基于DNA宏條形碼技術(shù)的賀蘭山地區(qū)赤狐冬夏季食性分析

關(guān)鍵詞：赤狐；野生動(dòng)物食性；高通量測序；賀蘭山

動(dòng)物食性能夠反映動(dòng)物與生境之間的關(guān)聯(lián)性，并在一定程度上能夠反映當(dāng)?shù)匚锓N的多樣性。動(dòng)物食性研究是了解環(huán)境與動(dòng)物以及捕食者與被捕食者相互關(guān)系的前提，也是構(gòu)建棲息地利用模型、研究疾病傳播、評估物種生存壓力和生物多樣性等諸多熱點(diǎn)問題的基礎(chǔ)［1?4］。例如，動(dòng)物采食植物促進(jìn)了植物授粉及種子擴(kuò)散等生態(tài)過程［5］；在探究全球氣候變化下的動(dòng)物食性影響研究中，結(jié)合環(huán)境因子對動(dòng)物食性進(jìn)行預(yù)測，模擬了動(dòng)物應(yīng)對全球變暖的取食策略等［6］。

食性研究方法對于結(jié)果的精確度直接關(guān)系到野生動(dòng)物保護(hù)的實(shí)踐。高通量測序技術(shù)因具有精準(zhǔn)度高、數(shù)據(jù)量龐大等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到野生動(dòng)物的食性分析中。其對糞便中的DNA片段長度要求較低，即使極少量的DNA序列也能被檢測到，這有助于完善野生動(dòng)物食譜。作為食肉目（Carnivora）中分布最廣泛的一科，近年來利用該技術(shù)對犬科（Canidae）動(dòng)物食性的研究發(fā)展迅速。邵昕寧等［7］對四川甘孜藏族自治州的食肉動(dòng)物糞便DNA進(jìn)行分析，顯示赤狐（Vulpes vulpes）的主要食物為嚙齒目（Rodentia）和兔形目（Lagomorpha）動(dòng)物；金森龍等［8］采用DNA 宏條形碼技術(shù)得出臥龍國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)赤狐主要捕食小型嚙齒類動(dòng)物且沒有優(yōu)勢性食物；鐘華［9］對珠峰地區(qū)食肉動(dòng)物的食性研究顯示，該地區(qū)赤狐食物來源主要是嚙齒目和雞形目（Galliformes）動(dòng)物，而與其同域分布的狼（Canis lupus）主要以巖羊（Pseudoisnayaur）、灰尾兔（Lepus oiostolus）和紅原雞（Gallusgallus）為食，灰尾兔和部分有蹄類動(dòng)物則是狗的主要食物；鄭佳鑫等［10］對四川甘孜州的藏狐（Vulpes fer?rilata）食性進(jìn)行DNA宏條形碼測序和顯微觀察，結(jié)果顯示其食物組成包括嚙齒類、鳥類、有蹄類、魚類以及昆蟲和植物。可以看出，DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)物食性分析中高效且精準(zhǔn)，可為地區(qū)性生物多樣性調(diào)查和食物鏈（網(wǎng)）的健康研究提供基礎(chǔ)的技術(shù)參考。

赤狐，體型中等，廣泛分布在歐亞大陸、非洲北部和北美地區(qū)［11?13］，在生態(tài)系統(tǒng)中作為常見的中級捕食者角色。赤狐是典型的“機(jī)會(huì)主義捕食者”，多以小型嚙齒類、鳥類、昆蟲、腐肉以及植物種子為食［14?15］，常排便于嚙齒類洞口處及灌叢中，該行為具有領(lǐng)土及食物標(biāo)記作用［16］。作為賀蘭山地區(qū)的優(yōu)勢捕食者，赤狐種群數(shù)量龐大且分布廣泛。孫兆惠［17］通過糞便纖維分析法得出，在資源短缺的秋冬季，賀蘭山地區(qū)雜食性的赤狐主要以酸棗（Ziziphus jujubavar. spinosa）為食，其對酸棗種子的傳播以及對酸棗林斑塊具有聯(lián)通作用。然而上述研究對赤狐的食性了解不全面，且方法比較傳統(tǒng)。本研究采用高通量測序技術(shù)對賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)赤狐食性進(jìn)行研究，以期完善該區(qū)域赤狐種群食性的基礎(chǔ)信息，為評估該物種的生存狀況及制定保護(hù)管理策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)域

研究區(qū)域位于賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)（38°18′—39°23′ N，105°38′—106°49′ E），寧夏平原與阿拉善高原之間，屬陰山山系。地貌呈東仰西傾，西坡長而緩，溝谷較小，東坡短而陡，溝道狹長。該區(qū)域?qū)儆诘湫偷拇箨懶詺夂?，冬季寒冷而漫長，夏季炎熱而短暫，年平均氣溫為-0. 7 ℃，極端高溫可達(dá)25. 4 ℃，極端低溫可達(dá)-32. 6 ℃，年降水量130. 2 ～395. 9 mm，大風(fēng)及沙塵天氣頻繁［18］。保護(hù)區(qū)內(nèi)植被垂直地帶性分布明顯，隨海拔升高，植被類型依次為荒漠草原、疏林灌叢、山地森林和高山灌叢草甸［19?20］。獨(dú)特的地理位置、氣候環(huán)境以及地形特征，孕育了豐富多樣的動(dòng)植物。分布的獸類還有巖羊、阿拉善馬鹿（Cervus elaphus alashanicus）、馬麝（Moschus chrysogaster）、鵝喉羚（Gazella subgut?turosa）、赤狐、亞洲狗獾（Meles leucurus）、石貂（Mar?tes foina）、草兔（Lepus capensis）和賀蘭山鼠兔（Ochotona argentata）等［21］。

2 研究方法

2. 1 樣品采集及糞便DNA 提取

依據(jù)賀蘭山地形和溝道走向，從南至北依次均勻布設(shè)樣線19 條。于2020—2021 年夏季（2020 年6—7 月）和冬季（2021 年1—2 月）搜尋赤狐新鮮糞便，置于50 mL采樣管中，并立即放入冰箱中-20 ℃保存以進(jìn)行下一步處理。同時(shí)，記錄樣品采集的位點(diǎn)、海拔和坡度等信息。

依據(jù)食肉目動(dòng)物糞便形態(tài)特征，通過肉眼鑒定，在研究地區(qū)共收集21 份食肉目動(dòng)物糞便，運(yùn)用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（51604）（Qiagen，Germany）試劑盒提取糞便中的DNA。首先利用一代測序Sanger技術(shù)，使用脊椎動(dòng)物16S通用引物（F：5′-GAGAAGACCCTATGGAGC-3′，R：5′-ATAGAAACCGACCTGGAT-3′）從21份糞樣中鑒定出15份赤狐糞樣（肉眼鑒定成功率71%）；再分別使用植物rbcL基因引物（F：5′-CTTACCAGYCTTGATCGTTACAAAGG-3′；R：5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3′）和脊椎動(dòng)物線粒體12S rRNA V5通用引物（F：5′-TAGAACAGGCTCCTCTAG-3′；R：5′-TTAGATACCCCACTATGC-3′）對15份赤狐糞樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在植物rbcL基因引物擴(kuò)增中，15份赤狐糞樣共成功擴(kuò)增13份，其中夏季9份（XZCH1—XZCH9），冬季4份（DZCH1—DZCH4）；在脊椎動(dòng)物線粒體12S rRNA V5通用引物擴(kuò)增中，15份赤狐糞樣共成功擴(kuò)增8份，其中夏季4份（XDCH1—XDCH4），冬季4 份（DDCH1—DDCH4），因此分別從動(dòng)物性、植物性食物兩個(gè)角度討論赤狐的食物組成。獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)Illumina MiSeq/HiSeq雙端測序得到原始序列。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司操作完成。

2. 2 測序數(shù)據(jù)處理

原始序列經(jīng)質(zhì)控后，使用QIIME2（v2019. 4）進(jìn)行序列剪切、拼接和降噪，將相似度為99%的多條序列聚類為一個(gè)可操作分類單元（operational taxonomicunit，OTU），以降低后續(xù)物種注釋的運(yùn)算量。將OTU代表序列與國際生命條形碼計(jì)劃數(shù)據(jù)庫（thebarcode of life data system，BOLD）或NCBI 中的BLAST 程序檢索目標(biāo)片段進(jìn)行比對得到OTU 的物種分類信息。

2. 3 數(shù)據(jù)分析

在對OTU結(jié)果進(jìn)行篩選后，明確賀蘭山地區(qū)赤狐食物組成種類以及各科、屬的相對豐度（relativeabundance），計(jì)算α 多樣性指數(shù)（Richness、Shannon-Wiener、Simpson、Pielou、Chao1、ACE）、食物生態(tài)位寬度和Schoener食物重疊指數(shù)，量化赤狐的食物多樣性、食物生態(tài)位寬度和食物重疊程度［22?24］，計(jì)算公式如下。

由于本研究樣本量均小于50，因此對每組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，當(dāng)P gt; 0. 05時(shí)，表示呈正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；當(dāng)P lt; 0. 05時(shí)，表示不符合正態(tài)分布，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本U檢驗(yàn)比較兩組差異。

3 結(jié)果

3. 1 賀蘭山地區(qū)赤狐食物組成

在科水平上，柏科（Cupressaceae）、鼠李科（Rhamnaceae）、葡萄科（Vitaceae）和薔薇科（Rosaceae）是赤狐在賀蘭山地區(qū)的主要取食植物，占比達(dá)66. 72%（圖1A）。其中，相對豐度占比大于5. 00%的植物依次為柏科（26. 25%）、鼠李科（18. 85%）、葡萄科（12. 55%）、薔薇科（9. 07%）、菊科（Asteraceae，6. 28%）、豆科（Fabaceae，5. 80%）和蕁麻科（Urticaceae，5. 22%）。在屬水平上，刺柏屬（Juniperus）、棗屬（Ziziphus）、葡萄屬（Vitis）和薔薇屬（Rosa）為赤狐主要取食植物種類，占比達(dá)65. 52%（圖1B）。其中，相對豐度占比大于5. 00% 的植物依次為刺柏屬（26. 25%）、棗屬（18. 82%）、葡萄屬（12. 55%）、薔薇屬（7. 90%）和榆屬（Ulmus，5. 20%）。

在赤狐取食的動(dòng)物種類組成中，在科水平上，相對豐度前5 位的為牛科（Bovidae，74. 77%）、鳩鴿科（Columbidae，14. 76%）、鹿科（Cervidae，3. 47%）、松鼠科（Sciuridae，3. 26%）和鼬科（Mustelidae，1. 34%）動(dòng)物。其中，牛科和鳩鴿科為赤狐在賀蘭山地區(qū)的主要?jiǎng)游锸澄飦碓矗伎傌S度一半以上（圖2A）。在屬水平上，相對豐度前5 位的分別是巖羊?qū)伲≒seu?dois，74. 19%）、鴿屬（Columba，14. 76%）、鹿屬（Cer?vus，3. 46%）、黃鼠屬（Spermophilus，3. 22%）和狗獾屬（Meles，1. 33%）動(dòng)物。這與科水平結(jié)果相對應(yīng)，赤狐主要以巖羊?qū)俸网潓僮鳛橹饕獎(jiǎng)游镄允澄铮▓D2B）。

3. 2 賀蘭山地區(qū)赤狐食物組成的季節(jié)性差異

赤狐取食植物在夏、冬兩季存在一定差異。在科水平上，赤狐夏季主要取食柏科（28. 98%）、葡萄科（16. 32%）、鼠李科（15. 52%）和薔薇科（11. 33%）植物，占72. 15%；冬季主要取食鼠李科（29. 87%）、蕁麻科（17. 98%）、柏科（17. 19%）和菊科（10. 87%）植物，占75. 91%（圖3A）。在屬水平上，赤狐夏季主要取食刺柏屬（28. 98%）、葡萄屬（16. 32%）、棗屬（15. 51%）和薔薇屬（10. 05%）植物，占70. 86%；冬季主要取食棗屬（29. 79%）、榆屬（17. 96%）和刺柏屬（17. 19%）植物，占64. 94%（圖3B）。

赤狐取食動(dòng)物在夏、冬兩季存在較大差異。在科水平上，赤狐夏季主要取食鳩鴿科（74. 74%）、松鼠科（16. 66%）、牛科（4. 86%）和雉科（Phasianidae，2. 00%）動(dòng)物，占98. 26%；冬季主要取食?？疲?1. 78%）和鹿科（4. 31%）動(dòng)物，占96. 09%（圖4A）。在屬水平上，赤狐夏季主要取食鴿屬（74. 74%）、黃鼠屬（16. 44%）和巖羊?qū)伲?. 80%）動(dòng)物，占95. 98%；冬季主要取食巖羊?qū)伲?1. 07%）和鹿屬（4. 30%）動(dòng)物，占95. 37%（圖4B）。

3. 3 賀蘭山地區(qū)赤狐食物多樣性的季節(jié)性差異

分別對夏季9份和冬季4份赤狐糞便樣本中的植物性食物OTU進(jìn)行多樣性計(jì)算（表1），兩者僅在Richness 指數(shù)上存在顯著差異（P lt; 0. 05），冬季（35. 75 ± 11. 44）明顯高于夏季（18. 11 ± 14. 24），其他指數(shù)均不存在顯著差異（P gt; 0. 05）。夏季植物性食物生態(tài)位寬度（2. 76 ± 1. 59）低于冬季（3. 65 ±2. 03），但差異不顯著（P = 0. 476）。經(jīng)計(jì)算，赤狐在夏季和冬季的植物性食物Schoener食物重疊指數(shù)為0. 68，屬于重度相似。

分別對夏季4份和冬季4份赤狐糞便樣本中的動(dòng)物性食物OTU進(jìn)行多樣性計(jì)算（表2），兩者各多樣性指數(shù)均不存在顯著差異（P gt; 0. 05）。與植物性食物相似，夏季動(dòng)物性食物生態(tài)位寬度（1. 58 ±0. 45）低于冬季（2. 48 ± 1. 09），差異不顯著（P =0. 203）。赤狐在夏季和冬季的動(dòng)物性食物Schoener食物重疊指數(shù)為0. 76，高于植物性食物，屬于重度相似。

4 討論

4. 1 赤狐食性分析方法

高通量測序技術(shù)作為目前較為前沿的測序技術(shù)，廣泛應(yīng)用于野生動(dòng)物食性研究中，采用DNA宏條形碼技術(shù)并借助生物學(xué)信息統(tǒng)計(jì)的高通量食性研究具有傳統(tǒng)鏡檢法等無法比擬的優(yōu)勢［25?26］。采用較短的條形碼設(shè)計(jì)出的通用引物使本身易降解的DNA更容易被擴(kuò)增和檢測，降低了對糞便樣本的要求同時(shí)提高了檢測精確度，且高通量測序技術(shù)相較于傳統(tǒng)食性研究技術(shù)具有較高的靈敏度，許多傳統(tǒng)檢測方法無法發(fā)現(xiàn)的食物種類可通過高通量測序技術(shù)檢測出，在野生動(dòng)物糞便中存在的微量食物物種也易被擴(kuò)增和發(fā)現(xiàn)，有助于完善某一物種的食譜及捕食食物的種類。同時(shí)，高通量測序中單次檢測樣本可以產(chǎn)生較大的數(shù)據(jù)量，對于需要檢測多個(gè)樣本的研究，可以大大縮短時(shí)間成本并得到更精確的結(jié)果。

本研究通過DNA宏條形碼技術(shù)對賀蘭山地區(qū)分布的主要中級捕食者赤狐的食性進(jìn)行了本底調(diào)查，對于本研究區(qū)域的捕食者來說，精確地對捕食者進(jìn)行分子食性分析，可以從食物資源利用等方面為該地區(qū)中小型哺乳類捕食者的共存機(jī)制提供參考，有助于保護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)功能及生物多樣性。

4. 2 赤狐食物組成

本研究通過對拾取的赤狐糞便進(jìn)行DNA提取，并分別使用動(dòng)物、植物引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共成功鑒定出13份植物性食物樣本和8份動(dòng)物性食物樣本。與劉新平［27］在內(nèi)蒙古對赤狐食性研究中的兔類等小型嚙齒類動(dòng)物（出現(xiàn)率達(dá)76%以上）是赤狐的主要食物種類的研究結(jié)果不同，赤狐作為典型的“機(jī)會(huì)主義捕食者”的雜食性動(dòng)物，從本研究的食物組成結(jié)果看也是如此，但可能由于不同地形以及捕食獵物的難度等原因，在內(nèi)蒙古草原上可能更容易捕捉到嚙齒類動(dòng)物，但在復(fù)雜山地中捕食嚙齒類動(dòng)物難度較大，相比來講，捕食警惕性不高的環(huán)頸雉（Phasianus col?chicus）或?？苿?dòng)物幼崽等更為容易。鳥類也是赤狐在賀蘭山地區(qū)的主要?jiǎng)游镄允澄?，這與Dell’Arte etal.［28］在芬蘭西部對赤狐主要獵物的研究結(jié)果類似，松雞（Tetrao urogallus）和野兔經(jīng)常被赤狐捕食，同時(shí)還有松鼠科等其他嚙齒類動(dòng)物。

在國內(nèi)外對于赤狐的食物組成研究中，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物性食物占比相對較高，植物性食物占比波動(dòng)較大（0～100%），且動(dòng)物性食物生物貢獻(xiàn)量遠(yuǎn)高于植物性食物［29］，林宣龍等［30］在準(zhǔn)噶爾盆地對赤狐食性分析中未發(fā)現(xiàn)有植物性食物組成，這可能與分布區(qū)域不同有關(guān)。在本研究中，赤狐采食的植物性食物主要包括刺柏屬、棗屬、葡萄屬和薔薇屬等，這與賀蘭山實(shí)地情況有關(guān)，由于近幾年在賀蘭山?jīng)_積扇以外區(qū)域有大量葡萄酒廠被引入，廣泛種植葡萄（Vitis vinifera），導(dǎo)致賀蘭山周圍葡萄產(chǎn)量劇增，使得赤狐更容易找到并取食，其次酸棗作為賀蘭山優(yōu)勢植物，夏、秋兩季的果實(shí)可供赤狐等小型哺乳類動(dòng)物及小型鳥類為食，這與孫兆惠［17］在賀蘭山地區(qū)赤狐對酸棗種子傳播影響機(jī)制的研究結(jié)果相同，酸棗是赤狐主要取食的植物，但由于近幾年周邊開始種植葡萄，所以葡萄與酸棗同樣都是赤狐主要取食的植物。

4. 3 赤狐食物組成的季節(jié)性差異

本研究對赤狐在夏季和冬季的食物多樣性差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)冬夏季赤狐取食種類呈現(xiàn)不同，多樣性指數(shù)僅在植物取食上呈現(xiàn)出冬季多樣性比夏季高的情況。從赤狐不同季節(jié)的生境偏好來看，賀蘭山地區(qū)冬季食物資源匱乏，赤狐會(huì)擴(kuò)大活動(dòng)區(qū)域，尋找食物豐富度相對較高的地方尋找食物資源。冬季喬木樹葉落盡，只剩枝干，不能再為赤狐提供良好的隱蔽場所，而灌木盡管也會(huì)枯萎，但枝干錯(cuò)綜復(fù)雜，仍可以為赤狐提供隱蔽條件，同時(shí)也為赤狐提供了更多的可食植物種類從而導(dǎo)致冬季植物性食物比動(dòng)物性食物多樣性更高［31］。

在拾取赤狐糞便的過程中發(fā)現(xiàn)，冬季在距離裸巖距離稍遠(yuǎn)一點(diǎn)的區(qū)域極易發(fā)現(xiàn)赤狐足跡，這是因?yàn)樯侥_邊避風(fēng)，未被雪覆蓋的區(qū)域還可以為赤狐提供隱蔽條件。因此赤狐會(huì)選擇距離喬木距離遠(yuǎn)、喬木密度低、距灌木距離近、距裸巖距離遠(yuǎn)和隱蔽級較高的生境類型。這與朱澤宇［32］在賀蘭山開展赤狐生境選擇研究的結(jié)果具有一定的相似性。赤狐偏好活動(dòng)在以酸棗、旱榆（Ulmus glaucescens）等為主的植被附近，以便在食物匱乏的季節(jié)能找到果腹之物。赤狐全年活動(dòng)在海拔較低的下坡位地區(qū)，這與赤狐的食性有關(guān)，赤狐為雜食性動(dòng)物，巖羊尸體、鳥類、小型嚙齒類動(dòng)物、昆蟲和酸棗等漿果都在其取食之列，這些食物資源大多分布在低海拔地區(qū)，因此赤狐也較多活動(dòng)在低海拔地區(qū)［33］。

4. 4 保護(hù)建議

通過對賀蘭山地區(qū)赤狐的夏季、冬季取食組成和多樣性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，夏、冬季赤狐取食存在很大的相似性，本研究通過對赤狐在賀蘭山地區(qū)所處的食物生態(tài)位以及捕食者角色，提出如下建議：首先，嚴(yán)格監(jiān)控保護(hù)區(qū)周邊環(huán)境，減少人為干擾，加強(qiáng)保護(hù)宣傳力度；其次，加強(qiáng)對賀蘭山地區(qū)赤狐取食植被的保護(hù)，并及時(shí)對赤狐種群數(shù)量動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測；最后，目前賀蘭山地區(qū)流浪狗種群正不斷擴(kuò)大，很可能對赤狐種群等同級捕食者帶來影響，需進(jìn)一步對赤狐在賀蘭山地區(qū)的種群受威脅因素進(jìn)行分析，以便有效保護(hù)赤狐種群。