一株海南坡鹿源化膿隱秘桿菌的分離鑒定及生物學特性分析

關鍵詞：海南坡鹿；化膿隱秘桿菌；分離鑒定；藥敏試驗；毒力基因

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes，TP）又稱化膿放線菌，屬于放線菌科（Actinomycetaceae）隱秘桿菌屬（Trueperella）成員，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌［1?2］。1893 年，該菌首次在牛的膿汁中被發現，可引發肺炎、肝膿腫和乳房炎等化膿性病變，嚴重者會引發毒血癥或敗血癥導致個體死亡，對動物健康造成嚴重威脅［3?4］。目前，該菌在多種動物體內被發現，多見于豬、牛和羊等家畜，長期以來對養殖業健康發展造成巨大經濟損失并威脅人的安全［5?7］。化膿隱秘桿菌是一種條件致病菌，在隱秘桿菌屬中致病性最強，已證實該菌含有溶血素（Plo）、膠原結合蛋白（CbpA）、神經氨酸酶（NanH、NanP）和菌毛結合蛋白（FimA、FimC、FimE、FimG）等毒力因子，其中同時攜帶Plo 基因和NanH 基因的菌株的致病性要強于攜帶其他幾種毒力因子的菌株［8?10］。在臨床治療中因不合理使用抗生素，導致該菌耐藥水平不斷提升，給疫病的預防和治療帶來了嚴重困擾［11］。

海南坡鹿（Rucervus eldii hainanus）是國家一級重點保護野生動物，屬于鯨偶蹄目（Cetartiodactyla）鹿科（Cervidae），是坡鹿的亞種之一［12］，被IUCN評估為瀕危（EN）物種［13］。為了有效拯救該物種，1987年，國家林業部在東方市大田地區建立國家級自然保護區，對海南坡鹿實施一系列保護措施［14］。經過多年來的保護與發展，海南坡鹿種群數量得到穩定增長。當前，對于海南坡鹿的研究主要集中在種群遺傳、行為習性、生境選擇和營養等［15?18］，對于細菌感染的診治和預防方面研究報道相對較少。本研究采集海南坡鹿臉頰部膿液，通過細菌分離純化和16S rRNA基因測序，成功分離并鑒定出1株化膿隱秘桿菌，并對其主要的生物學特性進行研究，以期為今后化膿隱秘桿菌的防控與治療提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 病料

廣東省某動物園1只患病海南坡鹿，患病前期表現出精神沉郁，食欲廢絕，呼吸急迫，中期發現臉頰部隆起，麻醉后切開有膿汁流出，經過2周藥物治療患病動物有好轉。用無菌拭子在無菌操作下采集膿腫處膿汁后用保溫箱低溫送至實驗室。

1. 2 細菌分離純化與革蘭氏染色

無菌采集患病海南坡鹿臉頰部膿液，將其用三線法接種到血瓊脂平板（#024070，廣東環凱微生物科技有限公司），倒置于恒溫培養箱中37 ℃恒溫培養48 h，之后挑取單菌落再次接種到血瓊脂平板中培養，觀察細菌生長狀況及菌落特征并記錄。挑取單菌落經革蘭氏染色液試劑盒（#BA4016，珠海貝索生物技術有限公司）染色后在顯微鏡下觀察分析。

1. 3 分離菌16S rRNA 基因鑒定

利用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對分離菌16S rRNA基因進行PCR擴增。反應體系：2 × Taq Master Mix（ThermoFisher Scientific）10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，加ddH2O補足至20 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后用紫外線觀察后利用凝膠回收試劑盒（#D2500，美國OMEGA 公司）回收目的片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司測序。測序結果在NCBI進行BLAST對比分析。引物合成和基因測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司完成。

1. 4 分離菌生化試驗鑒定

參考《獸醫微生物學實驗指導》［19］方法進行生化試驗，挑取純化后的單菌落接種在生化微量鑒定管（杭州微生物試劑有限公司）中37 ℃恒溫培養48 h，觀察并記錄結果。

1. 5 分離菌藥敏試驗

分離菌參考美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）藥敏試驗指南［20］。選取β 內酰胺類、頭孢類、氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、喹諾酮類、氯霉素類、磺胺類和林可酰胺類共24種藥物，采用K-B法進行藥敏試驗。將分離菌用液體培養基（#CP4048P5，環凱微）菌液稀釋，終濃度為1 × 108 CFU/mL 左右，均勻涂布在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（#022542C，環凱微）上，將24種抗菌藥紙片（#Z210系列，溫州市康泰生物科技有限公司）按一定間距貼在培養基上，于恒溫培37 ℃養48 h 后觀察抑菌圈直徑。根據抑菌圈直徑判定分離菌株的藥敏性，用敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）記錄。

1. 6 分離菌毒力基因檢測

以分離菌作為模板，參考已有文獻報道［7，10］，經PCR 擴增化膿隱秘桿菌毒力相關基因Plo-g2、Plog1、NanP、NanH、FimA、CbpA、FimE、FimC 和FimG，引物信息見表1。

2 結果

2. 1 分離菌形態學觀察

分離菌接種到血瓊脂平板48 h后觀察可見微弱β 溶血、光滑濕潤、乳白色、中間凸起和邊緣整齊的圓形菌落（圖1A）。革蘭氏染色試驗顯示，分離菌呈陽性，鏡檢可見無莢膜、無芽孢，單個或聚集存在的兩端鈍圓短桿狀菌體（圖1B）。

2. 2 分離菌的16S rRNA 基因遺傳進化分析

利用細菌16S rRNA基因通用引物（27F/1492R）對分離菌進行PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在約為1 500 bp處有特異性條帶（圖2），與目的片段大小相符。將擴增產物回收并測序后在NCBI進行BLAST比對分析顯示，分離菌與MN027909. 1、HM246725. 1、KT191138. 1、KJ842125. 1、MN712476. 1、LC523905. 1、MN946520. 1、LC500013. 1、MN135984. 1和CP033902. 1十株化膿隱秘桿菌參考菌株基因序列同源性在98. 81%以上（圖3），由此確定該分離菌為化膿隱秘桿菌。

2. 3 生化試驗鑒定結果

對分離菌進行生化鑒定，結果顯示分離菌對蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖和果糖呈陽性，對乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、吲哚、接觸酶和硝酸鹽呈陰性。將生化結果與《伯杰細菌鑒定手冊》［23］對比發現，該結果與化膿隱秘桿菌的生化試驗結果高度相似，進一步表明分離菌為化膿隱秘桿菌（表2）。

2. 4 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，分離株對青霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、丁胺卡那、妥布霉素、紅霉素、氧氟沙星、氯霉素、磺胺甲惡唑和甲氧芐啶顯示耐藥；對頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢吡肟、鏈霉素和諾氟沙星顯示中介；對阿莫西林、頭孢哌酮、頭孢呋辛、慶大霉素、阿奇霉素、多西環素、恩諾沙星、左氧氟沙星和林可霉素顯示敏感（表3）。

2. 5 毒力基因檢測結果

對分離菌進行化膿隱秘桿菌9種主要毒力基因PCR 擴增，凝膠電泳結果顯示在1 419、1 286、791、781、605、775、843 bp處獲得特異性條帶，與目的片段大小相符，表明該分離株含有Plo-g2、Plo-g1、NanP、NanH、FimA、FimE 和FimC 七種毒力基因，而不含CbpA 和FimG（圖4）。

3 討論

化膿隱秘桿菌是隱秘桿菌屬中致病性最強的條件致病菌，在各地均有人和動物感染的報道［24?26］。近年來，國內關于化膿隱秘桿菌的相關報道呈上升趨勢，野生動物源化膿隱秘桿菌的報道也逐漸增多，對野生動物造成了嚴重的危害，但該菌在野生動物防治體系方面尚不完善，為該病的診治帶來了困難［27?29］。本試驗從患病海南坡鹿臉頰部膿液中分離到1株化膿隱秘桿菌，表明該細菌病在野生動物中越來越流行，提示應加強對該病的監測與防控。

目前，化膿隱秘桿菌尚無有效疫苗，主要是通過抗菌藥物治療，但抗菌藥物的濫用會使細菌的耐藥性增強，甚至出現多重耐藥性的現象［30?31］。本研究藥敏試驗顯示，分離株對青霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、丁胺卡那、妥布霉素、紅霉素、氧氟沙星、氯霉素、磺胺甲惡唑和甲氧芐啶耐藥，表明野生動物源的化膿隱秘桿菌出現了一定的多重耐藥性，但仍然可以選擇阿莫西林、頭孢哌酮、頭孢呋辛、慶大霉素、阿奇霉素、多西環素、恩諾沙星、左氧氟沙星和林可霉素等敏感抗菌藥物進行治療。國內外有報道該菌對氨基糖苷類、磺胺類、β-內酰胺類以及酰胺醇類等抗生素耐藥現象嚴重，對大多數抗生素具有耐藥性［11］。雖然本試驗分離的海南坡鹿源化膿性隱秘桿菌對多種抗菌藥物敏感，但不能忽視對該菌耐藥性的跟蹤監測，防治過度使用藥物造成多重耐藥株的出現，另外還需進一步地全面研究化膿性隱秘桿菌的耐藥機制，進而保護種群健康。

病原菌的致病性與所攜帶的致病因子密切相關。Plo 是編碼溶血素基因，是化膿隱秘桿菌最主要的毒力基因，能溶解宿主紅細胞、多形核中性粒細胞和巨噬細胞等，對多種細胞具有毒性作用［32］。Fim是編碼菌毛結合蛋白基因，與宿主細胞的黏附有關，可以增強細菌在組織中的定殖［33］。Nan 是編碼神經氨酸酶的基因，能夠增強細菌的粘附力和感染力［34］。本試驗分離菌檢測到Plo-g2、Plo-g1、NanP、NanH、FimA、FimE、FimC 七種毒力基因。這表明分離株可能具有很強的致病性和感染性，防控不可忽視。化膿隱秘桿菌的致病力同時還會受到宿主內在因素、與其他病原菌的協同作用以及各種毒力因子的差異性表達等多種因素的影響，它們共同作用決定了該菌的致病力［10］。因此，在日常飼養中，需要適當增加維生素、礦物質與氨基酸，提高動物的免疫力，同時需對環境經常消毒，降低其他病原菌感染的風險。

綜上，本試驗從海南坡鹿體中成功分離到1株化膿隱秘桿菌，并對其主要生物學特性進行了分析，這有助于為野生動物源化膿隱秘桿菌的防治和深入研究提供參考依據和材料。