼠為下肢缺血誘導骨質疏松癥的動物模型更占據優勢[8]。本實驗選取C57BL/6J小鼠作為研究對象，通過股動脈結扎法造成血供異常、局部骨組織細胞缺血缺氧，成功建立了小鼠股動脈結扎骨質疏松癥模型。

在本實驗，我們通過血流觀測分析在造模后小鼠的第0、7、14 d三個時間點，發現左側下肢的血流灌注量顯著低于右側下肢，這提示血管結扎成功。此外，行為學觀察與評估顯示，造模后小鼠的活動能力有所下降，但在14天后逐漸恢復至正常水平。通過影像學檢查和石蠟切片染色分析，我們觀察到造模組小鼠出現了明顯的骨量丟失，這一發現證實了我們的缺血后骨質疏松癥模型構建成功。這些結果表明，該模型能夠有效地模擬缺血缺氧骨質疏松癥的病理過程，為研究其發病機制及評估治療效果提供了可靠的實驗基礎。這或許能為進一步研究血管損傷缺血導致骨質疏松癥的臨床治療提供新見解、新思路。■

參考文獻：

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收稿日期：24-11-18

基金資助：國家自然科學基金項目（82460434），項目負責人：劉倩

作者簡介：王莉（2000—），女，研究生，研究方向：中草藥單體防治骨質疏松癥疾病的研究。

通訊作者：劉倩。