基于DNA宏條形碼技術的賀蘭山地區赤狐冬夏季食性分析

關鍵詞：赤狐；野生動物食性；高通量測序；賀蘭山

動物食性能夠反映動物與生境之間的關聯性，并在一定程度上能夠反映當地物種的多樣性。動物食性研究是了解環境與動物以及捕食者與被捕食者相互關系的前提，也是構建棲息地利用模型、研究疾病傳播、評估物種生存壓力和生物多樣性等諸多熱點問題的基礎［1?4］。例如，動物采食植物促進了植物授粉及種子擴散等生態過程［5］；在探究全球氣候變化下的動物食性影響研究中，結合環境因子對動物食性進行預測，模擬了動物應對全球變暖的取食策略等［6］。

食性研究方法對于結果的精確度直接關系到野生動物保護的實踐。高通量測序技術因具有精準度高、數據量龐大等優點，被廣泛應用到野生動物的食性分析中。其對糞便中的DNA片段長度要求較低，即使極少量的DNA序列也能被檢測到，這有助于完善野生動物食譜。作為食肉目（Carnivora）中分布最廣泛的一科，近年來利用該技術對犬科（Canidae）動物食性的研究發展迅速。邵昕寧等［7］對四川甘孜藏族自治州的食肉動物糞便DNA進行分析，顯示赤狐（Vulpes vulpes）的主要食物為嚙齒目（Rodentia）和兔形目（Lagomorpha）動物；金森龍等［8］采用DNA 宏條形碼技術得出臥龍國家級自然保護區內赤狐主要捕食小型嚙齒類動物且沒有優勢性食物；鐘華［9］對珠峰地區食肉動物的食性研究顯示，該地區赤狐食物來源主要是嚙齒目和雞形目（Galliformes）動物，而與其同域分布的狼（Canis lupus）主要以巖羊（Pseudoisnayaur）、灰尾兔（Lepus oiostolus）和紅原雞（Gallusgallus）為食，灰尾兔和部分有蹄類動物則是狗的主要食物；鄭佳鑫等［10］對四川甘孜州的藏狐（Vulpes fer?rilata）食性進行DNA宏條形碼測序和顯微觀察，結果顯示其食物組成包括嚙齒類、鳥類、有蹄類、魚類以及昆蟲和植物。可以看出，DNA宏條形碼技術在動物食性分析中高效且精準，可為地區性生物多樣性調查和食物鏈（網）的健康研究提供基礎的技術參考。

赤狐，體型中等，廣泛分布在歐亞大陸、非洲北部和北美地區［11?13］，在生態系統中作為常見的中級捕食者角色。赤狐是典型的“機會主義捕食者”，多以小型嚙齒類、鳥類、昆蟲、腐肉以及植物種子為食［14?15］，常排便于嚙齒類洞口處及灌叢中，該行為具有領土及食物標記作用［16］。作為賀蘭山地區的優勢捕食者，赤狐種群數量龐大且分布廣泛。孫兆惠［17］通過糞便纖維分析法得出，在資源短缺的秋冬季，賀蘭山地區雜食性的赤狐主要以酸棗（Ziziphus jujubavar. spinosa）為食，其對酸棗種子的傳播以及對酸棗林斑塊具有聯通作用。然而上述研究對赤狐的食性了解不全面，且方法比較傳統。本研究采用高通量測序技術對賀蘭山國家級自然保護區赤狐食性進行研究，以期完善該區域赤狐種群食性的基礎信息，為評估該物種的生存狀況及制定保護管理策略提供科學依據。

1 研究區域

研究區域位于賀蘭山國家級自然保護區（38°18′—39°23′ N，105°38′—106°49′ E），寧夏平原與阿拉善高原之間，屬陰山山系。地貌呈東仰西傾，西坡長而緩，溝谷較小，東坡短而陡，溝道狹長。該區域屬于典型的大陸性氣候，冬季寒冷而漫長，夏季炎熱而短暫，年平均氣溫為-0. 7 ℃，極端高溫可達25. 4 ℃，極端低溫可達-32. 6 ℃，年降水量130. 2 ～395. 9 mm，大風及沙塵天氣頻繁［18］。保護區內植被垂直地帶性分布明顯，隨海拔升高，植被類型依次為荒漠草原、疏林灌叢、山地森林和高山灌叢草甸［19?20］。獨特的地理位置、氣候環境以及地形特征，孕育了豐富多樣的動植物。分布的獸類還有巖羊、阿拉善馬鹿（Cervus elaphus alashanicus）、馬麝（Moschus chrysogaster）、鵝喉羚（Gazella subgut?turosa）、赤狐、亞洲狗獾（Meles leucurus）、石貂（Mar?tes foina）、草兔（Lepus capensis）和賀蘭山鼠兔（Ochotona argentata）等［21］。

2 研究方法

2. 1 樣品采集及糞便DNA 提取

依據賀蘭山地形和溝道走向，從南至北依次均勻布設樣線19 條。于2020—2021 年夏季（2020 年6—7 月）和冬季（2021 年1—2 月）搜尋赤狐新鮮糞便，置于50 mL采樣管中，并立即放入冰箱中-20 ℃保存以進行下一步處理。同時，記錄樣品采集的位點、海拔和坡度等信息。

依據食肉目動物糞便形態特征，通過肉眼鑒定，在研究地區共收集21 份食肉目動物糞便，運用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（51604）（Qiagen，Germany）試劑盒提取糞便中的DNA。首先利用一代測序Sanger技術，使用脊椎動物16S通用引物（F：5′-GAGAAGACCCTATGGAGC-3′，R：5′-ATAGAAACCGACCTGGAT-3′）從21份糞樣中鑒定出15份赤狐糞樣（肉眼鑒定成功率71%）；再分別使用植物rbcL基因引物（F：5′-CTTACCAGYCTTGATCGTTACAAAGG-3′；R：5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3′）和脊椎動物線粒體12S rRNA V5通用引物（F：5′-TAGAACAGGCTCCTCTAG-3′；R：5′-TTAGATACCCCACTATGC-3′）對15份赤狐糞樣進行PCR擴增。在植物rbcL基因引物擴增中，15份赤狐糞樣共成功擴增13份，其中夏季9份（XZCH1—XZCH9），冬季4份（DZCH1—DZCH4）；在脊椎動物線粒體12S rRNA V5通用引物擴增中，15份赤狐糞樣共成功擴增8份，其中夏季4份（XDCH1—XDCH4），冬季4 份（DDCH1—DDCH4），因此分別從動物性、植物性食物兩個角度討論赤狐的食物組成。獲得的PCR 產物經Illumina MiSeq/HiSeq雙端測序得到原始序列。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司操作完成。

2. 2 測序數據處理

原始序列經質控后，使用QIIME2（v2019. 4）進行序列剪切、拼接和降噪，將相似度為99%的多條序列聚類為一個可操作分類單元（operational taxonomicunit，OTU），以降低后續物種注釋的運算量。將OTU代表序列與國際生命條形碼計劃數據庫（thebarcode of life data system，BOLD）或NCBI 中的BLAST 程序檢索目標片段進行比對得到OTU 的物種分類信息。

2. 3 數據分析

在對OTU結果進行篩選后，明確賀蘭山地區赤狐食物組成種類以及各科、屬的相對豐度（relativeabundance），計算α 多樣性指數（Richness、Shannon-Wiener、Simpson、Pielou、Chao1、ACE）、食物生態位寬度和Schoener食物重疊指數，量化赤狐的食物多樣性、食物生態位寬度和食物重疊程度［22?24］，計算公式如下。

由于本研究樣本量均小于50，因此對每組數據首先進行Shapiro-Wilk檢驗，當P gt; 0. 05時，表示呈正態分布，采用獨立樣本t檢驗；當P lt; 0. 05時，表示不符合正態分布，采用兩個獨立樣本U檢驗比較兩組差異。

3 結果

3. 1 賀蘭山地區赤狐食物組成

在科水平上，柏科（Cupressaceae）、鼠李科（Rhamnaceae）、葡萄科（Vitaceae）和薔薇科（Rosaceae）是赤狐在賀蘭山地區的主要取食植物，占比達66. 72%（圖1A）。其中，相對豐度占比大于5. 00%的植物依次為柏科（26. 25%）、鼠李科（18. 85%）、葡萄科（12. 55%）、薔薇科（9. 07%）、菊科（Asteraceae，6. 28%）、豆科（Fabaceae，5. 80%）和蕁麻科（Urticaceae，5. 22%）。在屬水平上，刺柏屬（Juniperus）、棗屬（Ziziphus）、葡萄屬（Vitis）和薔薇屬（Rosa）為赤狐主要取食植物種類，占比達65. 52%（圖1B）。其中，相對豐度占比大于5. 00% 的植物依次為刺柏屬（26. 25%）、棗屬（18. 82%）、葡萄屬（12. 55%）、薔薇屬（7. 90%）和榆屬（Ulmus，5. 20%）。

在赤狐取食的動物種類組成中，在科水平上，相對豐度前5 位的為牛科（Bovidae，74. 77%）、鳩鴿科（Columbidae，14. 76%）、鹿科（Cervidae，3. 47%）、松鼠科（Sciuridae，3. 26%）和鼬科（Mustelidae，1. 34%）動物。其中，牛科和鳩鴿科為赤狐在賀蘭山地區的主要動物食物來源，占總豐度一半以上（圖2A）。在屬水平上，相對豐度前5 位的分別是巖羊屬（Pseu?dois，74. 19%）、鴿屬（Columba，14. 76%）、鹿屬（Cer?vus，3. 46%）、黃鼠屬（Spermophilus，3. 22%）和狗獾屬（Meles，1. 33%）動物。這與科水平結果相對應，赤狐主要以巖羊屬和鴿屬作為主要動物性食物（圖2B）。

3. 2 賀蘭山地區赤狐食物組成的季節性差異

赤狐取食植物在夏、冬兩季存在一定差異。在科水平上，赤狐夏季主要取食柏科（28. 98%）、葡萄科（16. 32%）、鼠李科（15. 52%）和薔薇科（11. 33%）植物，占72. 15%；冬季主要取食鼠李科（29. 87%）、蕁麻科（17. 98%）、柏科（17. 19%）和菊科（10. 87%）植物，占75. 91%（圖3A）。在屬水平上，赤狐夏季主要取食刺柏屬（28. 98%）、葡萄屬（16. 32%）、棗屬（15. 51%）和薔薇屬（10. 05%）植物，占70. 86%；冬季主要取食棗屬（29. 79%）、榆屬（17. 96%）和刺柏屬（17. 19%）植物，占64. 94%（圖3B）。

赤狐取食動物在夏、冬兩季存在較大差異。在科水平上，赤狐夏季主要取食鳩鴿科（74. 74%）、松鼠科（16. 66%）、牛科（4. 86%）和雉科（Phasianidae，2. 00%）動物，占98. 26%；冬季主要取食牛科（91. 78%）和鹿科（4. 31%）動物，占96. 09%（圖4A）。在屬水平上，赤狐夏季主要取食鴿屬（74. 74%）、黃鼠屬（16. 44%）和巖羊屬（4. 80%）動物，占95. 98%；冬季主要取食巖羊屬（91. 07%）和鹿屬（4. 30%）動物，占95. 37%（圖4B）。

3. 3 賀蘭山地區赤狐食物多樣性的季節性差異

分別對夏季9份和冬季4份赤狐糞便樣本中的植物性食物OTU進行多樣性計算（表1），兩者僅在Richness 指數上存在顯著差異（P lt; 0. 05），冬季（35. 75 ± 11. 44）明顯高于夏季（18. 11 ± 14. 24），其他指數均不存在顯著差異（P gt; 0. 05）。夏季植物性食物生態位寬度（2. 76 ± 1. 59）低于冬季（3. 65 ±2. 03），但差異不顯著（P = 0. 476）。經計算，赤狐在夏季和冬季的植物性食物Schoener食物重疊指數為0. 68，屬于重度相似。

分別對夏季4份和冬季4份赤狐糞便樣本中的動物性食物OTU進行多樣性計算（表2），兩者各多樣性指數均不存在顯著差異（P gt; 0. 05）。與植物性食物相似，夏季動物性食物生態位寬度（1. 58 ±0. 45）低于冬季（2. 48 ± 1. 09），差異不顯著（P =0. 203）。赤狐在夏季和冬季的動物性食物Schoener食物重疊指數為0. 76，高于植物性食物，屬于重度相似。

4 討論

4. 1 赤狐食性分析方法

高通量測序技術作為目前較為前沿的測序技術，廣泛應用于野生動物食性研究中，采用DNA宏條形碼技術并借助生物學信息統計的高通量食性研究具有傳統鏡檢法等無法比擬的優勢［25?26］。采用較短的條形碼設計出的通用引物使本身易降解的DNA更容易被擴增和檢測，降低了對糞便樣本的要求同時提高了檢測精確度，且高通量測序技術相較于傳統食性研究技術具有較高的靈敏度，許多傳統檢測方法無法發現的食物種類可通過高通量測序技術檢測出，在野生動物糞便中存在的微量食物物種也易被擴增和發現，有助于完善某一物種的食譜及捕食食物的種類。同時，高通量測序中單次檢測樣本可以產生較大的數據量，對于需要檢測多個樣本的研究，可以大大縮短時間成本并得到更精確的結果。

本研究通過DNA宏條形碼技術對賀蘭山地區分布的主要中級捕食者赤狐的食性進行了本底調查，對于本研究區域的捕食者來說，精確地對捕食者進行分子食性分析，可以從食物資源利用等方面為該地區中小型哺乳類捕食者的共存機制提供參考，有助于保護當地生態系統功能及生物多樣性。

4. 2 赤狐食物組成

本研究通過對拾取的赤狐糞便進行DNA提取，并分別使用動物、植物引物進行PCR擴增，共成功鑒定出13份植物性食物樣本和8份動物性食物樣本。與劉新平［27］在內蒙古對赤狐食性研究中的兔類等小型嚙齒類動物（出現率達76%以上）是赤狐的主要食物種類的研究結果不同，赤狐作為典型的“機會主義捕食者”的雜食性動物，從本研究的食物組成結果看也是如此，但可能由于不同地形以及捕食獵物的難度等原因，在內蒙古草原上可能更容易捕捉到嚙齒類動物，但在復雜山地中捕食嚙齒類動物難度較大，相比來講，捕食警惕性不高的環頸雉（Phasianus col?chicus）或牛科動物幼崽等更為容易。鳥類也是赤狐在賀蘭山地區的主要動物性食物，這與Dell’Arte etal.［28］在芬蘭西部對赤狐主要獵物的研究結果類似，松雞（Tetrao urogallus）和野兔經常被赤狐捕食，同時還有松鼠科等其他嚙齒類動物。

在國內外對于赤狐的食物組成研究中，大多數研究發現動物性食物占比相對較高，植物性食物占比波動較大（0～100%），且動物性食物生物貢獻量遠高于植物性食物［29］，林宣龍等［30］在準噶爾盆地對赤狐食性分析中未發現有植物性食物組成，這可能與分布區域不同有關。在本研究中，赤狐采食的植物性食物主要包括刺柏屬、棗屬、葡萄屬和薔薇屬等，這與賀蘭山實地情況有關，由于近幾年在賀蘭山沖積扇以外區域有大量葡萄酒廠被引入，廣泛種植葡萄（Vitis vinifera），導致賀蘭山周圍葡萄產量劇增，使得赤狐更容易找到并取食，其次酸棗作為賀蘭山優勢植物，夏、秋兩季的果實可供赤狐等小型哺乳類動物及小型鳥類為食，這與孫兆惠［17］在賀蘭山地區赤狐對酸棗種子傳播影響機制的研究結果相同，酸棗是赤狐主要取食的植物，但由于近幾年周邊開始種植葡萄，所以葡萄與酸棗同樣都是赤狐主要取食的植物。

4. 3 赤狐食物組成的季節性差異

本研究對赤狐在夏季和冬季的食物多樣性差異進行分析，發現冬夏季赤狐取食種類呈現不同，多樣性指數僅在植物取食上呈現出冬季多樣性比夏季高的情況。從赤狐不同季節的生境偏好來看，賀蘭山地區冬季食物資源匱乏，赤狐會擴大活動區域，尋找食物豐富度相對較高的地方尋找食物資源。冬季喬木樹葉落盡，只剩枝干，不能再為赤狐提供良好的隱蔽場所，而灌木盡管也會枯萎，但枝干錯綜復雜，仍可以為赤狐提供隱蔽條件，同時也為赤狐提供了更多的可食植物種類從而導致冬季植物性食物比動物性食物多樣性更高［31］。

在拾取赤狐糞便的過程中發現，冬季在距離裸巖距離稍遠一點的區域極易發現赤狐足跡，這是因為山腳邊避風，未被雪覆蓋的區域還可以為赤狐提供隱蔽條件。因此赤狐會選擇距離喬木距離遠、喬木密度低、距灌木距離近、距裸巖距離遠和隱蔽級較高的生境類型。這與朱澤宇［32］在賀蘭山開展赤狐生境選擇研究的結果具有一定的相似性。赤狐偏好活動在以酸棗、旱榆（Ulmus glaucescens）等為主的植被附近，以便在食物匱乏的季節能找到果腹之物。赤狐全年活動在海拔較低的下坡位地區，這與赤狐的食性有關，赤狐為雜食性動物，巖羊尸體、鳥類、小型嚙齒類動物、昆蟲和酸棗等漿果都在其取食之列，這些食物資源大多分布在低海拔地區，因此赤狐也較多活動在低海拔地區［33］。

4. 4 保護建議

通過對賀蘭山地區赤狐的夏季、冬季取食組成和多樣性調查發現，夏、冬季赤狐取食存在很大的相似性，本研究通過對赤狐在賀蘭山地區所處的食物生態位以及捕食者角色，提出如下建議：首先，嚴格監控保護區周邊環境，減少人為干擾，加強保護宣傳力度；其次，加強對賀蘭山地區赤狐取食植被的保護，并及時對赤狐種群數量動態變化進行監測；最后，目前賀蘭山地區流浪狗種群正不斷擴大，很可能對赤狐種群等同級捕食者帶來影響，需進一步對赤狐在賀蘭山地區的種群受威脅因素進行分析，以便有效保護赤狐種群。