芍藥苷對潰瘍性結腸炎小鼠氧化應激的影響及機制

關鍵詞芍藥苷；潰瘍性結腸炎；氧化應激；AMPK/Nrf2通路

潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種反復發作的慢性炎癥性腸病，可從遠端開始向近端延伸直至累及整個結腸，以腹瀉、腹痛、里急后重、黏液膿血便和體重減輕等為主要臨床表現。近年來，UC的患病率和復發率逐年上升，盡管其病因尚不清楚，但有研究證實，UC的發生與遺傳因素、環境因素、個體因素（機體炎癥、氧化應激、免疫失衡）密切相關[1]。在UC炎癥反應期，炎癥細胞可募集到損傷部位，使得耗氧量增加、氧自由基生成增多；同時，炎癥細胞還可分泌促炎因子，進一步刺激活性氧的產生，從而導致機體發生氧化應激反應，致使腸道黏膜屏障受損[1]。腺苷一磷酸活化的蛋白激酶（adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK）/核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）是重要的抗炎和抗氧化信號通路，激活此通路可減少促炎因子釋放、減輕機體氧化應激損傷，從而緩解UC癥狀[2]。

目前，臨床治療UC的常規藥物效果有限且毒副作用大，患者復發率極高，而天然植物及其單體具有療效好、副作用少的優點，備受學界關注[3]。芍藥苷作為中藥白芍的主要活性成分，在多種治療UC的方劑中廣泛存在，具有抗炎、抗氧化、調節免疫等藥理活性[4]。本課題組前期研究表明，芍藥苷可降低UC小鼠血清中腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子水平，上調AMPK、自噬相關蛋白Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）mRNA的表達，下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）、p62mRNA的表達，增強細胞自噬，減輕UC小鼠的腸黏膜損傷，緩解UC癥狀[5]?？紤]到芍藥苷具有較強的抗氧化作用，而氧化應激是UC發生發展的重要因素之一[1]，故本研究擬從氧化應激角度探討芍藥苷對UC小鼠的影響及潛在機制，以期為芍藥苷用于UC治療及相關藥物研發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括2720ThermalCycler型聚合酶鏈式反應（PCR）儀、7300型實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），SPECTROstarNano型多功能酶標儀（德國BMGLabtech公司），HT7700型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），PowerPac型電泳儀、小型電泳槽和轉印槽（美國Bio-Rad公司），OI600MF型全自動化學發光凝膠成像系統（廣州光儀生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號S31585，純度＞98%）、AMPK抑制劑CompoundC的對照品（批號S24HS195965，純度＞98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextransulfatesodium，DSS；批號S8634）購自美國MP公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號YX-130401M）購自上海優選生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）試劑盒（批號S0101M）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）試劑盒（批號S0059S）均購自上海碧云天生物技術股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液（批號G1005）購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒（批號AR1110）、鼠源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號BM0627）均購自德國BosterBiological公司；兔源AMPK、Nrf2、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）、閉合蛋白（occludin）、密封蛋白1（claudin-1）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗（批號分別為10929-2-AP、16396-1-AP、10701-1-AP、27260-1-AP、10305-1-AP、SA00001-2、SA00001-1）均購自美國Proteintech公司；兔源磷酸化AMPK（phosphorylatedAMPK，p-AMPK）抗體（批號CY5608）購自美國Abways公司；高靈敏度ECL化學發光試劑盒（批號20230406）購自南京建成生物工程研究所；電鏡固定液（批號G1102）購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

本研究選用SPF級雄性BALB/c小鼠56只，體重為（20±2）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有動物均在溫度（20±5）℃、相對濕度30%～50%、每12h自然光照/黑暗循環條件下飼養。本實驗方案已通過長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（批準編號2023477）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

所有小鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組，模型組，抑制劑組（CompoundC20mg/kg，劑量參考相關文獻[6]設置），芍藥苷低、中、高劑量組（芍藥苷12.5、25、50mg/kg，劑量根據預實驗結果設置）和芍藥苷高+抑制劑組（芍藥苷50mg/kg+CompoundC20mg/kg），每組8只。除對照組外，其余各組小鼠均自由飲用4%DSS溶液5d以構建UC模型[7]。隨后，芍藥苷各劑量組小鼠灌胃相應劑量的芍藥苷（以水為溶劑，灌胃體積為0.2mL），并腹腔注射生理鹽水0.2mL；抑制劑組小鼠腹腔注射CompoundC藥液（以生理鹽水為溶劑，注射體積為0.2mL），并灌胃水0.2mL；對照組和模型組小鼠灌胃水0.2mL，并腹腔注射生理鹽水0.2mL；每天1次，連續7d。

2.2 小鼠體重記錄、結腸長度測量及標本收集

實驗期間，每天稱定并記錄各組小鼠的體重。末次給藥24h后，以吸入CO2麻醉后將小鼠處死，分離其結腸，拍照并測量長度；以生理鹽水漂洗結腸后，隨機選取各組6只小鼠相同部位的結腸組織，裁剪到合適大小，于2min內放入2.5%戊二醛溶液中固定，用于透射電鏡觀察。另取上述小鼠相同部位、相同長短的結腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于組織病理學分析；取剩余結腸組織，剪開清洗內容物后，于－80℃下凍存，用于相關指標檢測。

2.3 小鼠結腸組織中氧化應激指標檢測

隨機選取“2.2”項下各組小鼠凍存的結腸組織適量，加生理鹽水，勻漿，再于4℃下以3000r/min離心10min，取上清液。按照試劑盒說明書方法，使用酶標儀檢測其中MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

2.4 小鼠結腸組織病理學形態觀察

隨機選取“2.2”項下各組小鼠固定于4%多聚甲醛溶液中的結腸組織適量，經乙醇梯度脫水、常規石蠟包埋后切片（厚約4μm）。取切片，進行HE染色，使用顯微鏡觀察其病理改變并進行組織病理學評分（組織病理學評分＝黏膜水腫評分+炎癥細胞浸潤評分+上皮完整性評分+上皮增生比例評分），具體標準[7]見表1。

2.5 小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接情況觀察

取“2.2”項下各組小鼠固定于2.5%戊二醛溶液中的結腸組織適量，以0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，用1%鋨酸固定液固定2h，再經梯度乙醇和丙酮脫水、滲透、包埋后切片（厚60～80nm）。取切片，進行醋酸-枸櫞酸鉛雙重染色，使用透射電子顯微鏡觀察其結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接情況并采集圖像。

2.6 小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。隨機選取“2.2”項下各組小鼠凍存的結腸組織適量，以TRIzol法提取總RNA，經濃度、純度檢測后，逆轉錄合成cDNA。以上述cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系共20μL，包括cDNA模板2μL、正/反向引物各1μL、2×TalentqPCRPreMix10μL、10mmol/LdNTPMixture1μL、Oligo-dT0.5μL、核糖核酸酶抑制劑0.5μL、AMV逆轉錄酶0.5μL、無核糖核酸酶水3.5μL。反應條件為95℃預變性15min；95℃變性15s，60℃退火31s，72℃延伸31s，共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，按照2－ΔΔCt法計算AMPK、Nrf2mRNA的相對表達量，結果以對照組為參照進行歸一化處理。本研究所用正/反向引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計、合成，具體信息見表2。

2.7 小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1蛋白表達的檢測

隨機選取“2.2”項下各組小鼠凍存的結腸組織適量，剪碎后置于1.5mL離心管中，加入組織裂解液，充分勻漿，以12000r/min離心10min，取上清液，采用BCA法進行蛋白定量，并于95℃加熱10min使變性。取變性蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移至硝酸纖維素膜上，以封閉液封閉15min；以PBST緩沖液洗膜后，加入β-actin、AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1一抗（稀釋比例分別為1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶8000、1∶2000、1∶2000、1∶2000），于4℃孵育過夜；以PBST緩沖液洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶1000），于室溫孵育1h；用高靈敏度ECL化學發光試劑顯影，于化學發光凝膠成像系統上成像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白β-actin的條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量，以p-AMPK與AMPK蛋白的灰度值比值作為AMPK蛋白的磷酸化水平。

2.8 統計學方法

使用SPSS19.0軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 芍藥苷對小鼠體重的影響

對照組小鼠飲食正常，體重呈逐漸上升趨勢；模型組和抑制劑組小鼠的體重總體呈下降趨勢；經芍藥苷干預后，小鼠體重呈逐漸上升趨勢。第12天，模型組小鼠的體重較對照組顯著降低（P＜0.01）；芍藥苷各劑量組小鼠的體重均較模型組顯著升高（P＜0.05），而抑制劑組與模型組相當（P＞0.05）；芍藥苷高+抑制劑組小鼠的體重較芍藥苷高劑量組顯著降低（P＜0.01）。結果見圖1。

3.2 芍藥苷對小鼠結腸長度的影響

與對照組比較，模型組小鼠的結腸長度顯著縮短（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組小鼠的結腸長度均顯著延長（P＜0.05），而抑制劑組則與模型組相當（P＞0.05）；與芍藥苷高劑量組比較，芍藥苷高+抑制劑組小鼠的結腸長度顯著縮短（P＜0.01）。結果見圖2。

3.3 芍藥苷對小鼠結腸組織中氧化應激指標的影響

與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px活性均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，芍藥苷各劑量組小鼠結腸組織中MDA含量均顯著降低，SOD、GSH-Px活性均顯著升高（P＜0.05）；抑制劑組小鼠除SOD活性顯著降低（P＜0.05）外，其余指標均與模型組相當（P＞0.05）。與芍藥苷高劑量組比較，芍藥苷高+抑制劑組小鼠結腸組織中SOD、GSH-Px活性均顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

3.4 芍藥苷對小鼠結腸組織病理學形態的影響

對照組小鼠結腸組織上皮完整，杯狀細胞排列整齊，隱窩結構完整；模型組、抑制劑組小鼠結腸組織有不同程度的損傷，可見黏膜水腫、上皮增生、大量炎癥細胞浸潤、結腸上皮潰瘍明顯且隱窩受損嚴重；經藥物干預后，芍藥苷各劑量組小鼠結腸各層次結構均有明顯改善，杯狀細胞未見明顯減少，隱窩結構基本正常，僅有少量炎癥細胞浸潤；而芍藥苷高+抑制劑組小鼠結腸組織病理改變較芍藥苷高劑量組嚴重。結果見圖3A～3G。

與對照組比較，模型組小鼠的組織病理學評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組小鼠的組織病理學評分顯著降低（P＜0.05），而抑制劑組的組織病理學評分顯著升高（P＜0.05）；與芍藥苷高劑量組比較，芍藥苷高+抑制劑組小鼠的組織病理學評分顯著升高（P＜0.01）。結果見圖3I。

3.5 芍藥苷對小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接的影響

對照組小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接結構完整，腸上皮細胞表面的微絨毛排列整齊，細胞間隙狹窄。模型組、抑制劑組小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接結構松散且不完整，微絨毛稀疏、排列雜亂無章、長度縮短，細胞間隙增寬，細胞通透性增加。芍藥苷各劑量組小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接的受損情況均有不同程度改善，連接緊密度有所增加，細胞間隙有所縮窄，微絨毛排列整齊。芍藥苷高+抑制劑組小鼠結腸組織中腸上皮細胞間緊密連接的受損情況較芍藥苷高劑量組嚴重。結果見圖4。

3.6 芍藥苷對小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2mRNA的表達均顯著下調（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2mRNA的表達均顯著上調（P＜0.05），而抑制劑組上述mRNA的表達均顯著下調（P＜0.05）；與芍藥苷高劑量組比較，芍藥苷高+抑制劑組小鼠結腸組織中AMPK、Nrf2mRNA的表達均顯著下調（P＜0.01）。結果見圖5。

3.7 芍藥苷對小鼠結腸組織中p-AMPK、AMPK、Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1蛋白的表達均顯著降低或下調（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組小鼠結腸組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1蛋白的表達均顯著升高或上調（P＜0.01），而抑制劑組上述蛋白的磷酸化水平和表達均顯著降低或下調（P＜0.01）；與芍藥苷高劑量組比較，芍藥苷高+抑制劑組小鼠結腸組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和Nrf2、occludin、claudin-1蛋白的表達均顯著降低或下調（P＜0.01）。結果見圖6、表4。

4 討論

UC是一種常見的消化系統疾病，近年來隨著人們飲食結構的變化，其患病率逐年增加。由于UC具有病因復雜和病情反復發作的特征，現有藥物難以將其有效治愈，因此迫切需要開發安全有效的新藥物。本研究基于AMPK/Nrf2信號通路初步探討了芍藥苷對UC小鼠氧化應激的影響及潛在機制，旨在為芍藥苷的應用和UC治療藥物的研發提供參考。

DSS自由飲用法具有操作簡便、重復性好、成功率高、病變與人類UC相似的優點，已被廣泛應用于UC相關研究領域[8]。研究指出，DSS可通過損傷腸上皮細胞間的緊密連接和基底膜，從而增加腸道滲透性，使病原體進入腸道壁內，激活免疫炎癥反應，最終誘導UC[2]。研究證實，腸道上皮功能障礙是UC發生和復發的重要因素，而緊密連接則是決定腸道上皮屏障功能能否正常發揮的關鍵[9]。緊密連接涉及occuludin、claudin-1、閉鎖小帶蛋白及連接黏附分子等結構蛋白。其中，occludin是一種跨膜蛋白，不僅參與腸上皮滲透性屏障的形成、小分子物質運輸的調節、細胞極性的維持，而且參與細胞黏附的調節和細胞信號的接收、傳遞；claudin-1與occludin結構類似，也是一種跨膜蛋白，參與構成腸道滲透性屏障，兩者均是腸道上皮屏障完整性的標志物[10]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠結腸長度顯著縮短，體重有所減輕，結腸組織病理學評分顯著升高，結腸組織中occludin、claudin-1蛋白的表達均顯著下調；經芍藥苷干預后，小鼠結腸長度有所恢復，體重有所增加，結腸病理學損傷得以減輕且組織病理學評分顯著降低，occludin、claudin-1蛋白的表達均顯著上調。透射電子顯微鏡觀察結果也顯示，經芍藥苷干預后，小鼠腸上皮細胞間緊密連接的受損情況得以明顯改善，連接緊密度增加，細胞間隙縮窄，微絨毛排列整齊，提示芍藥苷能修復結腸組織中腸上皮細胞的緊密連接。

AMPK/Nrf2是調控機體氧化還原穩態的重要信號通路。當機體發生氧化應激時，作為氧化還原感應器的Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1迅速解離，然后轉移至細胞核并與抗氧化相應元件結合，促進抗氧化分子（HO-1、SOD和GSH-Px等）的合成和釋放[11]。其中，HO-1作為抗氧化酶類的重要一員，主要參與催化血紅素的分解代謝，由此產生的膽綠素、膽紅素具有清除活性氧的作用；MDA是脂質過氧化產物，其水平的高低可反映細胞氧化應激損傷的嚴重程度；SOD作為一種重要的內源性抗氧化劑，可保護組織免受活性氧的損傷；GSH-Px作為一種體內廣泛存在的過氧化物分解酶，其能催化有毒的谷胱甘肽轉變為無毒的氧化型谷胱甘肽，從而使細胞膜的結構和功能免受過氧化物的損傷[12―13]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px活性均顯著降低，Nrf2、HO-1蛋白及Nrf2mRNA的表達均顯著下調；經芍藥苷干預后，小鼠結腸組織中MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px活性均顯著升高，Nrf2、HO-1蛋白和Nrf2mRNA的表達均顯著上調，提示芍藥苷可增加UC小鼠的抗氧化能力，減輕氧化應激。相關研究表明，激活Nrf2、HO-1等抗氧化應激蛋白可有效緩解UC的病情進展[2]，本研究上述結果也支持這一觀點。

AMPK是細胞能量穩態的調節器，參與代謝、氧化應激、炎癥、凋亡和自噬等生理病理過程的調節。已有研究表明，芹菜素、芍藥苷等多種活性成分可通過激活AMPK（即使其磷酸化）來促進Nrf2核易位，增加核內Nrf2的積累，促進抗氧化酶的表達，減輕氧化應激，從而治療哮喘和膿毒癥等多種疾病[14]。基于此，本研究采用AMPK抑制劑CompoundC進行干預，考察芍藥苷緩解UC小鼠氧化應激的作用是否與調節AMPK/Nrf2通路有關。結果顯示，當腹腔注射抑制劑后，小鼠結腸組織病理改變、腸上皮細胞間緊密連接程度及各定量指標與模型組相當或更差；在灌胃高劑量芍藥苷的基礎上聯用抑制劑后，芍藥苷對UC小鼠氧化應激的改善作用則被抑制劑顯著逆轉，提示芍藥苷可通過激活AMPK/Nrf2通路來抑制氧化應激，從而改善小鼠UC。

綜上所述，芍藥苷可修復小鼠的腸上皮細胞損傷，改善腸上皮細胞間緊密連接，并上調相關蛋白、促抗氧化分子的表達和釋放，從而改善UC；其作用機制可能與激活AMPK/Nrf2抗氧化通路有關。但芍藥苷對UC的干預作用可能涉及其他通路，尚需進一步完善。