麝鼠Bad基因生物信息學分析

關鍵詞：麝鼠；Bad 基因；生物信息學分析

麝鼠（Ondatra zibethicus）原產自北美，是一種珍貴的毛皮動物，具有較高的經濟價值，易于人工飼養。麝鼠食性較為廣泛，主要以新鮮的果實、蔬菜的塊莖為主，同時也食小魚、小蝦等水生小動物［1］。麝鼠又被稱為麝香鼠，是倉鼠科（Cricetidae）中唯一會泌香的動物［2］。麝鼠中只有雄性的成年麝鼠可分泌麝鼠香，香腺形態和泌香過程在一年中3—10月呈現周期性變化。麝鼠香的主要成分為有機酸類物質、醛類、烷類、酯類以及麝香酮、降香酮等環酮類物質［3］。這些成分與天然麝香成分相同，所以麝鼠香可被用來代替麝香［4?5］，其成分中2%的麝香酮與天然麝香有著類似的藥理作用，通常被用于疾病的臨床治療，如抗炎鎮痛、降低血壓等［6］。麝鼠香中大環酮類等物質分子對接研究發掘出10個關鍵靶點，展示出麝鼠香也可能在腫瘤的發生、發展和擴散等方面具有一定的藥用功效［7］。

B 淋巴細胞瘤-2 基因相關啟動子（Bcl-XL/Bcl-2associated death promoter，Bad）是Bcl-2（B-cell lymphoma-2，B淋巴細胞瘤-2）家族中促進凋亡的主要基因之一。1995 年被Yang et al.［8］在Bcl-2 樣蛋白1（Bcl-XL）/Bcl-2 相互作用的酵母雙雜交篩選中被鑒定出來。1997年在鼠的cDNA文庫中被克隆［9］，隨后又克隆出了人類的同源基因［10］。Bad 基因編碼的產物與凋亡抑制基因表達產物結合，形成異源二聚體，與Bcl-2、Bcl-XL 和Bcl-2 樣蛋白2（Bcl-W）競爭性結合，影響這些蛋白與細胞凋亡調節因子（Bcl-2 associatedX，Bax）的異二聚化水平，以此來達到促進細胞凋亡的目的，從而發揮其促進機體細胞凋亡的生理作用［11］。該蛋白在進化上高度保守，廣泛存在于動物的組織和器官中，可通過細胞信號轉導通路以及天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族成員作用而促進細胞凋亡［12］。廖光珍［13］的研究表明Bcl-2 在香腺發育期表達量顯著升高，促進香腺發育，負調控因子Bax在香腺萎縮期表達量升高抑制Bcl-2 基因的表達，促進香腺萎縮。李天峰［14］的研究表明，Caspase家族中相關基因可通過促使細胞凋亡從而促進香腺萎縮。基于前期研究香腺miRNA測序，篩選出顯著差異的miRNA，Bad 基因作為靶基因之一且為Bcl-2家族中的關鍵基因，推測該基因可能與Bcl-2家族相關基因一樣參與調控香腺發育與泌香過程［15］。因此，本研究基于生物信息學的方法分析麝鼠的Bad 基因及其蛋白質氨基酸序列的結構特征等，為該基因在麝鼠香腺周期性發育過程中的作用提供一定的基礎數據。

1 材料與方法

1. 1 研究序列

比對麝鼠全基因組獲得麝鼠Bad 基因的CDS區序列，預測其氨基酸序列，將麝鼠Bad蛋白的氨基酸序列代碼設置為Ondz，在GenBank數據庫下載中國倉鼠（Cricetulus griseus）、長爪沙鼠（Meriones unguicu?latus）、敘利亞倉鼠（Mesocricetus auratus）、肥沙鼠（Psammomys obesus）、黑家鼠（Rattus rattus）、褐家鼠（R. norvegicus）和斑鼯猴（Galeopterus variegatus）Bad蛋白氨基酸序列及不同轉錄本序列（表1），用于序列比對與進化分析。

1. 2 分析方法

利用EditSeq 對麝鼠Bad 基因的編碼區序列進行分析，利用Expasy網站ProtParam和ProtScale在線軟件預測麝鼠Bad蛋白的理化性質和親疏水性，利用SOMPA 預測Bad 的二級結構，利用SWISSMODEL、TMHMM Server v2. 0、SignalP 6. 0、PSORT Ⅱ、NetPhos 3. 1和NetNGlyc 1. 0分別分析Bad的三級結構、跨膜結構、信號肽、亞細胞定位、磷酸化位點和N-糖基化位點。利用STRING和SMART分析蛋白質互作網絡和結構域預測。利用BioAider對麝鼠與其他物種的Bad蛋白氨基酸序列進行相似性比對，利用MEGA 11. 0建立系統發育進化樹。

2 結果

2. 1 麝鼠Bad 蛋白理化性質

麝鼠Bad 基因的CDS區全長為615 bp，A + T含量38. 05%，C + G含量61. 95%，編碼204個氨基酸。CDS 序列共有10 個潛在的SNP 位點。第27、181、546位為A/G（ A為麝鼠堿基，G為其他物種堿基，下同），第31、270 位為T/C，第191 位為G/T，第358、531、561 位均為T/A、C，第377 位為T/A。其中，第27、377、531、546、561 位為同義突變。利用Prot‐Param在線網站對麝鼠Bad蛋白的理化性質進行分析，結果顯示：其分子式為C944H1481N301O301S7，相對分子質量22 087. 40，等電點9. 63，屬堿性蛋白質。半衰期30 h，不穩定系數（72. 03）大于40，不穩定。該蛋白共包含20種氨基酸（圖1），其中數量最多的是絲氨酸，共27個，數量最少的是半胱氨酸和纈氨酸，各1 個。帶正電荷的氨基酸殘基有21 個（Asp +Glu），帶負電荷的氨基酸有25個（Arg + Lys）。因此，推測麝鼠Bad蛋白總體帶負電。

2. 2 麝鼠Bad 蛋白親/疏水性預測

利用ProtScale在線軟件對麝鼠Bad蛋白的親疏水性進行分析發現，該蛋白質親疏水性最強的位置分別為第149 位（-2. 544）和81 位（1. 611）（圖2）。該蛋白肽鏈上整體位置親水性大于疏水性，所以該蛋白整體為親水蛋白。

2. 3 麝鼠Bad 蛋白的跨膜結構與信號肽分析

利用在線預測軟件TMHMM Server v2. 0對Bad蛋白的跨膜結構進行分析，結果顯示該蛋白的跨膜結構數量為0（圖3）。利用在線預測網站對麝鼠Bad蛋白的信號肽進行分析，結果如圖4所示，Bad蛋白無信號肽，不屬于分泌蛋白。

2. 4 麝鼠Bad 蛋白的亞細胞定位

亞細胞預測定位結果顯示，麝鼠Bad蛋白在線粒體、細胞核和細胞質基質、細胞壁以及細胞骨架中占比分別為45%、24%、5% 和2%。因此，預測該蛋白主要定位于線粒體。

2. 5 麝鼠Bad 蛋白二級結構和三級結構預測

利用在線軟件SOMPA 對麝鼠Bad 蛋白的二級結構進行預測，結果顯示Bad蛋白的二級結構主要由α-螺旋（32. 84%）、β-轉角（4. 90%）、無規則卷曲（56. 86%）和延伸鏈（5. 39%）構成（圖5）。利用在線軟件SWISS-MODEL 對麝鼠Bad蛋白的三級結構進行預測，結果顯示Bad蛋白的三級結構由α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈構成（圖6），與二級結構預測一致。

2. 6 麝鼠Bad 蛋白磷酸化和N-糖基化位點分析

利用NetPhos 3. 1在線軟件預測麝鼠Bad蛋白磷酸化結合位點，結果顯示共有26個結合位點（圖7）。包括5個蘇氨酸位點（第3、69、117、175、201位），21個絲氨酸位點（第20、29、42、52、57、58、67、111、112、114、128、134、136、155、161、170、180、182、189、200、203位）。

利用NetNGLyc 1. 0 在線預測網站預測出麝鼠Bad蛋白有1個N-糖基化位點（圖8），處于第94位。

2. 7 麝鼠Bad 蛋白互作網絡分析與結構域預測

利用STRING 在線預測網站預測，與Bad 蛋白相互作用的有酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白θ（Ywhaq）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白ζ（Ywhaz）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白β（Ywhab）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Akt1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（Akt2）、絲裂活化蛋白激酶8（Mapk8）和Bcl-2 等（圖9）。其中Akt1和Akt2屬于Akt信號通路，又被稱為PI3K-Akt 信號通路。該通路是細胞內重要的信號轉導途徑，在細胞的生長、存活、增殖和遷移中發揮重要作用［16］。Mapk8通路又叫作JNK通路，該通路屬于Mapk 信號轉導通路，可以直接或間接發揮促凋亡作用［17］。利用SMART在線預測網站預測Bad 蛋白結構域，結果顯示氨基酸從43 ～ 204 為Bcl-2-Bad結構域（圖10），含有Bcl-2的同源結構域3（BH3）。

2. 8 序列比對

利用BioAider對麝鼠及GenBank數據庫下載的中國倉鼠、長爪沙鼠、敘利亞倉鼠、肥沙鼠、黑家鼠、褐家鼠和斑鼯猴的Bad蛋白氨基酸序列進行序列相似性比對。各物種間Bad基序相對保守，麝鼠Bad蛋白氨基酸序列與嚙齒目（Rodentia）6個物種之間相似性介于88. 61% ～ 93. 67%，與倉鼠科中敘利亞倉鼠和中國倉鼠之間相似性較高，為92. 41%和93. 67%（表2）。

2. 9 麝鼠系統發育進化樹構建

利用MEGA 11. 0鄰接（neighbor joining）法建立系統發育進化樹，以斑鼯猴作為系統發育進化樹的外群，麝鼠分支用紅色標記。結果顯示，鼠科（Muridae）和倉鼠科各自聚為一支，麝鼠與倉鼠科中敘利亞倉鼠和中國倉鼠之間親緣關系較近，分支之間置信度普遍較高（圖11）。不同物種間Bad 蛋白較為保守。

3 討論

麝鼠香腺miRNA 測序篩選出顯著差異的miRNA，預測出Bad 基因為靶基因之一，表明Bad 基因可能參與調控香腺發育與泌香過程［15］。本研究通過比對麝鼠全基因組獲得麝鼠Bad 基因CDS 區序列，預測出氨基酸序列。對該序列進行生物信息學分析顯示：麝鼠Bad蛋白的相對分子質量為22 087. 40，半衰期為30 h，是不穩定的（不穩定系數72. 03 gt;40）、堿性（等電點9. 63）、親水性蛋白（平均親水系數-0. 885）。麝鼠Bad蛋白由204個氨基酸組成，其中最多的是絲氨酸（27個），數量最少的是半胱氨酸和纈氨酸（各1個）。結構預測發現該蛋白二級和三級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成。序列比對顯示Bad蛋白比較保守。進化分析結果顯示，麝鼠與倉鼠科物種親緣關系較近。此外，麝鼠Bad蛋白有5個蘇氨酸位點和21個絲氨酸位點以及1個N-糖基化位點，預測結果表明這些氨基酸為該蛋白翻譯后潛在修飾位點。蛋白互作預測結果表明與Bad相互作用的蛋白有Bcl-2、Akt1、Akt2、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab和Mapk8等。結構域預測結果顯示，氨基酸從43 ～ 204為Bcl-2-Bad結構域，含有Bcl-2的同源結構域3（BH3）。Bcl-2家族均由1 ～ 4個同源BH結構域構成，分別是BH1、BH2、BH3 和BH4［18］。BH3 結構域是Bad蛋白參與各類凋亡刺激的識別過程以及促凋亡蛋白最重要的功能區［18］。Bad發揮的促凋亡調控作用主要依賴于BH3結構域，目前所報道的包含BH3結構域的蛋白均為促凋亡蛋白家族成員，并且都可以通過和凋亡抑制蛋白相互作用進而發揮促凋亡功能［19］。當BH3-only家族成員Bad發生去磷酸化時，游離的Bad通過自身的BH3結構域與Bcl-2相結合，使原本與Bcl-2結合的Bax被釋放，Bax形成同二聚體發揮促凋亡作用。通過改變線粒體通透性孔道的開放以及提高線粒體膜的通透性引起細胞色素C等一系列物質的釋放，從而引起細胞凋亡［20］。生理狀態下的Bcl-2通路的相關基因通常只存在于特定的亞細胞結構中，在有無凋亡信號時作用于不同的位點，Bad等促凋亡成員無凋亡信號刺激時黏附于細胞內膜或胞質結構中，有凋亡信號時促凋亡相關成員在線粒體膜外發揮促凋亡作用［21］。線粒體通路正是Bcl-2家族基因調控內在凋亡途徑的主要靶點。在麝鼠香腺發育周期中Bcl-2家族的Bcl-2 基因在2—4月與7—10月的相對表達量具有顯著差異：2—4月中Bcl-2 表達量升高，促進香腺細胞的發育和積累；7—10月中負調控因子Bax 表達量上升，抑制Bcl-2發揮作用，促進香腺萎縮［13］。由于Bad具有特殊的位點，外部的各類藥物處理和各種內源性信號若想實現對神經膠質瘤細胞內促凋亡或促生存信號通路的下游調控，還可以通過改變磷酸化狀態來實現［22］。Bad還可介導細胞周期蛋白的促凋亡作用，使其與細胞周期阻滯保持一致［22］。當Bcl-2 基因與Bcl-X 基因過度表達時，Bad 基因可直接誘導細胞凋亡［23］。在與Bad蛋白相互作用的蛋白中，Akt參與多種通路，調節多種細胞功能，包括細胞增殖、存活及代謝，是多種通路的關鍵組成部分。Akt通過與磷脂酰肌醇的相互作用并轉移到細胞膜而被活化［24］，再進一步活化胞內Bad及其他蛋白質，從而發揮促凋亡、糖代謝和細胞周期等其他生物學過程。Akt在麝鼠發育周期中隨著月份的遞增相對表達量下降［13］。因此，推測在麝鼠香腺萎縮過程中Bad蛋白與Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz和Ywhab等蛋白相互作用促進香腺細胞凋亡并導致香腺逐漸萎縮，具體調控作用有待進一步試驗驗證。

Mapk8 通路又叫作JNK 通路，JNK 是一種重要的磷酸化激酶，主要通過對下游底物的磷酸化修飾從而發揮功能。活化的JNK 對Bad 蛋白蘇氨酸的201位點具有磷酸化作用。在生理狀態下，當Bad 基因被酸化的過程完全實現后可與具有抑制功能的蛋白復合物之間相互結合發揮抗凋亡的作用［25］。JNK基因在3—4月的表達量與2月相比有所上升，短時間的活化促進了香腺細胞的生存［13］。Ywhaq、Ywhaz和Ywhab的基因產物都屬于14-3-3蛋白家族。預測Bad有26個磷酸化位點，其中絲氨酸的第112位和第136位點磷酸化后，Bad可與14-3-3蛋白相互結合并在細胞質中發揮作用，阻止在胞內位點與Bcl-XL結合，提高了細胞存活的可能性［26］。這提示Bad蛋白可能在香腺發育過程中具有抑制凋亡的作用，有待深入研究。以上研究說明，與不同蛋白互作，Bad蛋白可能發揮不同的功能，產生不同的效應。本研究結果可為進一步探究麝鼠Bad 基因在香腺周期性發育中的功能提供參考