十一個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)對(duì)野生與圈養(yǎng)環(huán)頸雉鑒別能力的評(píng)價(jià)

關(guān)鍵詞：環(huán)頸雉；來(lái)源鑒別；野生；圈養(yǎng)；DNA甲基化

中國(guó)是世界上野生動(dòng)物種類(lèi)最豐富的國(guó)家之一，野生動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模龐大［1］。然而，2019年新冠肺炎疫情暴發(fā)后，為防止?jié)撛诘墓残l(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)以食用為目的的野生動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)被關(guān)閉，但藥用、毛皮和觀賞等其他用途的養(yǎng)殖活動(dòng)繼續(xù)進(jìn)行。如果野外獲取的動(dòng)物可以混作飼養(yǎng)個(gè)體進(jìn)入合法市場(chǎng)，就會(huì)刺激盜獵和非法利用等行為，進(jìn)而威脅野外資源的保護(hù)。因此，從執(zhí)法和管理兩個(gè)層面都需要建立鑒別技術(shù)。

養(yǎng)殖動(dòng)物因?yàn)轳Z養(yǎng)時(shí)間較短，與野外的同種個(gè)體沒(méi)有明顯的遺傳分化，因而，難以通過(guò)常規(guī)方法對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。為了把野外獲得的動(dòng)物與人工養(yǎng)殖的動(dòng)物有效分開(kāi)，國(guó)家實(shí)施了《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)陸生野生動(dòng)物及其制品專(zhuān)用標(biāo)識(shí)管理辦法》，通過(guò)機(jī)構(gòu)和個(gè)體標(biāo)識(shí)為合法養(yǎng)殖的動(dòng)物及其產(chǎn)品貼上標(biāo)簽［2］。盡管這一措施相對(duì)有效，但在執(zhí)法實(shí)踐中往往更需要確鑿的科學(xué)鑒定。因此，開(kāi)發(fā)能夠精確鑒定野生、圈養(yǎng)動(dòng)物的技術(shù)迫在眉睫。實(shí)際上，區(qū)分野生與人工養(yǎng)殖動(dòng)物始終是野生動(dòng)物法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。肌肉是各類(lèi)涉及野生動(dòng)物案件中最為常見(jiàn)的樣品，而目前還沒(méi)有方法能準(zhǔn)確鑒別肌肉的來(lái)源是野生或圈養(yǎng)。關(guān)于肌肉的鑒定，雖然已經(jīng)陸續(xù)建立了化學(xué)成分分析［3-6］和形態(tài)學(xué)分析［7-9］的方法，但其受環(huán)境變量的影響大，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的應(yīng)用。

環(huán)頸雉（Phasianus colchicus）被列為“三有”（有重要生態(tài)、科學(xué)、社會(huì)價(jià)值）野生動(dòng)物［10］，《中華人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》明確規(guī)定其捕獵需要取得縣級(jí)以上地方人民政府野生動(dòng)物保護(hù)主管部門(mén)核發(fā)的狩獵證。同時(shí)，該物種也在2021年列入《國(guó)家畜禽遺傳資源品種目錄》［11］，成為新型家禽，可以合法養(yǎng)殖。多年來(lái)，環(huán)頸雉的非法捕獵屢屢發(fā)生，因?yàn)闆](méi)有建立科學(xué)的鑒別方法而無(wú)法為執(zhí)法提供科學(xué)的鑒定支持。

表觀遺傳學(xué)把環(huán)境信息和遺傳信息整合起來(lái)，為解決這一難題提供了新的視角。DNA甲基化作為DNA表觀修飾的主要形式，在不改變DNA序列的情況下調(diào)節(jié)基因表達(dá)，應(yīng)對(duì)不同環(huán)境因子的作用。如在人類(lèi)法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，根據(jù)DNA甲基化模式在不同類(lèi)型的組織之間存在差異，研發(fā)了識(shí)別不同組織和體液來(lái)源的方法［12］。野生與圈養(yǎng)的同種動(dòng)物，其DNA序列幾乎完全相同，但因?yàn)橐吧h(huán)境下會(huì)展現(xiàn)出更大的運(yùn)動(dòng)量和更高的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，很可能在骨骼肌的DNA上存在著甲基化修飾的差異。如α-ACTN3基因在肌肉收縮中維持肌纖維狀態(tài)，其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平在野生與圈養(yǎng)水貂（Neovison vison）之間表現(xiàn)出顯著的差異［13-15］。這為基于DNA甲基化建立鑒別方法提供了先驗(yàn)實(shí)證。

目前，DNA甲基化水平的檢測(cè)方法主要包括焦磷酸測(cè)序、亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序（BSP）、質(zhì)譜檢測(cè)和甲基化特異性PCR（MSP）。BSP和MSP適用于較大片段的分析，但產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的概率較高；而焦磷酸測(cè)序和質(zhì)譜檢測(cè)適合短片段分析，但成本較高。為了打破這些局限性，Wojdacz et al.［16］提出了甲基化特異性高分辨率熔解曲線法（methylation-sensitivehigh resolution melting，MS-HRM）。該方法使用新型DNA飽和染料EvaGreen替代傳統(tǒng)的SYBR Green，避免了染料重排現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和高分辨率的DNA甲基化檢測(cè)［16?17］。MS-HRM最大的優(yōu)勢(shì)是成本低廉，省去了電泳和成像過(guò)程，適用于大批量樣本檢測(cè)。

因此，本研究采用MS-HRM 的策略，用60個(gè)已知來(lái)源的環(huán)頸雉的胸大肌，對(duì)全基因組重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序發(fā)現(xiàn)的11個(gè)甲基化水平差異位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，旨在評(píng)估其在判別野生和養(yǎng)殖個(gè)體的有效性，為進(jìn)一步建立鑒別方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 肌肉樣本DNA 的提取

野生環(huán)頸雉樣本為公安機(jī)關(guān)打擊盜獵中查獲的死亡個(gè)體，雌、雄各15只；圈養(yǎng)樣本為養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的相同數(shù)量的環(huán)頸雉。經(jīng)解剖采集胸大肌，分別編號(hào)放入10 mL 凍存管中，置于冰箱-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｓ肁xyPrep Multisource Genomic DNA MiniprepKit（Axygen，美國(guó)）提取基因組總DNA。使用EZDNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research，美國(guó)）對(duì)提取的總DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理，最終得到轉(zhuǎn)化的基因組DNA，置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 MS-HRM 引物設(shè)計(jì)與篩選

從本團(tuán)隊(duì)前期獲得的甲基化組數(shù)據(jù)中，選擇甲基化差異大于40% 的26 個(gè)位點(diǎn)。使用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)PCR 引物（表1）。隨機(jī)選取6 個(gè)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA 樣本（野生和圈養(yǎng)各3只）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10. 0 μL，含有DNA模板1. 0 μL、GoTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）5. 0 μL、上游和下游引物（0. 3 μmol/L）各0. 6 μL、ddH2O 2. 8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，（Tm ± 2） ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剔除擴(kuò)增失敗的位點(diǎn)，保留擴(kuò)增成功的位點(diǎn)。

1. 3 MS-HRM 標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取一只環(huán)頸雉的總DNA，以CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶（NEB、中國(guó)）處理，作為100% 甲基化的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，以未經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板為無(wú)甲基化的標(biāo)準(zhǔn)品。將二者按比例混合得到100%、80%、60%、40%、20%、10% 等各個(gè)甲基化水平梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。用HRM Analysis Kit （EvaGreen）按照前述步驟建立的擴(kuò)增體系對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，（Tm ± 2）℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；熔解段為95 ℃變性1 s，60 ℃退火1 s，最后95 ℃延伸1 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)，記錄Tm。用R 中的軟件包ggpmisc 和ggpubr構(gòu)建以ΔTm 為縱坐標(biāo)、不同甲基化梯度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同甲基化梯度以10%甲基化水平的Tm為基準(zhǔn)，計(jì)算各個(gè)甲基化水平的標(biāo)準(zhǔn)品的Tm與ΔTm。

1. 4 野生和圈養(yǎng)環(huán)頸雉胸大肌樣本甲基化水平的檢測(cè)

先隨機(jī)選擇6個(gè)亞硫酸鹽處理后的DNA樣本（3個(gè)野生，3個(gè)圈養(yǎng)），按照前述的反應(yīng)條件對(duì)隨機(jī)選取的3個(gè)基因LOC116232884、NFATC2 和FGF9-3 分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，記錄其Tm，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，然后計(jì)算Tm的變異系數(shù)CV（標(biāo)準(zhǔn)差與均值之比）。如果CV lt; 0. 01，則認(rèn)為單次實(shí)驗(yàn)可以忠實(shí)地代表樣品的實(shí)際值，否則在大樣本實(shí)驗(yàn)中需要3次重復(fù)。然后對(duì)全部60個(gè)樣本的全部成功擴(kuò)增的位點(diǎn)進(jìn)行Tm檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算每個(gè)樣品每個(gè)位點(diǎn)的甲基化率（%）。用origin2018軟件對(duì)野生和圈養(yǎng)環(huán)頸雉胸大肌DNA甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異比較，顯著水平α = 0. 05，P lt; 0. 05為差異顯著。采用十折交叉驗(yàn)證獲得各位點(diǎn)分別對(duì)兩組的正確鑒別率（group correctness of assignment，GCA）和總體正確鑒別率（overall correctness of assignment，OCA）。

2 結(jié)果

2. 1 MS-HRM 檢測(cè)11 個(gè)位點(diǎn)甲基化率的標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)過(guò)篩選，共有11個(gè)位點(diǎn)可以成功擴(kuò)增，并得到正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別是LOC116232884、NFATC2、FGF9-3、EFNA5、FGF9-2、FGF9-1、MAPK8、DUSP10、PDGFC、MYCN 和TGFB3。根據(jù)不同甲基化梯度回歸得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2介于0. 798 ～ 0. 995，可以通過(guò)Tm 來(lái)準(zhǔn)確量化每個(gè)樣品的甲基化率（ 表2）。

2. 2 11 個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化率的檢測(cè)結(jié)果

6個(gè)樣本（3個(gè)野生，3個(gè)圈養(yǎng)）對(duì)隨機(jī)選取的3個(gè)基因重復(fù)擴(kuò)增參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各個(gè)樣本的CV為0. 000 0 ～ 0. 007 7，平均為0. 002 0（表3）。這說(shuō)明所建立的MS-HRM檢測(cè)體系重復(fù)性較好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。為了節(jié)省時(shí)間和檢測(cè)成本，每個(gè)樣本采用一次檢測(cè)的結(jié)果代表其Tm。

隨后對(duì)全部60只個(gè)體（30個(gè)野生，30個(gè)圈養(yǎng)）的胸大肌進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每個(gè)樣本每個(gè)位點(diǎn)的甲基化率。結(jié)果顯示（表4），圈養(yǎng)組所有位點(diǎn)甲基化率位于0. 083 ～ 0. 811，而野生組的位于0. 050 ～ 0. 780。圈養(yǎng)組95% 置信區(qū)間（CI）平均寬度為0. 151，略低于野生組的0. 153。就分布范圍而言，圈養(yǎng)組平均值為0. 625，野生組為0. 666，略低于后者。對(duì)兩組間的數(shù)據(jù)差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，F(xiàn)GF9-3、FGF9-2、MAPK8、DUSP10、LOC116232884 和MYCN 六個(gè)位點(diǎn)在組間表現(xiàn)出極顯著差異（| t | = 3. 632 ～ 7. 576，P =0. 000 ～ 0. 001），位點(diǎn)NFATC2顯示出顯著差異（| t | =3. 116，P = 0. 004），而EFNA5、FGF9-1、PDGFC 和TGFB3 四個(gè)位點(diǎn)組間沒(méi)有明顯差異（|t| = 0. 666 ～1. 927，P = 0. 064 ～ 0. 511）。11個(gè)位點(diǎn)中有7個(gè)位點(diǎn)（NFATC2、EFNA5、MAPK8、DUSP10、PDGFC、LOC116232884 和MYCN）在圈養(yǎng)組和野生組的甲基化水平分布都同時(shí)起始于0. 000，觀測(cè)值的分布范圍沒(méi)有顯著差異（成對(duì)樣 t 檢驗(yàn)：| t | = 0. 766，P =0. 469），95% CI的寬度也沒(méi)有顯著差異（成對(duì)樣t 檢驗(yàn)：| t | = 0. 322，P = 0. 757），但上述7個(gè)位點(diǎn)在均值上表現(xiàn)出顯著或極顯著的差異。

2. 3 11 個(gè)基因位點(diǎn)的判別力分析

十折交叉驗(yàn)證結(jié)果如表5 所示，11 個(gè)位點(diǎn)的GCA 在野生組為46. 67% ～ 76. 66%，圈養(yǎng)組為26. 67% ～ 66. 67%，野生組的GCA顯著高于圈養(yǎng)組（成對(duì)樣本t檢驗(yàn)：| t | = 2. 213，P = 0. 051）。OCA為61. 67% ～ 82. 78%，其中MAPK8 的OCA 最高，達(dá)到82. 78%，EFNA5 的最低，僅有61. 67%。綜合考慮GCA、OCA和甲基化率組間差異的檢驗(yàn)結(jié)果（表3），將組間差異顯著的LOC116232884、NFATC2、FGF9-3、FGF9-2、MAPK8、DUSP10 和MYCN 七個(gè)位點(diǎn)予以保留，測(cè)試聯(lián)合鑒別能力。結(jié)果顯示，這7個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合GCA在野生組為80. 00%，圈養(yǎng)組為73. 33%，OCA為87. 78%，累積鑒別力CPD可達(dá)99. 999 93%。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，具顯著組間差異的7個(gè)位點(diǎn)各自對(duì)于野生及圈養(yǎng)環(huán)頸雉的鑒別能力均超過(guò)60%，而聯(lián)合的累積鑒別能力接近100%。這說(shuō)明DNA甲基化作為組織中基因表達(dá)狀態(tài)的表現(xiàn)形式，完全有潛力反映野生和圈養(yǎng)兩種狀態(tài)下的差異。眾所周知，在野外動(dòng)物的行為譜中，行走、覓食（捕食）、炫耀、爭(zhēng)斗、玩耍和逃跑等運(yùn)動(dòng)行為占比較大，而養(yǎng)殖動(dòng)物的行為譜中站立、休息等靜止行為占比最大；野外動(dòng)物的激烈運(yùn)動(dòng)也多于養(yǎng)殖動(dòng)物，因此從行為特點(diǎn)上講，野外和養(yǎng)殖環(huán)境下動(dòng)物的顯著差異是運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的差異，而作為動(dòng)力來(lái)源的骨骼肌的使用強(qiáng)度和使用方式也因此產(chǎn)生差異。這種現(xiàn)象已經(jīng)在人和小鼠的控制試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后骨骼肌中基因的甲基化狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生差異［19?21］。胸大肌是鳥(niǎo)類(lèi)撲翼的主要?jiǎng)恿∪狻Ｔ谝巴猓吧B(niǎo)類(lèi)使用爆發(fā)式飛行，而圈養(yǎng)鳥(niǎo)類(lèi)很少飛翔，或飛翔距離和時(shí)間短［22］。因而野鳥(niǎo)和圈養(yǎng)鳥(niǎo)胸大肌的能量代謝速度、整體能耗和能量?jī)?chǔ)存庫(kù)等都有明顯的不同［23?25］。本研究從DNA的甲基化方面為這種不同提供了解釋?zhuān)ū?），在檢測(cè)的11個(gè)位點(diǎn)中至少有7個(gè)位點(diǎn)存在顯著或極顯著的差異（P = 0. 000 ～ 0. 004），有的位點(diǎn)雖然未達(dá)到顯著水平，但也比較接近（FGF9-1，P = 0. 064；TGFB3，P =0. 196）。

本研究結(jié)果還顯示，11 個(gè)位點(diǎn)中有7 個(gè)位點(diǎn)（NFATC2、EFNA5、MAPK8、DUSP10、PDGFC、LOC-116232884 和MYCN）在圈養(yǎng)組的甲基化水平分布都同時(shí)起始于0. 000，觀測(cè)值的分布范圍沒(méi)有顯著差異（成對(duì)樣t檢驗(yàn)：| t | = 0. 766，P = 0. 469），95% CI的寬度也沒(méi)有顯著差異（成對(duì)樣t檢驗(yàn)：| t | = 0. 322，P =0. 757）。不同的是，一些位點(diǎn)的均值表現(xiàn)出顯著或極顯著的差異（表4）。這說(shuō)明甲基化率有明顯的個(gè)體差異，野生和圈養(yǎng)個(gè)體之間的差異較為模糊。這給建立鑒別方法帶來(lái)了困難。這種情況只有增加位點(diǎn)數(shù)才能得到較為可靠的判別結(jié)果。盡管每個(gè)位點(diǎn)的鑒別力不夠高，甚至差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)上的顯著水平，但是因其頻率分布仍然表現(xiàn)出組別的傾向性，隨著所用位點(diǎn)數(shù)量的增加，總體鑒別力也會(huì)逐漸越高，直至達(dá)到鑒定實(shí)踐中可接受的水平。此外，另有一些位點(diǎn)在野生組的正確鑒別力GCA要高于其在圈養(yǎng)組（表5），原因可能是野生組內(nèi)甲基化率分布范圍窄，整體分布較圈養(yǎng)組更為穩(wěn)定，因而鑒別力較圈養(yǎng)組更高（表4）。

本研究篩選了7個(gè)具有一定鑒別力的位點(diǎn)，最高的OCA可達(dá)82. 78%，最低也達(dá)到62. 22%，累積鑒別力可達(dá)99. 999 93%。所建立的MS-RHM 甲基化率定量體系在同一樣本3 次重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)CV在0. 000 0 ～ 0. 007 7，平均值只有0. 002 0，說(shuō)明該體系有著非常高的穩(wěn)定性和可信度（表3）。這些結(jié)果為建立鑒別野生和圈養(yǎng)環(huán)頸雉提供了位點(diǎn)資源和檢測(cè)方法，也為解決其他同類(lèi)物種的鑒別問(wèn)題提供了直接借鑒。