奶牛結核病PPD皮內變態反應精準檢測技術要點探討

摘要：奶牛結核病檢測中，多采用皮內變態反應，也是目前發布的國家標準之一。本文主要分析了新疆兵團第八師石河子地區在奶牛結核病檢測中存在的一些問題，希望對以后的奶牛結核病檢測工作有所促進和幫助，以保證檢測工作的準確性和科學性，并提出建議，以供同行參考。

關鍵詞：奶牛結核病；PPD；皮內變態反應；精準檢測；要點探討

牛結核病是由結核分枝桿菌引起牛的一種人畜共患傳染病。人的結核病有10%以上是由牛分枝桿菌引起，因此，控制牛結核病是控制人類結核病的重要途徑之一，石河子地區作為新疆奶牛養殖大區，為控制和凈化我區奶牛結核病，采用國內外通用的牛結核病控制策略是從“檢疫－撲殺”。因此，準確檢測是控制和凈化牛結核病的前提。目前廣泛應用的檢測方法包括：提純牛型結核菌素（PPD）、皮內變態反應試驗（TST）、PPD比較皮內變態試驗（SICTT）和牛 γ- 干擾素酶聯免疫吸附試驗（IFN-γ-ELISA）。牛結核病PPD皮內變態反應是我國國標規定的方法之一，也是目前石河子地區實施奶牛全群監測的檢疫方法，在控制與凈化奶牛結核病中發揮著重要作用。本文對基層奶牛結核病頸部皮內變態反應精準監測技術要點分析探討，為今后牛結核病的精準檢測提供參考。

1 PPD皮內變態反應檢測應用現狀

1.1 監測單位的技術能力

新疆兵團第八師石河子市動物疫病預防控制中心具體負責實施第八師石河子市牛結核病檢測預警、風險評估和凈化場創建等技術指導工作。

1.2 監測對象和時間

按第八師牛結核病監測方案要求，根據風險評估，按照“一病一案、一場一策”要求開展監測。

所有種牛、奶牛、肉牛養殖場對20日齡以上牛全群100%結核病檢測；調運牛應來自結核病無疫區或凈化場，調入前在輸出地開展一次牛結核病檢測，調入后應隔離45 d，經再次檢測合格后，方可解除隔離。

牛結核病低風險場（成年牛凈化群）：實行每半年（春、秋季節）用提純牛型結核菌素PPD皮內變態反應試驗進行一次全群監測。

牛結核病高風險場（確診牛結核病的污染牛群）：根據牛場實際感染程度，應用風險評估方案和本場制定的牛結核病防控方案，每隔45 d～90 d應用牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗進行全群檢測，檢出的陽性牛及時進行撲殺并無害化處理，直至最后一次全群為陰性。

2 準備試驗所需的材料試劑

2.1 結核菌素的選擇和使用

試驗的關鍵材料是結核菌素抗原。目前使用的結核菌素為提純牛型結核菌素（PPD）。據資料報道，不同廠家的PPD其反應程度可能不同，即使同一廠家的不同批號、不同劑量的PPD也存在差異，這對結果的判定帶來誤差，在確定檢測結果時應考慮此因素，因此在選擇時應考慮其敏感性和特異性，以確保結果的一致性和準確性；此外，PPD的運輸、保管和使用，應嚴格按照使用說明書的要求進行，使用前確認是否低溫保存和有效期，應觀察瓶蓋無松動、瓶身完整無裂痕、凍干粉未出現潮解、干縮，用真空測定器監測是否真空。配制結核菌素要在實驗室（配藥室）無菌操作，PPD開瓶，必須現配現用、當日使用，隔日不能再用，溶解后有異物的均禁止使用。用過的結核菌素瓶、剩余的結核菌素液及檢測完成后產生的垃圾，包括注射器、針頭、口罩、防護服等應收集起來進行無害化處理。

2.2 詳細記錄檢測信息并建立檔案

記錄畜主姓名、牛耳標號、年齡、繁殖狀態、檢測人、檢測日期、初始皮厚，72 h、96 h、120 h皮厚、皮差等信息，以便通過檔案能對檢疫牛做出綜合判定。

2.3 試劑、耗材及工具

電子數顯卡尺、1 mL藍心注射器、電動剃毛器、配液用一次性注射器、酒精藥棉、0.9%生理鹽水、人員防護用品（膠條防護服、手術手套、防護口罩、醫用防護帽、醫用防護鞋套等）、75%酒精、碘伏、回收廢物生物安全箱等。

3 嚴格操作規程（操作方法）

標準化操作流程是保證實驗質量和數據可比性的關鍵。檢測人員應接受必要的牛結核PPD檢測相關知識培訓，了解牛結核病的基本知識、傳播途徑和防控措施，掌握檢測要點、熟悉操作流程和規范操作，并能準確評估和記錄結果，才能大大提高奶牛PPD試驗的準確率。

3.1 接種部位確定

接種部位的選擇會影響抗原的吸收速度和強度以及測量誤差，直接影響到檢測結果的準確性。按照國標選擇在頸側中部上三分之一處，三個月以內的犢牛，在肩胛部進行，該處測量皮厚和注射較為方便，不同的注射部位結果誤差很大，

若進行比較變態反應，應選擇同一側頸中部2個點，一個在上三分之一處，一個在下三分之一處，2個點之間的距離不得少于15 cm。注射點及周圍的皮膚應無明顯的病變。

3.2 剃毛方法

在注射結核菌素前注射部位必須剃毛，以便于識別注射部位和消毒，做到每次測量皮皺厚度時在同一處進行。在用剃刀、刀片等剃毛時，常引起局部外傷，導致皮膚出現炎性腫脹，建議使用電動剃毛器則方便易行，無上述弊端。剃毛的直徑約10 cm。

3.3 測量皮厚

檢測判定中皮差以毫米計，檢測試驗中微小的差錯都可能導致不同的結果。目前基層使用的是電子卡尺，使用較方便，但注意每一次測量完后要歸零。此外，卡尺夾持皮皺的松緊程度因測量人的不同有所差異，故自始至終要由一人測量，否則造成假陽性或假陰性出現。測量時用左手食指和拇指捏起中央皺皮，卡尺卡口的按壓要適中，防止過緊或過松，盡量減少誤差。

3.4 注射方法及劑量

注射前消毒（75%酒精）要嚴格，防止注射部位的感染。且要等酒精揮發后再注射，以防止注射時酒精隨針頭進入體內刺激腫脹影響結果。一頭牛一個注射器，注射器采用1 mL一次性使用無菌注射器（帶針頭）。注射時，最好用左手食指和拇指捏起中央皺皮，針頭斜著45度角刺入皮膚，或者注射進針時，手腕要控制好，腕部背側緊貼著牛頸部位，防止針尖劃破皮膚。注射部位皮膚應鼓起綠豆大的小泡，表明結核菌素注射成功。如注射失敗，應重新選擇注射部位（對側或者同側15 cm以外的部位），還應做好標記和記錄。注射后如出血應重新換點注射，以避免結核菌素隨血液流出，或出血形成皮內（下）小血腫，影響結果判定。注射劑量嚴格按使用說明書的規定劑量，無論牛只大小，一律皮內注射0.1 mL，不能因為是犢牛和體重偏輕而減量，也不能因為體重較大而加量。另外，也不能稀釋成低濃度或高濃度而加大或減少劑量注射。牛型PPD 0.1 mL（含2 000IU），禽型PPD 0.1 mL（含2 500IU）。抽取PPD時，應注意排除注射器內的氣泡，以減少

誤差。

4 正確掌握判斷標準

按照操作規程72小時觀察結果并測量皮厚，個別牛出現遲發型變態反應，可疑牛和陰性牛在96 h和120 h必須再分別觀察一次。通過觀察注射部位是否有炎性反應、觸摸腫塊是否有結節和皮厚差綜合判定結果。在生產實際中，一些操作人員容易憑借“經驗”判定結果，認為只要接種部位沒有“鼓包”就是正常的，其實不然，有些皮內變態反應會形成明顯的隆起，有些變態反應則是擴散性的，表面看不出異常反應，但實際則出現增厚反應，因此必須借助儀器判定。在此期間，被檢測牛術部也可能因為機械或蚊蟲（尤其在夏、秋季節）叮咬而引起腫脹，在觀察過程中一定要分清。注射部位前后出現明顯的炎性反應，且皮皺厚差值大于或等于4.0 mm時判為陽性；無明顯炎性反應，且皮厚差值為2.0 mm-4.0 mm時判為可疑；無明顯炎性反應，皮厚差值小于或等于2.0 mm時判為陰性[1]。

5 引起非特異性反應的因素

根據本地區的試驗結果，由禽型結核分枝桿菌和副結核及其他分枝桿菌引起的假陽性較低，而奶牛生理性的（發情期、妊娠后期，其敏感性增高）、飼料配合不平衡，日糧中蛋白質飼料過高，或過度飲食酸性飼料、臨床上使用激素、藥物制劑及接種某些疫苗、機體患有某些傳染病或寄生蟲病以及人為操作不當等原因常常可引起假變態反應。因此，在奶牛結核檢測中，對上述因素必須綜合考慮，減少由非特異性因素引起的假變態反應。

6 討論與分析

在奶牛結核病防控和凈化中，采用國標規定的提純牛型結核菌素（PPD）頸部皮內變態反應取得了明顯的成效，該方法的優點是靈敏度高，便于現場操作作業，價格低廉，容易進行判定，缺點是操作費時煩瑣，結果判定主觀性大、存在非特異性高的缺點等，因此造成結果的判定存在一定的誤差。其精準度的提升對于早期診斷和有效防控至關重要。

研究表明，按農業農村部頒發的《牛結核病提純結核菌素變態反應操作規程》，用提純的牛型結核菌素對奶牛進行皮內注射變態反應檢測奶牛結核病時，檢出準確率可達到95%～98％。但如操作不當或不規范，檢出準確率則會大打折扣[2]。

按照《動物結核病診斷技術（GB/T18645-2020）》，20日齡以上的奶牛均應進行監測。但是在實際工作中，60日齡以下的犢牛在實際操作中往往不能100%檢測，存在幼齡犢牛漏檢現象。據資料報道，犢牛年齡越小患病率越高，1個月齡的犢牛患病率占2.46%，3個月齡患病率占0.88%，而6個月齡的僅占0.41%。

在實際工作中，我們觀察到，一些牛型結核菌素變態反應陽性牛，多數營養良好，體壯，臨床無明顯牛結核癥狀或者臨床癥狀不典型，病理學觀察時只從眼觀變化很難全部看到病變，所以單憑肉眼看不到結核病變的牛， 不能盲斷為假陽性牛。可能原因：牛結核病感染初期或輕度感染時，還未發病，可能不出現臨床癥狀；此外，由于皮內結核菌素試驗能夠對結核病提前做出診斷，大部分感染牛在臨床癥狀出現前已被淘汰，因而牛結核病的臨床癥狀很少遇到，通常只有少部分發病后期的牛可觀察到一些與結核病有關的癥狀。這些癥狀隨著體內結節的分布而變化，除少數病例外，病程較慢，在多數情況下，甚至在晚期階段，仍無特征性癥狀。

提純牛型結核菌素（PPD）頸部皮內變態反應試驗可疑牛的復檢時間問題《動物結核病診斷技術（GB/T18645-2020）》中6.3.1c）規定，“對疑似反應牛應立即在另一側以同一批PPD同一劑量進行第二次皮內注射，再經72h觀察反應結果。”據王忠山等報道，用牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應診斷奶牛結核病，對試驗檢出的陽性牛和可疑牛立即用該方法進行復檢試驗檢測，多數牛（87.2%）的變態反應會受到抑制，弱化前次實驗，導致前后檢測結果不一致。由于遲發型變態反應出現滯后效應，不能在一段時間內重復

進行[3]。

關于牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗檢出的陽性牛的處理。根據筆者2019—2020年來對新疆石河子地區4家規模牛場通過牛型提純結核菌素皮內變態反應檢出的475頭陽性牛進行比較，結果表明：牛型結核陽性457頭，符合率在93.18 %-100 %之間，平均96.21 %；禽型結核病的11頭，陽性率在0%～3.57%，平均2.32%。根據以上我們所做的試驗及本地區奶牛場的實際情況，為達到控制和凈化的目的，建議本地區通過牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗檢出的陽性牛不再復檢，直接撲殺或無害化

處理[4]。

嚴格試驗操作規范，減少人為因素的誤判。牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗操作簡單，但需要注意的細節很多，技術人員及相關人員往往因為不規范操作而影響結果的判定，造成不必要的損失。因此，應制定程序化的操作步驟，對技術人員及相關人員進行培訓，要求每人熟練每個環節的操作要領，并對人員合理分工，使檢測工作能夠有條不紊地開展。此外，要做好檢測人員的衛生防護，確保自身安全。

未來的研究應聚焦在以下幾個方向：一是開發新型的、特異性更強的抗原，以提高PPD檢測的性能；二是探索更精準的接種部位，減少測量誤差和非特異性反應；三是建立更為完善的判斷標準，結合多種檢測方法，提高診斷的綜合準確率；四是加強實驗室標準化操作的推廣，確保實驗的可復制性和結果的可靠性。■

參考文獻：

[1] 全國動物衛生標準化技術委員會.動物結核病診斷技術：GB/T18645-2020[S].北京：中國標準出版社，2020.

[2] 姚智深.如何提高奶牛PPD試驗的準確性[J].中國奶牛，2014（6）：58-60.

[3] 王忠山，鄧紅江，劉向鵬，等.短期內進行牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應復檢試驗的結果變化觀察[J].中國獸醫雜志，2013，49（06）：41-43.

[4] 王宏偉，李新萍，李劼，等.新疆石河子地區牛結核病檢測方法的比較研究[J].中國奶牛，2020（07）：33-35.

收稿日期：2024-11-18

基金項目：兵團科技計劃（2023AB009-02）

作者簡介：王宏偉（1968—），男，本科，高級獸醫師。研究方向：動物疫病防控。

*通訊作者：竇立靜（1975—），女，本科，高級獸醫師。研究方向：動物疫病防控。