基于微衛星技術的巖羊家域研究

關鍵詞：巖羊；微衛星；家域；最小凸多邊形法；賀蘭山

家域（home range）是動物進行取食、交配和育幼等日常活動的區域，家域為野生動物提供各種必需的生存條件［1］。對野生動物的家域開展研究，有利于了解動物的資源需求、棲息地特征、社會組織結構等生態學和生物學信息［2?3］，對于動物的生存和繁衍、保育和再引種具有重要意義［4?7］。野生動物家域的相關研究一直是國內外學者的研究重點［8?10］。自20世紀70年代起，我國開始重視野生動物家域的研究，主要集中在大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）、川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）、喜馬拉雅小熊貓（Ailurus fulgens）、喜馬拉雅扭角羚（Budorcas taxi?color）和麋鹿（Elaphurus davidianus）等珍稀瀕危物種［11?12］。

微衛星（microsatellite）是以廣泛分布于真核生物基因組的1 ～ 6個核苷酸為單位的短串聯重復序列。微衛星具有核心序列多態性高、側翼序列相對保守的特點，由于微衛星標記有豐富的多態性、較高的穩定性和易于檢測分析等特點，在國內外廣泛地應用于物種的遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構建、群體遺傳結構分析、個體識別、性別鑒定、親緣鑒定以及種質資源保護等方面的研究［13?19］，但結合微衛星技術用于物種家域的研究相對較少［2，20?22］。

巖羊（Pseudois nayaur）是國家二級重點保護野生動物，歷史上巖羊曾遍布整個寧夏，而現在主要集中分布在寧夏賀蘭山區域［23?24］。關于巖羊國內外已經開展了多方面研究，主要集中在種群結構、棲息地選擇利用、食性、行為學以及遺傳多樣性等方面［18?19，25］，而對家域研究較少［26］，主要是因為賀蘭山巖羊生存環境較為險峻，宏觀手段研究其家域較為不易。為提升研究效率，驗證微衛星技術應用于動物家域研究的可行性與準確性，本研究采用微衛星技術對賀蘭山巖羊的家域大小進行研究，并與已有的研究成果比對，以期為巖羊的保護和管理提供更有效的手段。

1 研究區域

寧夏賀蘭山國家級自然保護區（以下簡稱“保護區”）位于寧夏西北部（38°19′—39°22′ N，105°49′—106°41′ E），南北長170 km，東西寬20 ～ 40 km，保護區總面積為193 535. 68 hm2。保護區地處蒙古高原、黃土高原與青藏高原的交界地帶，地跨溫帶草原與荒漠兩大植被區域的交接處，是騰格里、毛烏素、烏蘭布和三大沙漠的分界線，成為我國風沙干旱森林生態系統的典型代表地帶。保護區獨特的地理位置，復雜的地形組合，垂直分布明顯的氣候、土壤等自然因素，使保護區內保存著比較豐富的珍稀、瀕危動植物物種，具有很強的特有性、典型性和珍稀性，具有重要的生態區位和特殊的保護價值。保護區目前記錄到野生維管植物有84科329屬647種，苔蘚植物30科81屬204種，大型真菌259種。賀蘭山在動物地理區劃上屬于古北界中亞亞界蒙新區西部荒漠亞區和東部草原亞區的過渡地帶，共有脊椎動物5綱24目56科139屬218種，其中國家一級重點保護野生動物12 種，國家二級重點保護野生動物41種［27］。

2 研究方法

2. 1 糞便樣品采集

采樣區域位于保護區南端，主要為紫花溝、甘溝、驢路溝以及幾條溝相交區域（圖1）。巖羊糞便樣品采樣時間為2012年8月和9月，此時正是巖羊產仔季后期，雌雄個體還沒有發情聚集，所以較適合研究各亞群巖羊個體的擴散情況。所選區域內各條溝段間為山體，樣線沿著各溝段布設，采集溝底、山坡所遇巖羊糞便，并在采樣處進行GPS定位，記錄周圍植被類型、距水源距離和人為干擾等生境因素。為了避免污染樣品影響試驗結果，在采樣過程中戴口罩、一次性手套，并用已滅菌的牙簽采集糞便樣品。在糞便集堆處，隨機選三四粒分裝到不同采集管中，采集當天樣品用無水乙醇浸泡，置于冰箱中-20 ℃保存，樣品轉移至實驗室后，-80 ℃保存。為了不漏采和重復采樣，采樣時兩人并行，每條樣線只單向記錄1次。為更好地獲得遺傳信息，采集當天的巖羊新鮮糞便，共計222份。

2. 2 巖羊糞便DNA 微衛星篩選

2. 2. 1 引物選擇與合成

由于微衛星位點在近緣物種中具有保守性，所以本研究通過本實驗室已有引物，查閱文獻和公共數據庫NCBI 得到36 個巖羊近緣物種的微衛星位點信息和引物序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并用滅菌雙蒸水配制成濃度為100 μmol/L的儲存液備用。

2. 2. 2 篩選方法

微衛星位點的初步篩選采用PCR擴增的方法，先用36對引物分別對巖羊組織DNA進行擴增，擴增成功的引物再對糞便DNA進行擴增，最后擴增成功的引物再進行進一步篩選，篩選出多態性較好的引物，多肽信息含量（polymorphism information content，PIC） gt; 0. 50為高度多態性，0. 50 ≥ PIC ≥ 0. 25為中度多態性，PIC lt; 0. 25為低度多態性。

PCR 擴增采用15. 0 μL的反應體系：DNA 模板1. 5 μL、Premix Ex Taq 聚合酶（1. 25 U）7. 5 μL、BSA（20 mg/mL；TaKaRa，Otsu，Japan） 0. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1. 0 μL、雙蒸水定容至15. 0 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（溫度因引物而異），72 ℃延伸45 s，35 個循環；最后72 ℃延伸20 min。在使用PCR擴增儀對各引物進行擴增時，設置梯度退火溫度，以尋找各對引物的最適退火溫度。PCR產物經2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后，在凝膠成像系統中觀察擴增效果，并拍照記錄。為了確保結果準確可靠，對每個樣本均重復擴增2次以上，統計2次擴增一致的條帶。

采用毛細管電泳法確定位點的多態性。將初步篩選出的引物重新合成，在上游引物5′端分別標記三色熒光標記FAM、HEX和TAMARA。對222份糞便DNA樣品重新擴增。取5 μL擴增產物進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳（30 min），檢驗PCR反應是否成功。擴增后將PCR產物按比例混合成一組，每組10 ～ 15 μL，低溫送至上海美吉生物醫藥科技有限公司測定等位基因的大小。等位基因結果用GeneMapper v. 4. 0軟件（美國應用生物系統公司）分析。

在測得樣品的基因型數據后，用MicrosatelliteTool kit程序來尋找數據中相匹配的基因型，并且判斷不同的巖羊個體。

2. 3 牙釉蛋白基因PCR 擴增

2. 3. 1 樣品

在采集的巖羊糞便樣品中，選擇至少擴增出一個微衛星位點的樣品，采用牙釉蛋白基因PCR法進行性別鑒定。牙釉蛋白基因PCR擴增的陽性對照采用實驗室已有的17份巖羊組織DNA樣品（提取自野外自然死亡的巖羊），這17份樣品分別于2011年采自寧夏賀蘭山、西藏、青海、甘肅和新疆。另外，還有3份2013年采自上海動物園的巖羊糞便（已知性別）用來檢驗牙釉蛋白基因在巖羊糞便樣品中的有效性。

2. 3. 2 PCR擴增

使用引物SE47（5′-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3′）和SE48（5′-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3′）擴增巖羊糞便DNA 和組織DNA，PCR 擴增采用15. 0 μL 的反應體系：DNA 模板1. 5 μL、Premix ExTaq 聚合酶（1. 25 U） 7. 5 μL、BSA （20 mg/mL； Ta‐KaRa，Otsu，Japan）0. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1. 0 μL、雙蒸水定容至15. 0 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；最后72 ℃延伸7 min。PCR產物經2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（33 min），在凝膠成像系統中觀察擴增效果，拍照記錄。

牙釉蛋白法擴增雄性個體在進行電泳檢測的時候會出現2條條帶，而雌性只出現1條條帶［28］。為了提高準確性，把222份巖羊糞便樣品重復擴增6次，如果其中有2次出現2條條帶，則判定該個體為雄性，否則為雌性。

2. 4 家域分析

根據個體識別和性別鑒定的結果，可以知道個體的重捕次數，選擇重捕數大于4次的個體，根據同一個體不同位置的糞便，利用ArcGIS擴增模塊homerange analysis 中的100% 最小凸多邊形法（minimumconvex polygons，MCP）計算它們的家域面積。采用獨立樣本t 檢驗對雌雄家域的大小進行差異分析。

3 結果

3. 1 巖羊重捕個體篩選

通過9對微衛星引物對222份糞便DNA樣品進行擴增后，共識別出巖羊個體183只，其中有93只雌性個體和90只雄性個體，雌雄比為93∶90=1. 03∶1。詳細實驗過程及結果見文獻［18?19］。

選出重捕數大于4次的6只個體來分析巖羊的家域范圍，其中雌性個體4只（W010、W015、W019、W024），雄性個體2只（W009、W028），6只巖羊個體的位置信息見表1。

3. 2 巖羊個體家域

6只巖羊個體的重捕數為4 ～ 9次，平均重捕次數為5. 17次。采用MPC法計算巖羊個體家域面積（表2）。2只雄性（W009、W028）巖羊個體的家域面積分別為3. 23、0. 10 km2。4 只雌性（W010、W015、W019、W024）巖羊個體的家域面積分別為3. 57、1. 17、2. 72、2. 93 km2。6只巖羊個體的家域范圍基本上全部重疊在一起（圖2）。

對雌雄家域的大小進行差異分析（獨立樣本t 檢驗），結果顯示，雌雄個體家域大小差異不顯著（t =-0. 761，P gt; 0. 05）（表3）。

對重捕次數和面積關系進行分析，并繪制曲線圖。由圖3 可以看出，重捕次數多，面積也相應增加。

4 討論

4. 1 微衛星技術用于家域分析

對動物家域進行估算的基礎是收集其活動位點，而收集活動位點的方法越科學，家域面積估算的準確度則越高［29］。目前，收集動物活動位點的常用方法有直接觀察法、無線電遙測、紅外相機監測、項圈跟蹤以及分子糞便學等［29?34］。其中無線電遙測法因賀蘭山地勢險峻應用比較困難，GPS項圈也因巖羊個體的生活環境不易被捕捉佩戴，紅外相機監測法通過照片進行個體識別目前也存在一定困難，而且家域范圍受相機放置位點影響較大。

基于糞便微衛星DNA分析技術進行野生動物家域研究是解決以上問題的有效手段［29］。國外科學家在20 世紀90 年代已經開始了一些研究，Kohnet al.［35］描述了家域的使用以及父權鑒定和親緣關系鑒定都能用糞便基因型的分布和關系模式來推斷；Taberlet et al.［36］和Smith et al.［37］分別用遺傳學方法對棕熊（Ursus arctos）和胡安捷狐（Vulpes macro?tis mutica）的家域進行了研究，證明了方法的可靠性。近年來，國內研究人員也用糞便微衛星DNA分析技術對物種的家域進行了研究［2，20?22，38］。研究發現，微衛星技術可以應用于物種的家域分析，但是也同樣存在著問題，如當樣品量不足、重捕次數少時，有較多單獨活動的個體家域面積會存在過小的現象［2］；以及在糞便DNA質量比較差的情況下，錯誤的微衛星基因型會對個體鑒定結果造成嚴重的偏差［22］。本研究在采用微衛星技術對巖羊進行家域分析時，也同樣發現了以上兩個問題。此外，采樣區域的地形地貌對采樣的覆蓋程度也影響較大，會間接影響分析出的家域面積的準確性。

4. 2 巖羊家域大小與影響因素

本研究選定6個重捕次數超過4次的個體作為研究巖羊個體家域的對象（4只雌性，2只雄性），雄性家域平均為1. 67 km2，雌性家域平均為2. 60 km2。其中除雄性個體W028家域面積偏小外，其余均與崔多英［26］研究所得的巖羊家域大小相符。本研究巖羊家域大小與其他有蹄類家域大小有所差別，東北馬鹿（Cervus elaphus xanthopygus）雄性家域平均為2. 54 km2，雌性家域平均為1. 69 km2［39］；梅花鹿（Cer?vus nippon）雄性家域為1. 93 km2，雌性為1. 16 km2［40］；白尾鹿（Odocoileus virginianus）的家域為0. 50 km2［41］；南匯東灘獐（Hydropotes inermis）的家域面積均值為6. 71 km2［42］。對比可知，巖羊家域與東北馬鹿家域大小相差不大，相較梅花鹿和白尾鹿的家域偏大，較獐家域偏小。有蹄類動物的體型大小和棲息環境對其家域的大小有很大的影響，尤其是其中的食物資源影響更大，如草原鹿（Ozotoceros bezoarticus）的雌性家域為5. 9 km2，雄性家域為9. 9 km2，這與草原鹿所食食物營養含量低，需要采食更多食物才能滿足需求有關［43］。賀蘭山巖羊分布區域的植物種類較少，可利用低，巖羊需要尋找更多的食物資源來滿足自身的需要，這就使得巖羊相比其他一些有蹄類家域要大。

除食物資源的分布與豐富度影響物種的活動與家域外，環境中其他資源不是廣泛分布時，這種情況對家域的影響會更突出。Pages et al.［44］報道了食土習性對中緬灰葉猴（Trachypithecus melamera）活動范圍的影響，由于食土地點不在正常的家域范圍之內，所以致使猴群的活動范圍由不采食土壤的73. 7 hm2增加到93. 4 hm2。本研究地點處于賀蘭山較為干旱的區域，水資源較為稀缺，研究區域內有兩處水源，分別位于圖2中家域范圍的最上頂點以及左下頂點，這也證明了水資源的分布會影響巖羊的家域范圍。

4. 3 巖羊雌雄個體家域大小差異

本研究中雌雄巖羊家域面積差異不顯著，從個體家域大小角度比較，雌性W010家域最大，這與其他有蹄類研究不同，在黑麂（Muntiacus crinifrons）、梅花鹿和馬鹿等有蹄類的研究中，雄性的家域均大于雌性，原因是雄性個體需通過擴大家域面積來滿足自身的需求［2，38，45?46］，但因本研究數據量有限，且巖羊是偏雌擴散的物種［47］，如果采樣采集到擴散中的糞便樣品，也會導致家域偏大，所以雌性家域是否偏大有待進一步驗證。本研究6只巖羊個體家域有重疊，有研究表明巖羊是有家域但是沒有領域性的動物［26］，所以雌雄個體間存在家域重疊屬于正常現象。

基于微衛星技術的動物家域研究，避免了對野生動物及其生存環境的干擾和破壞，這對于珍稀瀕危動物的保護和管理非常重要。對于傳統家域方法較難開展的研究，糞便分子生物學及微衛星技術是一種有效的研究手段。本研究在研究過程中還存在很多問題有待優化和解決，如用作家域分析的個體數較少，分析出的結果可能存在一定偏差；采樣時間未覆蓋全年，可能會導致分析結果未能完全反映實際家域大小；提取DNA對糞便樣品要求較高，在采集樣品時會有篩選舍棄，導致采樣損失；無法保證所有個體的所有糞便均被采到，盡管已經對研究區域進行了仔細的搜尋，但難免會有遺漏，所以也可能導致結果有偏差，在結果分析中個體家域隨著重捕次數增加而有所增大也說明了這點。這些是今后應用分子生物學手段研究物種家域需要去解決的問題。