高效液相色譜-串聯質譜法同時測定植物藥酒中9種有毒生物堿

摘 要：本文建立植物藥酒中9種有毒生物堿的高效液相色譜-串聯質譜分析方法。實驗優化了提取條件、儀器條件等參數，樣品超聲提取、離心后過濾。采用Waters BEH色譜柱分離，在多反應監測模式下測定，外標法定量。結果顯示，在各自范圍內9種生物堿具有良好的線性關系，相關系數R2＞0.99，方法的定量限為2.5～25 μg/L，總體平均回收率＞80%，總體相對偏差＜10%（n =6）。該方法對植物藥酒中9種有毒生物堿快速、準確的測定十分有效。

關鍵詞：植物藥酒，有毒生物堿，HPLC-MS/MS

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-59442025.04.035

0 引 言

我國中草藥資源豐富，使用藥酒養生治病也有著數千年的歷史[1-2]。民間流傳許多藥酒偏方，很多人存在“中藥安全可以隨便吃”的錯誤觀念，因此自制藥酒的現象比較普遍。飲用自制藥酒而導致的中毒事件時有發生，經案例分析可知，此類事件多為誤服植物藥酒中的生物堿所致[3-4]。

生物堿是許多中草藥的有效成分，其具有抗癌、強心、鎮痛、降血壓等生理藥理活性[5]，但部分生物堿毒性大。在中藥不良反應事件中，由生物堿導致中毒的事件所占比重很大，如毛莨科的烏頭含有烏頭堿，衛矛科的雷公藤含有雷公藤甲素等。以烏頭類生物堿為例，口服0.2 mg 就可使人中毒，3～5 mg 即可致死，致死劑量與中毒劑量接近[6]。因此，民間使用含生物堿的藥草自行浸泡藥酒，有著極大的安全隱患。

目前，生物堿的測定方法主要有高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]和液相色譜串聯質譜法等[9-11]，這些方法大多只測定某一種（如烏頭堿）或某一類中幾種生物堿（如莨菪烷類生物堿，莨菪堿、東莨菪堿等）。市場監管總局近年來新發布了《食品補充檢驗方法 BJS201711畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、普魯卡因和利多卡因的測定》《食品補充檢驗方法 BJS202108蜂蜜中雷公藤甲素的測定》，說明國家對有毒生物堿非常重視。本研究在查閱文獻后選擇9種生物堿，這9種生物堿毒性較強，多具有祛濕、鎮痛、降血壓等功效且易為民間使用[3-4，9-10]。開發同時檢測9種生物堿的方法，既有效地應對突發中毒事件中快速篩查引起中毒的物質，又使民眾意識到自行浸泡藥酒的不安全性，規范植物浸泡藥酒領域，為人民群眾生命安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）儀器高效液相色譜-串聯質譜儀129 0 -6470（美國Agilent公司）；minilab全自動稀釋配標儀（美國Labtech公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；Vor tex-5渦旋儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；H-210 0 R高速冷凍離心機（湖南湘潭湘儀儀器有限公司）；超聲波清洗機（江蘇張家港三友超聲設備有限公司）；C18色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×10 0 mm，瑞典SVEA公司）；ACQUII Y UPLC BEH Shield R P18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；InfinitylabPoroshell 120 Ec-C18色譜柱（2.7 μm，2.1mm×100 mm，美國Agilent公司）。

（2）試劑烏頭堿對照品：含量≥97.9%（美國Chromadex）；鉤吻堿對照品：含量≥98%（加拿大TRC公司）；石蒜堿對照品：含量≥99.8%（美國IL公司）；鬼臼素酯對照品：含量≥99.6%（中檢所）；番木鱉堿對照品：含量≥99.2%（德國LGC公司）；雷公藤甲素對照品：含量≥98%（中檢院）；秋水仙堿對照品：含量≥95.4%（英國LGC公司）；東莨菪堿對照品：含量≥99.9%（英國LGC公司）；山莨菪堿對照品：含量≥98%（美國IL公司）；甲醇、乙醇色譜純（德國默克）、甲酸質譜級（日本東京化成工業株式會社）、甲酸銨、氟化銨色譜純（FLUKA）。

1.2 方法

（1）標準溶液制備 標準儲備液：分別稱取適量的烏頭堿、鉤吻堿、石蒜堿、鬼臼素酯、番木鱉堿、雷公藤甲素、秋水仙堿、東莨菪堿、山莨菪堿10 mg置于50 mL容量瓶中，用體積分數為20%的乙醇溶液溶解并定容至刻度線，搖勻，得到質量濃度為200mg/L的儲備液，-20℃避光保存，有效期3個月。根據實驗需要，用20%的乙醇溶液將標準儲備液配制成所需濃度的標準工作曲線，現用現配。

（2） 樣品制備 取樣前將樣品混勻。稱取藥酒2mL于離心管中，超聲，用水定容至10 mL，8000 r/min離心5 min，吸取1.0 mL上清液，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC-MS/MS測試。空白實驗除不加試樣外，均按照上述操作步驟開展。

（3）色譜-質譜條件

1）色譜條件Waters ACQUIIY UPLC BEH ShieldRP18色譜柱（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm）；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣量：2 μL；流動相：A為4.5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液，B為4.5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫。

2 ）質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多反應檢測模式（MRM）；毛細管電壓：4 kV；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：6 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：11 L/min；9種有毒生物堿的質譜參數見表2。

1.3 定量方法的確立

分別向空白基質樣品中添加1、2、10倍定量限3個水平濃度的9種有毒生物堿標準物質，每個水平濃度設置6個平行樣品，按照前處理方法進行實驗測定，外標法定量，驗證方法的回收率及計算相對標準偏差。

1.4 基質效應

基質效應是指樣品中除目標分析物外的其他組分對待測物質的分析過程有顯著干擾、抑制或增強目標分析物響應的現象。采用相對響應值法，定量測定空白基質提取液配制的標準溶液與體積分數為20%乙醇溶液中相同質量濃度待測物的響應值，通過二者的相對比值來評價基質效應：

基質效應 （%）=B/A×100%

其中，A為體積分數為20%乙醇溶液配制標準溶液的響應值；B為空白基質提取液配制標準溶液的響應值。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

通過查閱文獻及實際應用綜合考慮，遇到突發中毒事件時，須快速、準確判斷中毒物質，為臨床的診斷和對癥治療提供可靠依據。植物藥酒的成分為乙醇及少量草本浸出物，可經過稀釋和過濾的方式處理樣液[12-13]。選取不同的溶液對樣品進行稀釋，考察進樣后的分離情況，對比后采取加水稀釋過膜進樣。實驗結果表明，此法能夠得到較好的色譜峰形及分離度。

2.2 質譜測定條件的優化

將9種有毒生物堿標準物質儲備液配制成質量濃度為1 μg/mL的單標溶液，進行質譜測定參數優化。通過對目標物結構式的分析，在正離子模式下更易得到一個H+形成準分子離子峰[M+H]+，因此實驗選擇正離子模式。通過全掃描模式找到母離子，優化碎裂電壓，得到子離子峰，選取豐度較強、干擾較小的離子作為定性、定量離子并優化其碰撞能量。

2.3 色譜柱的選擇及分離條件的優化

通過分析目標物的化學性質，選擇3種色譜柱：Thermo Hypercarb HT （2.1 mm×100 mm，3 μm）；Waters ACQUIIY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm）；Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），對目標物的分離效果做了比較。結果表明，使用Ther mo色譜柱時，雷公藤甲素幾乎沒有基線分離，石蒜堿的峰型拖尾且響應值偏低；使用Agilent色譜柱時，番木鱉堿的峰型拖尾，目標物整體響應值偏低；使用Waters色譜柱時，目標物實現基線分離，整體峰型良好，與其他色譜柱相比響應值最高，因此選擇Waters色譜柱。

本研究分別考察了0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）混合溶液體系作為流動相，對目標物分離情況和離子化情況的影響。結果表明，當含甲醇混合溶液體系作為流動相時，化合物的響應值明顯較高，加入4.5 mmol/L甲酸銨后，化合物峰型明顯改善。因此，確定0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）混合溶液體系作為流動相。

2.4 方法的線性范圍和檢出限、定量限

用20%乙醇溶液配制質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列標準工作溶液。以目標化合物質量濃度為橫坐標，以定量子離子的質譜響應值為縱坐標，得到線性回歸方程，目標物的相關系數R 2均高于0.99。采用加標回收的方法確定方法的檢出限和定量限，分別以3、10倍信噪比為方法的檢出限和定量限。目標物的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限見表3。

2.5 方法的回收率和精密度

采用空白樣品加標的方法進行添加回收率和精密度實驗。在空白樣品中添加低、中、高3個水平的標樣后，然后按照方法進行操作，每個添加水平平行測定6次。同時配制標準系列溶液，計算回收率和相對標準偏差，結果見表4。結果表明，在低、中、高3個添加水平的平均回收率介于85%～120%，相對標準偏差為0.8%～9.0%。表明本方法回收率穩定，可滿足實際樣品的檢測要求。

2.6 基質效應的評價結果

9 種有毒生物堿質量濃度為2 0 μg / L ，平行測定3次。結果顯示，除石蒜堿（43.4%）、鬼臼毒素（122.1%）基質效應較為明顯，其余化合物的基質效應為89.1%～106.8%。

2.7 實際樣品的測定

使用本研究建立的方法，在天津市抽取自制藥酒30份進行測定，目標物均未檢出。抽檢區域分布數據表明，天津市區縣的認可度高于市內六區；抽檢樣品類別數據表明，天津市民眾飲用的藥酒多為滋補類，如人參、枸杞等，暫不涉及具有鎮痛、降血壓等功效的植物藥酒，因此檢出9種有毒生物堿的概率較低。

3 結 論

本研究建立的方法具有操作簡便、準確度高、污染小的特點。在遇到突發中毒事件時，該方法可快速檢測藥酒樣本、準確判斷導致中毒的物質，為臨床的診斷和對癥治療提供可靠檢測依據，同時也為相關監測機構提供技術支撐，有著較高的實際應用價值。

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作者簡介

郭文麗，碩士，高級工程師，研究方向為食品質量與安全。

翟雨佳，通信作者，碩士，高級工程師，研究方向為食品質量與安全。

（責任編輯：張佩玉）