馬鹿鹿茸原代前軟骨與軟骨細(xì)胞電穿孔法轉(zhuǎn)染研究

關(guān)鍵詞：電穿孔轉(zhuǎn)染；鹿茸原代細(xì)胞；質(zhì)粒；電轉(zhuǎn)染效率；細(xì)胞存活率

在細(xì)胞與分子生物學(xué)研究中，細(xì)胞膜是外源生物大分子導(dǎo)入細(xì)胞的主要屏障［1］。1982 年，Neumannet al.［2］在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中第1次利用電穿孔傳遞基因。其原理是通過將細(xì)胞暴露于脈沖電場(chǎng)中來提高細(xì)胞膜的通透性，從而將RNA、DNA、肽或小分子跨膜傳輸，遞送到細(xì)胞以及整個(gè)組織和生物體中［3］。基于此原理形成的電轉(zhuǎn)染技術(shù)為將外源核酸大分子轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞提供了一種非常重要的方法。目前常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀和電穿孔轉(zhuǎn)染（簡稱“電轉(zhuǎn)染”）等［4］。其中，電轉(zhuǎn)染技術(shù)憑借簡單、方便、重復(fù)性好和高效率等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于導(dǎo)入報(bào)告基因進(jìn)行標(biāo)記指示或者具體的靶標(biāo)功能基因研究，也常用于導(dǎo)入化學(xué)藥物、蛋白和抗體等其他分子，以觀察其對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理功能變化的影響和機(jī)制探究［5］。

鹿茸是大多數(shù)鹿科（Cervidae）動(dòng)物（除馴鹿Rangifer tarandus 外）雄性個(gè)體第二性征，鹿茸是在雄鹿進(jìn)入發(fā)情期前生成，每年更新一次［6］。它是目前所知哺乳動(dòng)物中唯一可以周期性再生的器官。鹿茸再生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)可能是干細(xì)胞［7?8］，但目前仍然具有爭論［9?10］。廣大研究者一直以來都把鹿茸的生長發(fā)育和再生機(jī)理作為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［11］。從組織學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的角度看，整個(gè)鹿茸再生過程包括創(chuàng)傷修復(fù)、軟骨生成、骨生成和礦化等復(fù)雜的過程［12?13］，因而再生鹿茸已成為研究哺乳動(dòng)物器官再生機(jī)理的重要模型。由于軟骨生成是鹿茸快速再生期的核心事件之一，研究人員前期對(duì)其開展了大量研究［14?15］。鹿茸前軟骨和軟骨組織在表觀遺傳學(xué)上存在顯著差異，甲基化研究顯示涉及軟骨生成的6 個(gè)關(guān)鍵基因（TNFRSF11B、TRPV4、HYAL2、MMP16、EIF2A 和SCIN）基因組甲基化水平在鹿茸前軟骨和軟骨組織中表達(dá)差異顯著［16］，2種組織RNA-Seq 分析進(jìn)一步證實(shí)上述基因表達(dá)存在差異，提示鹿茸軟骨再生存在尚未發(fā)現(xiàn)的新調(diào)控機(jī)理［17］。這些發(fā)現(xiàn)迫切需要在細(xì)胞水平上開展研究證實(shí)。

原代細(xì)胞是指從活體動(dòng)物器官或組織中新鮮分離出來并在體外立即進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞［18］，由于它們可以很好地反映細(xì)胞在體時(shí)的生物學(xué)特性，因而用于遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等試驗(yàn)研究，可以獲得與在體生理功能更接近的數(shù)據(jù)結(jié)果。部分研究團(tuán)隊(duì)使用鹿茸原代細(xì)胞開展研究已取得了較大進(jìn)展。Zhonget al.［19］研究發(fā)現(xiàn)使用IGF-1處理鹿原代軟骨細(xì)胞可以上調(diào)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)基因的表達(dá)。Zhou et al.［20］使用TGF-β 對(duì)鹿茸原代軟骨細(xì)胞刺激，進(jìn)一步揭示TGF-β 信號(hào)通路具有通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分化和ECM合成來促進(jìn)軟骨生成的功能。Liu et al.［21］利用CRISPR-Cas9慢病毒載體敲除梅花鹿（Cervus nippon）鹿茸TGF-β 基因，發(fā)現(xiàn)敲除該基因可抑制原代軟骨細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)遷移能力，證明TGF-β 是梅花鹿茸快速生長的關(guān)鍵調(diào)控因子。但是，對(duì)原代鹿茸細(xì)胞能否使用電轉(zhuǎn)染法開展研究？各電轉(zhuǎn)染參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞存活率有何影響？目前相關(guān)研究還處于空白。本研究以馬鹿（C. elaphus）鹿茸前軟骨和軟骨組織原代細(xì)胞為對(duì)象，嘗試?yán)秒姶┛追ㄞD(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）報(bào)告基因，對(duì)相關(guān)電轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行對(duì)比研究，以期為后續(xù)開展電轉(zhuǎn)染技術(shù)在鹿茸再生機(jī)理研究中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集及原代細(xì)胞制備

選取2頭馬鹿雄性個(gè)體（3歲），取其生長期約為60 d的新鮮鹿茸。清洗鹿茸并取其頂端5 ～ 7 cm，縱切組織后，分離出前軟骨和軟骨組織置于PBS雙抗緩沖液中。鹿茸原代前軟骨和軟骨細(xì)胞的制備參照已有方法［22］。將各組織切成3 ～ 4 mm小塊，加足量HBSS 緩沖液浸沒組織塊，分別加入透明質(zhì)酸酶15 mL，37 ℃孵育1. 0 ～ 1. 5 h后，組織塊逐漸呈蓬松狀。離心去除透明質(zhì)酸酶并用PBS清洗，低速離心后吸掉清洗液。按照50 ～ 200 U/mL用量加入適量膠原酶Ⅱ，置于水平搖床37 ℃孵育4 ～ 18 h。待組織塊完全消失，孵育結(jié)束。將消化完畢的細(xì)胞混合物用無菌尼龍網(wǎng)過篩，殘留組織可再添加適量的新鮮膠原酶工作液，并于37 ℃孵育以進(jìn)一步解離。將過篩收集到的細(xì)胞用HBSS緩沖液清洗數(shù)遍后，低速離心，棄掉清洗液，再用適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或手動(dòng)法進(jìn)行活細(xì)胞數(shù)檢測(cè)。最后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，轉(zhuǎn)移細(xì)胞液到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，將細(xì)胞（密度1 × 106 個(gè)/mL）凍存于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 質(zhì)粒提取

報(bào)告基因表達(dá)載體pCMV-C-EGFP購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。取出保存于冰箱的載體菌種，使用時(shí)吸取10 μL，在含有氨芐抗性的固體LB瓊脂培養(yǎng)皿中平板劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。在固體培養(yǎng)皿中挑取單個(gè)菌落置于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 ～ 24 h。質(zhì)粒提取使用EasyPure 去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（天根，中國北京）進(jìn)行。使用核酸定量檢測(cè)儀測(cè)定提取質(zhì)粒質(zhì)量濃度，于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 細(xì)胞培養(yǎng)與電穿孔轉(zhuǎn)染

以廣泛使用的人胚腎來源的293T 細(xì)胞（普諾賽，中國武漢）作為一個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。將凍存于液氮中的293T細(xì)胞、前軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞復(fù)蘇，并分別用含有10%FBS和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度生長至80% ～ 90%時(shí)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。對(duì)每種細(xì)胞用0. 25%胰酶消化處理，離心后吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，用顯微鏡計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 × 106 ～ 5 ×106 個(gè)/mL 后，再離心，用緩沖液吹打成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分別與質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的EGFP 質(zhì)粒混合均勻，按照方波系統(tǒng)電穿孔參數(shù)條件（表1，表2）轉(zhuǎn)染。電穿孔轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至六孔板，顯微鏡觀察后置于培養(yǎng)箱中（37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%）培養(yǎng)，24 h后觀察293T轉(zhuǎn)染情況，48 h 后觀察鹿茸原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。依據(jù)已有文獻(xiàn)［23］，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率以電穿孔轉(zhuǎn)染后具有綠色熒光陽性細(xì)胞數(shù)占存活細(xì)胞總數(shù)百分比計(jì)算；細(xì)胞存活率以電穿孔后活細(xì)胞總數(shù)占未電穿孔條件活細(xì)胞總數(shù)百分比計(jì)算。

1. 4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析及作圖均采用軟件GraphPad Prism9. 0，質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率和存活率的影響以及不同脈沖長度對(duì)293T電轉(zhuǎn)染效率和存活率的影響用單因素方差分析，鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染反應(yīng)體系和電轉(zhuǎn)參數(shù)的優(yōu)化用t 檢驗(yàn)，以P lt;0. 05為差異顯著，P lt; 0. 01為差異極其顯著。

2 結(jié)果

2. 1 鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染反應(yīng)體系

所有電穿孔實(shí)驗(yàn)均使用方波系統(tǒng)。對(duì)鹿茸前軟骨細(xì)胞，以電壓500 V、脈沖長度（pulse length，PL）0. 4 ms、脈沖間隔（pulse intervals，PI） 3 s、脈沖次數(shù)（number of pulses，NoP）2、質(zhì)粒質(zhì)量濃度20 μg/mL進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，存活率保持85%，但無有效轉(zhuǎn)染。保持電壓和質(zhì)粒質(zhì)量濃度不變，延長脈沖長度至1. 3 ms、脈沖間隔至0 s，脈沖次數(shù)減為1，細(xì)胞存活率升至97%，轉(zhuǎn)染效率提高到2%（圖1A、B）。以此為基礎(chǔ)，固定脈沖次數(shù)和質(zhì)粒質(zhì)量濃度，進(jìn)一步以電壓700 V、脈沖長度1. 4 ms進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示細(xì)胞全部喪失活性。由此可知，鹿茸前軟骨細(xì)胞電轉(zhuǎn)染電壓為500 ～ 700 V，脈沖長度為0. 4 ～ 1. 4 ms，脈沖次數(shù)優(yōu)選1或2次，其電轉(zhuǎn)參數(shù)條件可以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步優(yōu)化。

對(duì)于鹿茸軟骨細(xì)胞，在電壓為500 V、質(zhì)粒質(zhì)量濃度為20 μg/mL條件下，改變脈沖長度、脈沖次數(shù)和脈沖間隔，當(dāng)脈沖長度從0. 2 ms延長至1. 0 ms，脈沖次數(shù)由2降為1，脈沖間隔至0 s，轉(zhuǎn)染效率則由0提升至2%（圖1C、D）。再進(jìn)一步穩(wěn)定電壓，以脈沖長度1. 3 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降為0。由此可以推定，鹿茸軟骨細(xì)胞電轉(zhuǎn)染時(shí)電壓500 V，脈沖長度0. 2 ～ 1. 3 ms，脈沖次數(shù)1或2次，脈沖間隔可適當(dāng)延長，其電轉(zhuǎn)參數(shù)條件可以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步優(yōu)化。

平行實(shí)驗(yàn)組293T 細(xì)胞以電壓500 V-脈沖長度0. 4 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s的條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)45%（圖1E、F）。當(dāng)脈沖長度以梯度形式電轉(zhuǎn)染293T，轉(zhuǎn)染效率逐漸升高，存活率卻出現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2）。

2. 2 鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化

依據(jù)已建立的反應(yīng)體系，進(jìn)一步探索關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化的可能性。對(duì)于鹿茸前軟骨組織原代細(xì)胞，當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為20 μg/mL，增加了脈沖間隔和脈沖次數(shù)，同時(shí)減短脈沖長度；或者在同樣質(zhì)粒質(zhì)量濃度條件下，設(shè)定脈沖次數(shù)為3且脈沖間隔為10 s，2種參數(shù)體系的轉(zhuǎn)染效率相似（P gt; 0. 05），表明脈沖長度、脈沖間隔和脈沖次數(shù)參數(shù)之間存在相關(guān)性，均對(duì)前軟骨組織原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效率有影響。對(duì)于軟骨組織原代細(xì)胞，減少脈沖長度；或不改變脈沖長度但增加脈沖次數(shù)時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大約可提升至3%。這說明目前原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率還有提升的空間，多參數(shù)協(xié)同調(diào)節(jié)可能比僅調(diào)節(jié)單一參數(shù)更易獲得更高的轉(zhuǎn)染效率。

2. 3 不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)鹿茸原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及存活率的影響

為進(jìn)一步研究質(zhì)粒質(zhì)量濃度這個(gè)關(guān)鍵要素對(duì)鹿茸原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和存活率的影響，在電壓500 V-脈沖長度0. 9 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s的條件下，按質(zhì)量濃度梯度（10、20、30、40、50、60 μg/mL）將質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)染入鹿茸前軟骨和軟骨組織原代細(xì)胞。前軟骨原代細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示：增大質(zhì)粒質(zhì)量濃度可顯著提高轉(zhuǎn)染效率（P lt; 0. 05，圖3），但隨著質(zhì)粒質(zhì)量濃度增大，細(xì)胞存活率有略下降的趨勢(shì)，雖然統(tǒng)計(jì)結(jié)果并不顯著（P gt; 0. 05）。使用同樣電轉(zhuǎn)染條件，鹿茸軟骨原代細(xì)胞卻顯示出：當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，鹿茸軟骨細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且存活率為85%；隨著質(zhì)粒濃度增加轉(zhuǎn)染效率逐漸降低（P lt; 0. 01），且存活率也在質(zhì)粒質(zhì)量濃度超過30 μg/mL后顯著下降（P lt; 0. 01）；當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度超過40 μg/mL 后，細(xì)胞無法存活且轉(zhuǎn)染效率為0（圖4）。從區(qū)間看：質(zhì)粒質(zhì)量濃度為40 ～ 60 μg/mL時(shí)有較好的細(xì)胞存活率（70% ～ 80%），轉(zhuǎn)染效率為2% ～ 4%（圖3）；而在質(zhì)粒質(zhì)量濃度為20 ～ 30 μg/mL時(shí)，鹿茸軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率極低（1% ～ 2%）。在質(zhì)粒質(zhì)量濃度為10 ～ 20 μg/mL時(shí)，軟骨原代細(xì)胞存活率為80% ～ 90%，且轉(zhuǎn)染效率為1% ～ 4%（圖4）。

3 討論與結(jié)論

電轉(zhuǎn)染可以使用指數(shù)衰減和方波2種不同的波形脈沖，由于后者已被證明是哺乳動(dòng)物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染的最佳波形［24］，所以本研究選擇了方波脈沖。通過探索電壓、脈沖長度、脈沖次數(shù)、脈沖間隔和質(zhì)粒質(zhì)量濃度等參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的影響來構(gòu)建鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染反應(yīng)體系。

通常情況下對(duì)于同種細(xì)胞，電轉(zhuǎn)染可以達(dá)到與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相似的轉(zhuǎn)染效率［25］，如盧莎等［26］通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染2種方法均可建立嵌合HCV的人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)體系，對(duì)比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)細(xì)胞較小的損傷，電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率較高、收獲HCVcc的時(shí)間更短，但2種方法收獲的HCVcc感染滴度無明顯差異；隋娟等［27］比較電轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在K562、HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)電穿孔轉(zhuǎn)染法蛋白表達(dá)量高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。以上報(bào)道呈現(xiàn)的電轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)勢(shì)表明，電穿孔技術(shù)在轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系時(shí)更具優(yōu)勢(shì)［28］。目前盡管對(duì)鹿茸的生長發(fā)育機(jī)制已有深入研究，但鹿茸原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題。因此，本研究旨在探索電穿孔技術(shù)在鹿茸原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。

電轉(zhuǎn)染的效率取決于細(xì)胞膜的滲透性，所以通過優(yōu)化不同參數(shù)的電刺激，如脈沖電壓、持續(xù)時(shí)間和脈沖次數(shù)等［29?30］，可以在一定存活率范圍內(nèi)最大限度地提高轉(zhuǎn)染效率［31］。另外，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和存活率同時(shí)也受物種、細(xì)胞類型等多種因素的影響，因此針對(duì)特定細(xì)胞株需單獨(dú)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件［32］。本研究使用的方波脈沖允許靈活調(diào)節(jié)脈沖電壓、脈沖長度及脈沖次數(shù)等多個(gè)參數(shù)，這些參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率起著關(guān)鍵作用［33?34］。在對(duì)牛成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染pT2-RMCE-Lenus質(zhì)粒試驗(yàn)中，Hyder et al.［35］發(fā)現(xiàn)電轉(zhuǎn)緩沖液、脈沖電壓、脈沖長度及外源基因濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響較大。Hui［36］在脈沖長度和強(qiáng)度對(duì)電穿孔效率影響的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電壓過低、脈沖電穿孔條件對(duì)特定細(xì)胞株不足時(shí)，細(xì)胞膜不會(huì)改變，外源基因不能輕易進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率不會(huì)最大化；而過高的電壓會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，因此存活和轉(zhuǎn)染效率會(huì)受到極大影響。在本研究中，當(dāng)電壓相同時(shí)，鹿茸原代細(xì)胞使用更長的脈沖長度和更多的電擊次數(shù)，轉(zhuǎn)染效率仍顯著低于293T細(xì)胞，所以鹿茸原代細(xì)胞較293T細(xì)胞更難獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，此結(jié)果與使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染的數(shù)據(jù)基本一致（數(shù)據(jù)未附），提示物種（鹿、人）、細(xì)胞類型（原代細(xì)胞、細(xì)胞系）以及細(xì)胞組織來源（軟骨、腎）等要素對(duì)電轉(zhuǎn)染結(jié)果也具有較大的系統(tǒng)性影響。

除電轉(zhuǎn)染脈沖參數(shù)外，質(zhì)粒質(zhì)量濃度也會(huì)影響鹿茸原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率，鹿茸前軟骨原代細(xì)胞和軟骨原代細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量濃度變化帶來的細(xì)胞毒性存在不同響應(yīng)。增大質(zhì)粒質(zhì)量濃度可顯著提高對(duì)前軟骨原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；而在軟骨原代細(xì)胞中，低濃度下細(xì)胞擁有較高的存活率，增大質(zhì)粒質(zhì)量濃度會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，而當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度達(dá)到40 μg/mL后，細(xì)胞無法存活且不能轉(zhuǎn)染。這表明鹿茸前軟骨組織與軟骨組織原代細(xì)胞具有細(xì)胞生物學(xué)特性差異，對(duì)于不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度細(xì)胞毒性的敏感度不同，這種差異的機(jī)理值得深入研究。

本研究首次揭示電壓、脈沖長度、脈沖次數(shù)、脈沖間隔和質(zhì)粒質(zhì)量濃度等因素對(duì)不同鹿茸原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和存活率的影響。應(yīng)當(dāng)指出的是，轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞存活率通常存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。理論上，2次脈沖就足以將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大多數(shù)細(xì)胞中，而增加脈沖次數(shù)在理論上有助于提高轉(zhuǎn)染效率。但是，超過5次的脈沖所產(chǎn)生的細(xì)胞損傷，甚至死亡，將抵消轉(zhuǎn)染效率提高帶來的效果［37］，在建立電轉(zhuǎn)染體系過程中，本研究數(shù)據(jù)還提示需要注意電壓參數(shù)的選擇，如果電壓過高，電轉(zhuǎn)細(xì)胞會(huì)一次性全部喪失活性。細(xì)胞在不同區(qū)域承受不同的電場(chǎng)參數(shù)，其死亡機(jī)制因此會(huì)不同。例如，有研究顯示靠近電極的細(xì)胞暴露在振幅最高的電場(chǎng)中，常死于蛋白變性所致的壞死，甚至凝固性壞死［38］。所以，電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖長度、脈沖次數(shù)與脈沖間隔之間需要合理的調(diào)節(jié)參數(shù)，才能進(jìn)行下一步的優(yōu)化轉(zhuǎn)染工作。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù)過程中，同時(shí)調(diào)節(jié)2 個(gè)及以上參數(shù)可能會(huì)獲得更佳的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率和存活率標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的結(jié)果也表明了通過雙向調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)參數(shù)，可以優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，通過雙向調(diào)整電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖間隔、脈沖長度或脈沖次數(shù)，細(xì)胞可以在單獨(dú)優(yōu)化的條件下獲得良好的電轉(zhuǎn)染結(jié)果。但是需要注意，這種優(yōu)化策略也會(huì)給實(shí)驗(yàn)整體操作帶來更高的復(fù)雜性。

在試驗(yàn)中，本研究選擇293T細(xì)胞系作為平行實(shí)驗(yàn)組，其目的在于比較物種、細(xì)胞類型和細(xì)胞來源等多種因素對(duì)電轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的影響，同時(shí)為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染體系提供一個(gè)良好的參照系。

本研究成功地對(duì)鹿茸原代細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行了探索性研究，初步建立了鹿茸原代細(xì)胞電轉(zhuǎn)染體系和相關(guān)參數(shù)。在后續(xù)試驗(yàn)中，建議將指數(shù)波、緩沖液體系和細(xì)胞密度等因素也納入并進(jìn)行深入研究。