基于微衛(wèi)星技術(shù)的巖羊家域研究

關(guān)鍵詞：巖羊；微衛(wèi)星；家域；最小凸多邊形法；賀蘭山

家域（home range）是動(dòng)物進(jìn)行取食、交配和育幼等日常活動(dòng)的區(qū)域，家域?yàn)橐吧鷦?dòng)物提供各種必需的生存條件［1］。對野生動(dòng)物的家域開展研究，有利于了解動(dòng)物的資源需求、棲息地特征、社會(huì)組織結(jié)構(gòu)等生態(tài)學(xué)和生物學(xué)信息［2?3］，對于動(dòng)物的生存和繁衍、保育和再引種具有重要意義［4?7］。野生動(dòng)物家域的相關(guān)研究一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)［8?10］。自20世紀(jì)70年代起，我國開始重視野生動(dòng)物家域的研究，主要集中在大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）、川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）、喜馬拉雅小熊貓（Ailurus fulgens）、喜馬拉雅扭角羚（Budorcas taxi?color）和麋鹿（Elaphurus davidianus）等珍稀瀕危物種［11?12］。

微衛(wèi)星（microsatellite）是以廣泛分布于真核生物基因組的1 ～ 6個(gè)核苷酸為單位的短串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星具有核心序列多態(tài)性高、側(cè)翼序列相對保守的特點(diǎn)，由于微衛(wèi)星標(biāo)記有豐富的多態(tài)性、較高的穩(wěn)定性和易于檢測分析等特點(diǎn)，在國內(nèi)外廣泛地應(yīng)用于物種的遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、個(gè)體識別、性別鑒定、親緣鑒定以及種質(zhì)資源保護(hù)等方面的研究［13?19］，但結(jié)合微衛(wèi)星技術(shù)用于物種家域的研究相對較少［2，20?22］。

巖羊（Pseudois nayaur）是國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，歷史上巖羊曾遍布整個(gè)寧夏，而現(xiàn)在主要集中分布在寧夏賀蘭山區(qū)域［23?24］。關(guān)于巖羊國內(nèi)外已經(jīng)開展了多方面研究，主要集中在種群結(jié)構(gòu)、棲息地選擇利用、食性、行為學(xué)以及遺傳多樣性等方面［18?19，25］，而對家域研究較少［26］，主要是因?yàn)橘R蘭山巖羊生存環(huán)境較為險(xiǎn)峻，宏觀手段研究其家域較為不易。為提升研究效率，驗(yàn)證微衛(wèi)星技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物家域研究的可行性與準(zhǔn)確性，本研究采用微衛(wèi)星技術(shù)對賀蘭山巖羊的家域大小進(jìn)行研究，并與已有的研究成果比對，以期為巖羊的保護(hù)和管理提供更有效的手段。

1 研究區(qū)域

寧夏賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)（以下簡稱“保護(hù)區(qū)”）位于寧夏西北部（38°19′—39°22′ N，105°49′—106°41′ E），南北長170 km，東西寬20 ～ 40 km，保護(hù)區(qū)總面積為193 535. 68 hm2。保護(hù)區(qū)地處蒙古高原、黃土高原與青藏高原的交界地帶，地跨溫帶草原與荒漠兩大植被區(qū)域的交接處，是騰格里、毛烏素、烏蘭布和三大沙漠的分界線，成為我國風(fēng)沙干旱森林生態(tài)系統(tǒng)的典型代表地帶。保護(hù)區(qū)獨(dú)特的地理位置，復(fù)雜的地形組合，垂直分布明顯的氣候、土壤等自然因素，使保護(hù)區(qū)內(nèi)保存著比較豐富的珍稀、瀕危動(dòng)植物物種，具有很強(qiáng)的特有性、典型性和珍稀性，具有重要的生態(tài)區(qū)位和特殊的保護(hù)價(jià)值。保護(hù)區(qū)目前記錄到野生維管植物有84科329屬647種，苔蘚植物30科81屬204種，大型真菌259種。賀蘭山在動(dòng)物地理區(qū)劃上屬于古北界中亞亞界蒙新區(qū)西部荒漠亞區(qū)和東部草原亞區(qū)的過渡地帶，共有脊椎動(dòng)物5綱24目56科139屬218種，其中國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物12 種，國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物41種［27］。

2 研究方法

2. 1 糞便樣品采集

采樣區(qū)域位于保護(hù)區(qū)南端，主要為紫花溝、甘溝、驢路溝以及幾條溝相交區(qū)域（圖1）。巖羊糞便樣品采樣時(shí)間為2012年8月和9月，此時(shí)正是巖羊產(chǎn)仔季后期，雌雄個(gè)體還沒有發(fā)情聚集，所以較適合研究各亞群巖羊個(gè)體的擴(kuò)散情況。所選區(qū)域內(nèi)各條溝段間為山體，樣線沿著各溝段布設(shè)，采集溝底、山坡所遇巖羊糞便，并在采樣處進(jìn)行GPS定位，記錄周圍植被類型、距水源距離和人為干擾等生境因素。為了避免污染樣品影響試驗(yàn)結(jié)果，在采樣過程中戴口罩、一次性手套，并用已滅菌的牙簽采集糞便樣品。在糞便集堆處，隨機(jī)選三四粒分裝到不同采集管中，采集當(dāng)天樣品用無水乙醇浸泡，置于冰箱中-20 ℃保存，樣品轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室后，-80 ℃保存。為了不漏采和重復(fù)采樣，采樣時(shí)兩人并行，每條樣線只單向記錄1次。為更好地獲得遺傳信息，采集當(dāng)天的巖羊新鮮糞便，共計(jì)222份。

2. 2 巖羊糞便DNA 微衛(wèi)星篩選

2. 2. 1 引物選擇與合成

由于微衛(wèi)星位點(diǎn)在近緣物種中具有保守性，所以本研究通過本實(shí)驗(yàn)室已有引物，查閱文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫NCBI 得到36 個(gè)巖羊近緣物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息和引物序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并用滅菌雙蒸水配制成濃度為100 μmol/L的儲(chǔ)存液備用。

2. 2. 2 篩選方法

微衛(wèi)星位點(diǎn)的初步篩選采用PCR擴(kuò)增的方法，先用36對引物分別對巖羊組織DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的引物再對糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增，最后擴(kuò)增成功的引物再進(jìn)行進(jìn)一步篩選，篩選出多態(tài)性較好的引物，多肽信息含量（polymorphism information content，PIC） gt; 0. 50為高度多態(tài)性，0. 50 ≥ PIC ≥ 0. 25為中度多態(tài)性，PIC lt; 0. 25為低度多態(tài)性。

PCR 擴(kuò)增采用15. 0 μL的反應(yīng)體系：DNA 模板1. 5 μL、Premix Ex Taq 聚合酶（1. 25 U）7. 5 μL、BSA（20 mg/mL；TaKaRa，Otsu，Japan） 0. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1. 0 μL、雙蒸水定容至15. 0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（溫度因引物而異），72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。在使用PCR擴(kuò)增儀對各引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，設(shè)置梯度退火溫度，以尋找各對引物的最適退火溫度。PCR產(chǎn)物經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增效果，并拍照記錄。為了確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對每個(gè)樣本均重復(fù)擴(kuò)增2次以上，統(tǒng)計(jì)2次擴(kuò)增一致的條帶。

采用毛細(xì)管電泳法確定位點(diǎn)的多態(tài)性。將初步篩選出的引物重新合成，在上游引物5′端分別標(biāo)記三色熒光標(biāo)記FAM、HEX和TAMARA。對222份糞便DNA樣品重新擴(kuò)增。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳（30 min），檢驗(yàn)PCR反應(yīng)是否成功。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物按比例混合成一組，每組10 ～ 15 μL，低溫送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定等位基因的大小。等位基因結(jié)果用GeneMapper v. 4. 0軟件（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）分析。

在測得樣品的基因型數(shù)據(jù)后，用MicrosatelliteTool kit程序來尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型，并且判斷不同的巖羊個(gè)體。

2. 3 牙釉蛋白基因PCR 擴(kuò)增

2. 3. 1 樣品

在采集的巖羊糞便樣品中，選擇至少擴(kuò)增出一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的樣品，采用牙釉蛋白基因PCR法進(jìn)行性別鑒定。牙釉蛋白基因PCR擴(kuò)增的陽性對照采用實(shí)驗(yàn)室已有的17份巖羊組織DNA樣品（提取自野外自然死亡的巖羊），這17份樣品分別于2011年采自寧夏賀蘭山、西藏、青海、甘肅和新疆。另外，還有3份2013年采自上海動(dòng)物園的巖羊糞便（已知性別）用來檢驗(yàn)牙釉蛋白基因在巖羊糞便樣品中的有效性。

2. 3. 2 PCR擴(kuò)增

使用引物SE47（5′-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3′）和SE48（5′-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3′）擴(kuò)增巖羊糞便DNA 和組織DNA，PCR 擴(kuò)增采用15. 0 μL 的反應(yīng)體系：DNA 模板1. 5 μL、Premix ExTaq 聚合酶（1. 25 U） 7. 5 μL、BSA （20 mg/mL； Ta‐KaRa，Otsu，Japan）0. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1. 0 μL、雙蒸水定容至15. 0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（33 min），在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增效果，拍照記錄。

牙釉蛋白法擴(kuò)增雄性個(gè)體在進(jìn)行電泳檢測的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)2條條帶，而雌性只出現(xiàn)1條條帶［28］。為了提高準(zhǔn)確性，把222份巖羊糞便樣品重復(fù)擴(kuò)增6次，如果其中有2次出現(xiàn)2條條帶，則判定該個(gè)體為雄性，否則為雌性。

2. 4 家域分析

根據(jù)個(gè)體識別和性別鑒定的結(jié)果，可以知道個(gè)體的重捕次數(shù)，選擇重捕數(shù)大于4次的個(gè)體，根據(jù)同一個(gè)體不同位置的糞便，利用ArcGIS擴(kuò)增模塊homerange analysis 中的100% 最小凸多邊形法（minimumconvex polygons，MCP）計(jì)算它們的家域面積。采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)對雌雄家域的大小進(jìn)行差異分析。

3 結(jié)果

3. 1 巖羊重捕個(gè)體篩選

通過9對微衛(wèi)星引物對222份糞便DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，共識別出巖羊個(gè)體183只，其中有93只雌性個(gè)體和90只雄性個(gè)體，雌雄比為93∶90=1. 03∶1。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果見文獻(xiàn)［18?19］。

選出重捕數(shù)大于4次的6只個(gè)體來分析巖羊的家域范圍，其中雌性個(gè)體4只（W010、W015、W019、W024），雄性個(gè)體2只（W009、W028），6只巖羊個(gè)體的位置信息見表1。

3. 2 巖羊個(gè)體家域

6只巖羊個(gè)體的重捕數(shù)為4 ～ 9次，平均重捕次數(shù)為5. 17次。采用MPC法計(jì)算巖羊個(gè)體家域面積（表2）。2只雄性（W009、W028）巖羊個(gè)體的家域面積分別為3. 23、0. 10 km2。4 只雌性（W010、W015、W019、W024）巖羊個(gè)體的家域面積分別為3. 57、1. 17、2. 72、2. 93 km2。6只巖羊個(gè)體的家域范圍基本上全部重疊在一起（圖2）。

對雌雄家域的大小進(jìn)行差異分析（獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)），結(jié)果顯示，雌雄個(gè)體家域大小差異不顯著（t =-0. 761，P gt; 0. 05）（表3）。

對重捕次數(shù)和面積關(guān)系進(jìn)行分析，并繪制曲線圖。由圖3 可以看出，重捕次數(shù)多，面積也相應(yīng)增加。

4 討論

4. 1 微衛(wèi)星技術(shù)用于家域分析

對動(dòng)物家域進(jìn)行估算的基礎(chǔ)是收集其活動(dòng)位點(diǎn)，而收集活動(dòng)位點(diǎn)的方法越科學(xué)，家域面積估算的準(zhǔn)確度則越高［29］。目前，收集動(dòng)物活動(dòng)位點(diǎn)的常用方法有直接觀察法、無線電遙測、紅外相機(jī)監(jiān)測、項(xiàng)圈跟蹤以及分子糞便學(xué)等［29?34］。其中無線電遙測法因賀蘭山地勢險(xiǎn)峻應(yīng)用比較困難，GPS項(xiàng)圈也因巖羊個(gè)體的生活環(huán)境不易被捕捉佩戴，紅外相機(jī)監(jiān)測法通過照片進(jìn)行個(gè)體識別目前也存在一定困難，而且家域范圍受相機(jī)放置位點(diǎn)影響較大。

基于糞便微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)進(jìn)行野生動(dòng)物家域研究是解決以上問題的有效手段［29］。國外科學(xué)家在20 世紀(jì)90 年代已經(jīng)開始了一些研究，Kohnet al.［35］描述了家域的使用以及父權(quán)鑒定和親緣關(guān)系鑒定都能用糞便基因型的分布和關(guān)系模式來推斷；Taberlet et al.［36］和Smith et al.［37］分別用遺傳學(xué)方法對棕熊（Ursus arctos）和胡安捷狐（Vulpes macro?tis mutica）的家域進(jìn)行了研究，證明了方法的可靠性。近年來，國內(nèi)研究人員也用糞便微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)對物種的家域進(jìn)行了研究［2，20?22，38］。研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星技術(shù)可以應(yīng)用于物種的家域分析，但是也同樣存在著問題，如當(dāng)樣品量不足、重捕次數(shù)少時(shí)，有較多單獨(dú)活動(dòng)的個(gè)體家域面積會(huì)存在過小的現(xiàn)象［2］；以及在糞便DNA質(zhì)量比較差的情況下，錯(cuò)誤的微衛(wèi)星基因型會(huì)對個(gè)體鑒定結(jié)果造成嚴(yán)重的偏差［22］。本研究在采用微衛(wèi)星技術(shù)對巖羊進(jìn)行家域分析時(shí)，也同樣發(fā)現(xiàn)了以上兩個(gè)問題。此外，采樣區(qū)域的地形地貌對采樣的覆蓋程度也影響較大，會(huì)間接影響分析出的家域面積的準(zhǔn)確性。

4. 2 巖羊家域大小與影響因素

本研究選定6個(gè)重捕次數(shù)超過4次的個(gè)體作為研究巖羊個(gè)體家域的對象（4只雌性，2只雄性），雄性家域平均為1. 67 km2，雌性家域平均為2. 60 km2。其中除雄性個(gè)體W028家域面積偏小外，其余均與崔多英［26］研究所得的巖羊家域大小相符。本研究巖羊家域大小與其他有蹄類家域大小有所差別，東北馬鹿（Cervus elaphus xanthopygus）雄性家域平均為2. 54 km2，雌性家域平均為1. 69 km2［39］；梅花鹿（Cer?vus nippon）雄性家域?yàn)?. 93 km2，雌性為1. 16 km2［40］；白尾鹿（Odocoileus virginianus）的家域?yàn)?. 50 km2［41］；南匯東灘獐（Hydropotes inermis）的家域面積均值為6. 71 km2［42］。對比可知，巖羊家域與東北馬鹿家域大小相差不大，相較梅花鹿和白尾鹿的家域偏大，較獐家域偏小。有蹄類動(dòng)物的體型大小和棲息環(huán)境對其家域的大小有很大的影響，尤其是其中的食物資源影響更大，如草原鹿（Ozotoceros bezoarticus）的雌性家域?yàn)?. 9 km2，雄性家域?yàn)?. 9 km2，這與草原鹿所食食物營養(yǎng)含量低，需要采食更多食物才能滿足需求有關(guān)［43］。賀蘭山巖羊分布區(qū)域的植物種類較少，可利用低，巖羊需要尋找更多的食物資源來滿足自身的需要，這就使得巖羊相比其他一些有蹄類家域要大。

除食物資源的分布與豐富度影響物種的活動(dòng)與家域外，環(huán)境中其他資源不是廣泛分布時(shí)，這種情況對家域的影響會(huì)更突出。Pages et al.［44］報(bào)道了食土習(xí)性對中緬灰葉猴（Trachypithecus melamera）活動(dòng)范圍的影響，由于食土地點(diǎn)不在正常的家域范圍之內(nèi)，所以致使猴群的活動(dòng)范圍由不采食土壤的73. 7 hm2增加到93. 4 hm2。本研究地點(diǎn)處于賀蘭山較為干旱的區(qū)域，水資源較為稀缺，研究區(qū)域內(nèi)有兩處水源，分別位于圖2中家域范圍的最上頂點(diǎn)以及左下頂點(diǎn)，這也證明了水資源的分布會(huì)影響巖羊的家域范圍。

4. 3 巖羊雌雄個(gè)體家域大小差異

本研究中雌雄巖羊家域面積差異不顯著，從個(gè)體家域大小角度比較，雌性W010家域最大，這與其他有蹄類研究不同，在黑麂（Muntiacus crinifrons）、梅花鹿和馬鹿等有蹄類的研究中，雄性的家域均大于雌性，原因是雄性個(gè)體需通過擴(kuò)大家域面積來滿足自身的需求［2，38，45?46］，但因本研究數(shù)據(jù)量有限，且?guī)r羊是偏雌擴(kuò)散的物種［47］，如果采樣采集到擴(kuò)散中的糞便樣品，也會(huì)導(dǎo)致家域偏大，所以雌性家域是否偏大有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究6只巖羊個(gè)體家域有重疊，有研究表明巖羊是有家域但是沒有領(lǐng)域性的動(dòng)物［26］，所以雌雄個(gè)體間存在家域重疊屬于正常現(xiàn)象。

基于微衛(wèi)星技術(shù)的動(dòng)物家域研究，避免了對野生動(dòng)物及其生存環(huán)境的干擾和破壞，這對于珍稀瀕危動(dòng)物的保護(hù)和管理非常重要。對于傳統(tǒng)家域方法較難開展的研究，糞便分子生物學(xué)及微衛(wèi)星技術(shù)是一種有效的研究手段。本研究在研究過程中還存在很多問題有待優(yōu)化和解決，如用作家域分析的個(gè)體數(shù)較少，分析出的結(jié)果可能存在一定偏差；采樣時(shí)間未覆蓋全年，可能會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果未能完全反映實(shí)際家域大??；提取DNA對糞便樣品要求較高，在采集樣品時(shí)會(huì)有篩選舍棄，導(dǎo)致采樣損失；無法保證所有個(gè)體的所有糞便均被采到，盡管已經(jīng)對研究區(qū)域進(jìn)行了仔細(xì)的搜尋，但難免會(huì)有遺漏，所以也可能導(dǎo)致結(jié)果有偏差，在結(jié)果分析中個(gè)體家域隨著重捕次數(shù)增加而有所增大也說明了這點(diǎn)。這些是今后應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究物種家域需要去解決的問題。