紅喉歌鴝黑龍江種群遺傳多樣性和遺傳結構分析

關鍵詞：紅喉歌鴝；細胞色素b 基因；遺傳多樣性；遺傳結構；種群擴張

紅喉歌鴝（Calliope calliope）又名紅點頦，屬雀形目（Passeriformes）鹟科（Muscicapidae）［1］，外觀美麗、鳴聲悅耳，是野生鳥類非法捕捉和貿易的重要目標之一［2］。同時，棲息地的破壞和片段化嚴重威脅該物種的生存和繁殖，導致其種群數量進一步下降［3?4］，現為國家二級重點保護野生動物［5］。

紅喉歌鴝廣泛分布于古北界地區，包括指名亞種（C. c. calliope）、勘察加亞種（C. c. camtschatken?sis）［6?7］，以及3個尚有爭議的亞種（庫頁島亞種C. c.sachalinensis、阿納德爾亞種C. c. anadyrensis 和青海亞種C. c. beicki）［6，8?10］。其繁殖地域從烏拉爾山脈延伸至太平洋西岸及鄰近島嶼，包括中國東北、西北部分地區［6?11］。紅喉歌鴝是遷徙鳥類，每年4 月初和9月末沿中亞和東亞-澳大利亞2條路線遷徙［12?15］。它們具有固定的遷徙路線和較強的筑巢保守性，使得各個種群的繁殖區每年保持相對穩定［8］。

紅喉歌鴝的線粒體基因組順序與家雞相同，只有一個細胞色素b 基因（Cyt b）拷貝［4］。Spiridonovaet al.［8?10］揭示了紅喉歌鴝西伯利亞及遠東地區種群具有較高的Cyt b 基因遺傳多樣性，并將其劃分為3個支系（Clade）：西伯利亞大陸支系，庫頁島支系及勘察加半島、千島群島、北海道支系。基于西部支系Cyt b 的核拷貝（nuclear copies of mitochondrial genes，Numt）與東部支系Cyt b 序列間的高度相似性，Spiridonovaet al.［9?10］提出了Numt與線粒體基因的同源重組機制，并以此為線索說明了紅喉歌鴝由西伯利亞向遠東地區擴散、定殖的過程。

紅喉歌鴝是黑龍江常見的繁殖鳥類，其遺傳多樣性水平和遺傳結構，以及是否存在東部支系的單倍型滲入仍不清楚。為此，本研究測定了黑龍江種群85只個體的Cyt b 基因序列，結合已有報道的同源序列進行了綜合分析，以期揭示該種群遺傳狀況，為制定合理的物種保護措施提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集和序列下載

采集黑龍江省北安市（48°18′ N，126°42′ E）繁殖種群（n = 85只）紅喉歌鴝死體肌肉樣本，根據形態學方法［16］鑒定，包括40只雄性、45只雌性。所有樣本均由國家林業和草原局野生動植物檢測中心查沒所得。此外，從GenBank中下載西伯利亞及遠東地區135只紅喉歌鴝的Cyt b 基因序列（表1），以及黑胸歌鴝（C. pectoralis）（KJ456329）［19］和歐歌鴝（Lus?cinia luscinia）（MT410894）的同源序列。220只紅喉歌鴝樣本信息依據產地不同劃分為7個種群，分別標記為Pop1 ～ Pop7（圖1）。

1. 2 DNA 提取、擴增和測序

使用DNA 提取試劑盒（UElandy，蘇州）提取基因組總DNA。為消除Numt 干擾，利用NCBI 的Primer-BLAST程序設計2對引物（5′-TGAAAATACCAGCTTTGGGA-3′，5′-TCGTATCTTGATCTATCCTACAAT-3′；5′-CTTTGCCTTATCCATCCTCA-3′，5′-TAACTCTAAGAAGGGGCGAA-3′），采用巢式PCR 策略擴增。PCR 體系為50 μL，包括2 × Easy Taq Super‐Mix（TransGen，北京）25 μL，DNA模板10 μL（20 ng/μL），正、反向引物各1 μL（10 μmol/L），滅菌去離子水13 μL。擴增采用PE-9700 型DNA 擴增儀，反應程序：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。利用1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，將條帶清晰且單一的PCR產物送至黑龍江箭速基因科技有限公司進行純化和雙向測序。

1. 3 數據分析

利用DNAstar軟件包的SeqMan校對雙向測序峰圖。利用ClustalW2［20］對所有Cyt b 序列進行多重序列比對。利用MEGA 11統計［21］序列堿基組成、突變位點數以及轉換/顛換比。利用DnaSP 6［22］確定單倍型，計算核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）、單倍型多樣性（haplotype diversity，h）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。

使用ModelFinder 2. 2. 2［23］根據BIC（Bayesian informationcriterion）標準選擇最佳堿基替換模型。利用MrBayes 3. 2［24］（密碼子1和2為HKY+F+I；密碼子3為GTR+F+G4）和IQ-TREE 2. 2. 2［25］（密碼子1和2為TN+F+R2；密碼子3 為TIM2+F+G4）分別構建BI（Bayesian inference）和ML（maximum likelihood）系統發育樹。BI 法將馬爾可夫鏈運行5 000 000 代，每100 代采樣一次，舍棄前面25% 的樹，由后驗概率（posterior probability，PP）評估置信度。ML法采用自舉法（bootstrap，BP）抽取1 000次檢驗分支可信度。利用POPART［26］基于中值連接法（median joiningmethod）構建單倍型網絡。利用Arlequin 3. 5［27］開展分子方差分析AMOVA（analysis of molecular variance），并計算種群間的遺傳分化指數（FST）。

利用DnaSP 6 進行中性檢驗（Tajima’s D，Fu’sFS），基于恒定群體模型（constant population size）估計核苷酸錯配分布。利用BEAST 1. 8. 4［28］的貝葉斯天際線圖（Bayesian skyline plot，BSP）分析種群歷史動態。基于最適替換模型（GTR+F+I+G4）和嚴格的分子鐘（0. 021/Ma［29］）獨立運行2次，每次運行200 000 000代，每200代采樣一次。BI和BSP的結果在Tracer 1. 7中［30］通過判斷所有參數的有效樣本量（effective sample size，ESS）是否大于200來確定是否收斂。

2 結果

2. 1 Cyt b 序列特點和遺傳多樣性分析

測序獲得85條Cyt b 基因全長序列（1 143 bp），已提交至NCBI（登錄號PP407082—PP407166）；結合在GenBank下載的1條尚志市的序列，共計86條黑龍江種群Cyt b 序列。序列平均堿基組成為：27. 81% A、24. 75% T、33. 87% C、13. 57% G，A + T含量（52. 56%）略高于C + G 含量（47. 44%）。檢測到64個變異位點（5. 6%），其中26個為簡約信息位點，38個為單突變位點。序列轉換顛換比為15. 4，沒有出現堿基插入/缺失現象。

220只紅喉歌鴝鑒定出138個Cyt b 基因單倍型（表1，表2）。其中，出現頻率較高的2個單倍型為H2（31次）、H9（9次），單倍型H2分布于7個種群、H9分布于3個種群（種群1、6、7）。黑龍江種群（種群1）具有42個獨特的新單倍型，以及8個共享單倍型。7 個種群都有較高的單倍型多樣性（h 為0. 934 ～1. 000），而核苷酸多樣性和平均核苷酸差異在不同的種群間差異較大。種群4、7遺傳多樣性較高（h 為0. 971 ～ 0. 982，π 為0. 008 0 ～ 0. 008 1，K為9. 142 9 ～9. 204 7），其次是種群2、3、5、6（h 為0. 960～ 1. 000，π 為0. 004 3～ 0. 005 9，K 為4. 964 3～ 6. 719 1）。種群1 的遺傳多樣性最低（h 為0. 934，π 為0. 003 0，K = 3. 405 2），主要體現在π 和K 兩個指標。

2. 2 種群遺傳結構和種群歷史動態分析

根據系統發育分析和單倍型網絡（圖2，圖3），138個Cyt b 基因單倍型可以劃分為3個支系，分別代表大陸種群（西部的Clade Ⅰ），庫頁島種群以及勘察加半島、千島群島、北海道種群（東部的Clade Ⅱ和Clade Ⅲ）。黑龍江種群的單倍型均聚集于西部支系、屬于大陸種群（圖2，圖3）。然而，3個支系間的系統發育關系尚未明確，ML樹和BI樹存在拓撲沖突。將3個支系展示在地圖上（圖1），發現7個種群都含支系Ⅰ的單倍型，其所占的比例由西向東逐漸降低，這與Spiridonova et al.［9?10］的結果一致。黑龍江種群不包括島嶼種群的單倍型，譜系混合的現象僅出現在海岸線及鄰近地區。雌雄個體在系統發育上無明顯區別。

7個種群的分子方差分析表明種群間變異和種群內變異相當，分別占總變異的51. 43%和48. 57%（表3）。將大陸種群（種群1、2、3、4、7）作為一個整體分析時，種群間變異略微提高（54. 12%）。種群1與種群4、5、6、7存在顯著分化（P lt; 0. 05）（表4），其中，與種群4屬于中等遺傳分化（FST = 0. 283），而與種群5、6、7 屬于高度遺傳分化（FST 為0. 432 ～0. 736）。

中性檢驗顯示（表2），除種群7的Tajima’s D 為正值外，其他種群均為負值，種群1 中差異極顯著（P lt; 0. 01）；所有種群的Fu’s FS均為負值，種群1、4、5、6差異極顯著（P lt; 0. 14）；種群1中性檢驗的值均最小（Tajima’s D = -2. 460 4，Fu’s FS = -26. 234 9）。這表明種群1最近經歷了明顯擴張，與核苷酸錯配分布呈現單峰曲線結果一致（圖4，雄∶雌= 0. 9∶1）。貝葉斯天際線圖（圖5）顯示，Clade Ⅲ群體在大約3. 5萬 ～ 4. 3萬a前有略微增長，Clade Ⅱ群體趨于穩定，而Clade Ⅰ群體在1. 5萬 ～ 5. 5萬a前經歷了快速增長。在屬于Clade Ⅰ的3 個種群中，只有種群1在2. 5萬 ～ 5. 5萬a前經歷了擴張。然而，種群1雌性群體的錯配分布為多峰特征，不同于雄性群體，不支持種群增長的推斷。

3 討論

遺傳多樣性是物種生存與進化的基礎，具有較高遺傳多樣性的種群有更強的適應性和生存能力［31?32］。h 和π 是評價遺傳多樣性的2個主要指標。h 關注單倍型的數目和頻率，與短期種群動態更為相關，而π 表示隨機2個單倍型核苷酸位點差異的數量，通常需要長時間積累［33］。根據Grant et al.［34］以h和π 評估種群遺傳多樣性水平的標準（臨界值分別是0. 5和0. 5%），黑龍江紅喉歌鴝種群h 較高、π 較低。然而，這2個指標都低于同屬于Clade Ⅰ的種群2和3，特別是π。這暗示黑龍江種群過去可能經歷了遺傳多樣性的丟失，然后通過種群擴張增加了h，但因時間較短，π 積累不足。結合黑龍江種群近期的擴張和其他種群的穩定，可能的解釋是該種群經歷了瓶頸事件。然而，由于分子標記的限制，無法獲取黑龍江種群更早期的動態。此外，考慮到黑龍江種群的h 仍低于其他種群，不能排除先前過度捕獵活動和生境破壞對該種群遺傳多樣性的影響。《國家重點保護野生動物名錄》將紅喉歌鴝增列為二級保護動物［5］，通過嚴格執法能減少非法捕捉行為。結合對黑龍江種群繁殖區棲息地的保護，特別是紅喉歌鴝偏好的森林、灌叢和草地等［11］，有利于維護其種群遺傳多樣性水平。

本研究表明紅喉歌鴝種群呈現較為清晰的遺傳結構（圖2，圖3），這與對蘆鹀（Emberiza schoenic?lus）［35］和煤山雀（Periparus ater）［36］的研究結果類似。不同的是，北長尾山雀（Aegithalos caudatus）受到不完全譜系分選（incomplete lineage sorting）或二次接觸（secondary contact）的影響而存在譜系混合［35］。黑龍江種群個體均屬于大陸種群單倍型、且與大陸沿海及島嶼種群（種群4、5、6、7）間均存在顯著分化。這證實了黑龍江種群屬于指名亞種，并厘清了島嶼單倍型（Clade Ⅲ）向大陸滲入的界限：海岸線附近、形成一個“過渡帶”，未深入大陸內部。這種“過渡帶”可由生態應力帶（tension zone）理論解釋［37］，即其是由個體擴散和自然選擇相互平衡產生的副產物。另外，大陸種群和島嶼種群可能具有不同的遷徙路線［12?15］，這可能會減少島嶼種群在遷徙過程中向大陸種群的滲透機會。

動物種群的擴張通常與末次盛冰期（last glacialmaximum，LGM，1. 6萬 ～ 2. 7萬a前［38］）后的地理分布的擴張有關［39］。然而，黑龍江種群在更新世晚期的LGM前經歷了種群的快速擴張（2. 5萬 ～ 5. 5萬a前），這可能與中國東北地區更新世晚期的氣候波動有關［40］。同時，該地區具有豐富森林棲息地和其他潛在避難所［41?42］，為紅喉歌鴝度過LGM提供了生存空間。類似的現象也出現在北美北方森林19種同域分布鳥類種群歷史動態的研究中［43］。值得注意的是，本研究BSP 分析使用的Cyt b 突變率為Weir etal.［29］估計的12個目鳥類的平均堿基替換速率。考慮到體型較小的紅喉歌鴝可能具有更高的堿基替換率［44］，這可能導致估計的種群擴張時間偏早。此外，與種群擴張相反，雌性群體的核苷酸錯配分布呈現多峰特征，這可能是雌性偏倚擴散（female-biaseddispersal）的結果［45?46］。環志研究發現雌性個體對領地的忠誠度較低，或者更難重新捕獲（own data）［13］。這也符合紅喉歌鴝的繁殖特性：雄鳥負責筑巢和領地防御，雌鳥通過選擇雄鳥及其領地參與繁殖；這導致雄性對出生地的環境和資源更加熟悉、傾向于留在出生地，而雌性則更傾向于向外擴散。然而，目前仍缺乏紅喉歌鴝雌性偏倚擴散的直接證據，對該現象的判斷還需結合更廣泛的宏微觀研究結果。

由于線粒體基因僅通過母系遺傳，無法涵蓋父系遺傳信息，因此可能無法提供完整的種群遺傳信息。對黑龍江紅喉歌鴝種群遺傳多樣性、遺傳結構的深度剖析還需要配合其他分子標記的輔助。