基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討扶正解毒抗癌湯治療黑色素瘤的作用機(jī)制

〔摘要〕 目的 探討扶正解毒抗癌湯（FZJDD）治療黑色素瘤的分子機(jī)制。方法 TCMSP和TCMID的數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中檢索FZJDD有效化學(xué)成分及各成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn);GeneCards、OMIM、TTD等數(shù)據(jù)查詢庫中篩選黑色素瘤相關(guān)靶點(diǎn)，獲得“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)，STRING 11.5與DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析獲取核心靶點(diǎn)，Cytoscape 3.8.1構(gòu)建FZJDD治療黑色素瘤中藥-作用靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，GO富集分析與KEGG富集分析獲取FZJDD治療黑色素瘤的關(guān)鍵生物學(xué)過程及信號通路。借助qPCR及Western blot方法驗(yàn)證相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的作用。結(jié)果 獲得FZJDD有效成分47個(gè)，“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)168個(gè)，富集到的信號通路主要包括磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）等信號通路;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ZJDD能夠有效降低黑色素瘤 A375 細(xì)胞增殖，抑制PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的蛋白及mRNA表達(dá)水平（Plt;0.05）。結(jié)論 FZJDD可以通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路，發(fā)揮抗炎、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用治療黑色素瘤，其中對PI3K/AKT通路的調(diào)控可能是其關(guān)鍵機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕 扶正解毒抗癌湯;黑色素瘤;PI3K/AKT信號通路;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.006

Mechanism of action of Fuzheng Jiedu Kang'ai Decoction in treating melanoma based on network pharmacology

TU Yaling1， CHEN Qihua1*， XI Jianyuan1， QI Lin1， ZHAO Duoduo2， YU Huanyu2

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To explore the molecular mechanism of Fuzheng Jiedu Kang'ai Decoction （FZJDD） in the treatment of melanoma. Methods The effective chemical components of FZJDD and their corresponding targets were retrieved from the databases and literature of TCMSP and TCMID. Melanoma-related targets were screened using databases such as GeneCard， OMIM， and TTD to obtain intersection targets of \"drug-disease\". Protein-protein interaction （PPI） network analysis was performed using STRING11.5 and DAVID databases to identify core targets. Cytoscape 3.8.1 was used to construct a Chinese medicines-action targets-pathway networks for FZJDD in treating melanoma. Gene ontology function （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis were conducted to identify the key biological processes and signaling pathways involved in treating melanoma with FZJDD. Quantitative real-time PCR （qPCR） and Western blot were used to validate the roles of key proteins in related signaling pathways. Results A total of 47 active components of FZJDD and 168 \"drug-disease\" intersection targets were identified. The enriched signaling pathways mainly included phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （AKT） signaling pathway， among others. In vitro cell experiments showed that FZJDD effectively inhibited the proliferation of melanoma A375 cells and suppressed the protein and mRNA expression levels of key proteins in PI3K/AKT signaling pathway， including PI3K， AKT， and the mammalian target of rapamycin （mTOR） （Plt;0.05）. Conclusion FZJDD can treat melanoma by exerting anti-inflammatory effects and promoting tumor cell apoptosis through multiple components， targets， and pathways， among which the regulation of the PI3K/AKT pathway may be its key mechanism.

〔Keywords〕 Fuzheng Jiedu Kang'ai Decoction; melanoma; PI3K/AKT signaling pathway; network pharmacology; mechanism of action

黑色素瘤系源自表皮黑素細(xì)胞在活化或基因變異后所形成的腫瘤，其是遺傳、體質(zhì)與環(huán)境因素間錯(cuò)綜復(fù)雜的交互作用的結(jié)果[1-2]，也是皮膚癌中臨床癥狀最為顯著、死亡率最高的一種類型[3]。流行病學(xué)研究顯示，在全球多數(shù)區(qū)域內(nèi)黑色素瘤的發(fā)病率在男性群體中顯著高于女性，且呈年輕化傾向，在25～50歲這一年齡段內(nèi)本病發(fā)病率呈現(xiàn)出線性上升的趨勢，給全球的醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了沉重的壓力與負(fù)擔(dān)[4-6]。在當(dāng)前的黑色素瘤的臨床治療中手術(shù)切除腫瘤及其周圍正常組織仍是其核心治療策略。對于那些腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)治療難以徹底治愈，迄今為止化學(xué)治療依舊是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者所依賴的主要治療方案[7-8]，但多數(shù)患者在短時(shí)間內(nèi)便面臨繼發(fā)性耐藥的棘手難題，且化學(xué)治療存在大量的毒副作用，因此探索臨床有效且毒副作用小的治療方法，以期實(shí)現(xiàn)更持久的治療效果迫在眉睫[9]。中醫(yī)在黑色素瘤的治療領(lǐng)域內(nèi)展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，其治療手段無論是內(nèi)服還是外敷，均獲得了一定成效[10]。

中醫(yī)學(xué)并無黑色素瘤這一病名，根據(jù)其癥狀、體征及發(fā)病特點(diǎn)等，可以將黑色素瘤歸屬于“黑痣”“黑疔”“惡瘡”“失榮”等范疇[11]。《諸病源候論·黑痣候》中記載：“黑痣者，風(fēng)邪搏于血?dú)猓兓病７蛉搜獨(dú)獬涫ⅲ瑒t皮膚潤悅，不生疵瘕，若虛損，則黑痣變生。”據(jù)此可以推斷正虛是黑色素瘤病因之一[12]。《醫(yī)宗金鑒·卷六十四》中對其記載：“其證初起，狀如痰核，推之不動(dòng)，堅(jiān)硬如石，皮色如常，日漸長大。由憂思、恚怒、氣郁、血逆與火凝結(jié)而成，日久難愈……色現(xiàn)紫斑，腐爛浸淫，滲流血水，瘡口開大，努肉高突，形似翻花瘤證。”由此可知，黑色素瘤的另一病因?yàn)樾岸聚諏?shí)[13]。扶正解毒抗癌湯（FZJDD）系陳其華教授團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)多年臨床實(shí)踐與前人智慧結(jié)晶，該方秉承益氣扶正、除瘤祛邪之核心理念，展現(xiàn)出顯著的臨床療效，然其具體作用機(jī)制尚待深入探究。陳教授獨(dú)辟蹊徑，指出黑色素瘤之根源在于正氣不足、血瘀毒聚，故本方融扶正與祛邪于一體，通過強(qiáng)化脾胃功能、促進(jìn)氣血生成以扶正氣，同時(shí)強(qiáng)調(diào)清熱解毒與活血化瘀，旨在消除病邪、抑制腫瘤發(fā)展。為進(jìn)一步探索FZJDD治療黑色素瘤的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，科學(xué)系統(tǒng)地探索其藥效機(jī)制，并輔以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其作用路徑與靶點(diǎn)，力求為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1" 中藥化學(xué)成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測" 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medi?cine Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com）及中藥綜合數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，https：//www.megabion-et.org/tcmid），針對黃芪、當(dāng)歸、三棱、莪術(shù)、半枝蓮等中藥材，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、半衰期（half-life，HL）gt;4 h的篩選條件[14]，深入檢索并篩選出高活性化學(xué)成分。隨后，將篩選出的活性成分的“Mol ID”輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫的“Related Targets”庫中，以檢索相應(yīng)的靶點(diǎn)基因信息。進(jìn)一步利用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）對收集到的靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn)，并剔除無效及重復(fù)的靶點(diǎn)，最終獲取標(biāo)準(zhǔn)化的基因名稱。

1.1.2" 黑色素瘤疾病靶點(diǎn)收集及預(yù)測" 在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，https：//omim.org）以及TTD（Therapeutic Target Database，http：//db.idrblab.net/ttd）3個(gè)數(shù)據(jù)庫中，通過鍵入關(guān)鍵詞“Melanoma”進(jìn)行深度檢索，旨在發(fā)掘與該疾病緊密相關(guān)的靶點(diǎn)信息[15]。隨后，導(dǎo)出包含這些基因靶點(diǎn)的Excel表格，進(jìn)行篩選去重，以備后續(xù)分析使用。將獲得的藥物靶點(diǎn)基因和黑色素瘤疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲得FZJDD治療黑色素瘤的靶點(diǎn)基因，并以韋恩圖展示。

1.1.3" “藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建" 利用Cytoscape 3.8.1軟件，精準(zhǔn)映射FZJDD在黑色素瘤治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因及其活性成分;隨后，依托STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）與DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)[16]。

1.1.4" GO富集分析和KEGG通路分析" 將FZJDD治療黑色素瘤的藥物-疾病交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），以Plt;0.05為篩選條件，對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析與KEGG富集分析。利用微生信在線平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn）將GO及KEGG通路富集結(jié)果繪制成柱狀圖和氣泡圖[17-18]。

1.2" 主要試劑與儀器

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司，貨號分別為R8758、10099141）;胰酶消化液、PBS緩沖液、DNA凝膠加樣緩沖液（6×）、Goat anti-Mouse IgG （H+L） Secondary Antibody，HRP及Goat anti-Rabbit IgG （H+L） Secondary Antibody， HRP（美國Abiowell公司，貨號：AWC0232、AWC0409、AWR0103、AWS0001、AWS0002）;磷脂酰肌醇三激酶（phosphat?idylinositol 3-kinase， PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國proteintech公司，貨號分別為20584-1-AP、10176-2-AP、12789-1-AP、66009-1-Ig）。超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD）;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本松下公司，型號：MCO-20AIC）;S-23 高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀動(dòng)力測試儀器有限公司，型號：H1650R）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號：B-2744）;電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYY-2C）。其余設(shè)備均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心提供。

1.3" 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1" 細(xì)胞來源" 本研究所使用的黑色素瘤A375 細(xì)胞株，購自上海細(xì)胞研究所，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心保存。

1.3.2" 動(dòng)物來源" 選取SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度范圍22～26 ℃，濕度范圍 55%～60%，自由攝食，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。動(dòng)物倫理批號：LL20210516025。

1.3.3" 含藥血清制備" 本研究中FZJDD（黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、三棱10 g、莪術(shù)10 g、半枝蓮10 g）飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。按比例配制好藥材進(jìn)行煎藥，將煎藥液混合后過濾、去渣、濃縮。根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[19]中人與動(dòng)物臨床給藥劑量換算后，借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮為1.8 g/mL，置于無菌棕色瓶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩D大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白血清組及FZJDD組，其中空白血清組15只、FZJDD組15只。FZJDD組大鼠予以2倍臨床等效劑量FZJDD水煎劑灌胃，每次3 mL，每天1次;空白血清組大鼠予同體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃7 d后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，經(jīng)過離心（3 000 r/min離心5 min，離心半徑16 cm）、過濾、滅活后吸出上清液即為含藥血清或空白血清。

1.3.4" 細(xì)胞培養(yǎng)與分組" 黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)基由含10%胎牛血清的RPMI 1640組成，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將黑色素瘤A375細(xì)胞分為4組，分為空白血清組、FZJDD含藥血清組、陽性藥物組、聯(lián)合用藥組。空白血清組為黑色素瘤A375細(xì)胞給予空白血清干預(yù);FZJDD含藥血清組給予FZJDD含藥血清（最佳濃度14.15%）干預(yù);陽性藥物組給予30 μmol/L達(dá)卡巴嗪培養(yǎng)基干預(yù);聯(lián)合用藥組給予FZJDD含藥血清（最佳濃度14.15%）+30 μmol/L達(dá)卡巴嗪培養(yǎng)基干預(yù)。各組干預(yù)24 h后進(jìn)行檢測。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正解毒抗癌湯含藥血清對黑色素瘤A375細(xì)胞24 h的 IC50劑量為14.15%，綜合用藥原則和此次實(shí)驗(yàn)的研究目的，擬選擇14.15%的含藥血清作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。

1.3.5" 細(xì)胞增殖檢測" 采用CCK-8法[20]檢測各組黑色素瘤A375細(xì)胞增殖率，每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。具體步驟為：將黑色素瘤A375細(xì)胞懸液以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，并在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。之后分組干預(yù)，對照組予空白血清干預(yù)，F(xiàn)ZJDD組給予FZJDD含藥血清干預(yù)，陽性對照組予達(dá)卡巴嗪干預(yù)，聯(lián)合對照組予FZJDD含藥血清+達(dá)卡巴嗪干預(yù)。處理24 h。采用CCK-8檢測細(xì)胞抑制率，在37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)孵育2 h，測定450 nm的波長的吸光度值。細(xì)胞抑制率（%）=（1-干預(yù)組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3.6" qPCR法檢測PI3K、AKT、mTOR mRNA水平表達(dá)" 選取處于對數(shù)生長期的黑色素瘤A375細(xì)胞，分組干預(yù)，細(xì)胞處理方法同1.3.5，用Trizol試劑提取各組A375細(xì)胞總RNA，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，再用2-ΔΔCt法求算目的基因的表達(dá)量，引物序列見表1。

在無核酸酶的離心管中加入TB Green Premix Ex Taq 10 μL，加上下游引物各0.4 μL，加入第1步得到的cDNA模板2 μL，混勻，實(shí)時(shí)上機(jī)檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，同時(shí)收集熒光，40個(gè)循環(huán)。用相對表達(dá)量=2-△△Ct公式分析計(jì)算各個(gè)組的表達(dá)情況。

1.3.7" Western blot法檢測PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)" 黑色素瘤A375細(xì)胞在分組干預(yù)24 h 后，在4 ℃環(huán)境下，向適量的RIPA裂解液中加入預(yù)混的PMSF（比例為PMSF∶RIPA=1∶100）。使用細(xì)胞刮刀仔細(xì)地將細(xì)胞碎片刮入EP管內(nèi)，并在冰上進(jìn)行持續(xù)的裂解，時(shí)長為30 min，后進(jìn)行30 s的超聲處理，以確保細(xì)胞徹底裂解。裂解完成后，提取各組A375細(xì)胞的蛋白裂解物，12 000 r/min離心15 min，離心半徑16 cm，抽取上清液后按照BCA蛋白定量試劑盒使用操作檢測蛋白濃度。電泳后添加5%胎牛血清白蛋白37 ℃封閉1.5 h，洗膜后添加PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）抗體，一抗4 ℃孵育過夜。二抗37 ℃孵育1.5 h顯影，結(jié)果運(yùn)用Image Lab軟件進(jìn)行處理。

1.4" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)結(jié)果以“x±s”表示，組間比較采用方差分析，兩兩樣本之間的比較則采用LSD-t檢驗(yàn)，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" FZJDD有效成分及治療黑色素瘤潛在靶點(diǎn)

通過TCMSP檢索，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件并剔除無效成分后，共獲取FZJDD有效成分47個(gè)，成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)197個(gè)，F(xiàn)ZJDD的“有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1，根據(jù)度值（Degree）及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道篩選活性成分，其中槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、芒柄花黃素（formononetin）、山柰酚（kaempferol）、木樨草素（luteolin）、常春藤皂苷（hederagenin）、漢黃芩素（wogonin）、黃芪異黃烷苷（7-O-methylisomucronulatol）、黃芩素（baicalein）等藥物有效成分與多個(gè)作用靶點(diǎn)存在密切聯(lián)系，這些成分可能是FZJDD防治黑色素瘤的關(guān)鍵化合物。詳見表2。

2.2" 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取

在GeneCards、OMIM及TTD數(shù)據(jù)庫中篩選有關(guān)黑色素瘤的疾病靶點(diǎn)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)基因進(jìn)行合并，去重后共獲得8 250個(gè)與黑色素瘤相關(guān)的靶點(diǎn)，將得到的基因經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫校正。通過韋恩圖將FZJDD197個(gè)作用靶點(diǎn)與黑色素瘤的8 250個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，共獲得168個(gè)FZJDD-黑色素瘤共同靶點(diǎn)。詳見圖2。

2.3" PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析。FZJDD治療黑色素瘤的PPI預(yù)測見圖3。將網(wǎng)絡(luò)文件保存為TSV格式，將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯詃egree值反映靶點(diǎn)大小及顏色，以combined score值反映邊的粗細(xì)，從而構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖4和圖5所示，其中顏色越深，面積越大表示度值越大，該網(wǎng)絡(luò)共包括245個(gè)結(jié)點(diǎn)和1 566 條邊，其中AKT1、JUN、TP53、TNF、IL-6為核心靶點(diǎn)。

2.4" GO和KEGG通路富集分析

在GO富集分析中，富集到374條生物過程（biological process，BP）、39條細(xì)胞組成（cell composition，CC）、85條分子功能（molecular function，MF）條目。以Plt;0.05為篩選條件，取前10個(gè)GO條目繪制氣泡圖，見圖6。根據(jù)DAVID篩得到 KEGG通路181條，根據(jù)Plt;0.05篩選出FZJDD治療黑色素瘤的通路155條，根據(jù)P值排序繪制排名前20位的KEGG氣泡圖，見圖7。可預(yù)測FZJDD對黑色素瘤的治療作用主要涉及癌癥通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、VEGF信號通路等。

2.5" “藥物-成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)GO富集分析及KEGG通路富集分析的結(jié)果，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，借Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)。AKT信號通路的靶點(diǎn)交集數(shù)為96。詳見圖8。

2.6" FZJDD對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

與空白血清組比較，F(xiàn)ZJDD與陽性藥物細(xì)胞抑制率顯著升高（Plt;0.05）;FZJDD與陽性藥物細(xì)胞抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與FZJDD組、陽性藥物組比較，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞抑制率顯著升高（Plt;0.05）。詳見圖9。

2.7" qPCR檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

與空白血清組比較，F(xiàn)ZJDD組與陽性藥物組的PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05）;FZJDD組與陽性藥物組的PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與FZJDD組、陽性藥物組比較，聯(lián)合用藥組的PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05）。詳見圖10。

2.8" Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白水平的表達(dá)

與空白血清組比較，F(xiàn)ZJDD組與陽性藥物組的PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05）;FZJDD組與陽性藥物組的PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與FZJDD組、陽性藥物組比較，聯(lián)合用藥組的PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05）。詳見圖11。

3 討論

PI3K/AKT信號通路在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[21-22]。PI3K/AKT信號通路的異常激活通常與多種致癌因素有關(guān)，在黑色素瘤中PI3K/AKT通路的激活可以通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，如PI3K的基因突變、AKT的過表達(dá)或PTEN的失活等[23]，最終導(dǎo)致腫瘤的形成和進(jìn)展。PI3K/AKT信號通路的抑制劑在黑色素瘤的治療中顯示出一定的潛力[24-25]。此通路的激活能夠通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性并降低細(xì)胞之間的黏附性來促進(jìn)腫瘤的侵入與轉(zhuǎn)移[26]。研究表明，PI3K/AKT信號通路能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移及藥物耐藥等多個(gè)生物學(xué)過程，該信號通路在多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過程中處于持續(xù)的異常激活狀態(tài)[27]。黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤患者活組織檢查結(jié)果提示約有70%的惡性黑色素瘤患者體內(nèi)存在PI3K/AKT信號通路異常活動(dòng)，靶向AKT及其下游基因也被證明可以抑制小鼠黑色素瘤的發(fā)展[28]。其中PI3K其表達(dá)對惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后存在重要影響，其可維持腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖;AKT是PI3K下游離子靶向電位調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子之一，與惡性腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲密切相關(guān)，在藥物耐藥方面存在關(guān)鍵作用，可維持腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為;mTOR是PI3K/AKT的下游激酶，可通過AKT的磷酸化和激活在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[29]。激活PI3K/AKT信號通路后，AKT的磷酸化激活NF-κB抑制劑IκB激酶，NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活或抑制下游細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶蛋白，通過一系列的生物信號傳遞和級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[30]。研究顯示多數(shù)的黑色素瘤病例體內(nèi)PI3K/AKT信號通路表現(xiàn)為高度激活[31]。陳明等[32]研究證實(shí)，半枝蓮的提取物半枝蓮總黃酮能夠抑制荷瘤小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，并通過明顯抑制PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達(dá)起到抗腫瘤的作用，而p-AKT與AKT的表達(dá)量變化趨勢一致。

本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，F(xiàn)ZJDD中含槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等47個(gè)有效成分，交集靶點(diǎn)168個(gè)，結(jié)果表明FZJDD具有多類活性物質(zhì)、多靶點(diǎn)、多通路及整體調(diào)控功能，富集信號通路主要包括癌癥通路、PI3K/AKT等信號通路，其中PI3K/AKT信號通路為FZJDD治療黑色素瘤的主要信號通路之一。此外核心藥物靶基因分析顯示，AKT、TNF、TP53、IL-6、JUN等靶蛋白為FZJDD治療黑色素瘤的核心靶點(diǎn)，均受PI3K/AKT信號通路所調(diào)控，其中TNF在眾多惡性腫瘤中表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺滅腫瘤或抑制腫瘤作用，同時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠促進(jìn)人體免疫細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞，此外，TNF還表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎癥作用[33]。TP53基因是人體內(nèi)的關(guān)鍵抑癌基因，TP53基因突變在黑色素瘤患者中尤為常見，TP53可通過轉(zhuǎn)錄合成細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白，在細(xì)胞增殖、凋亡、周期等方面起到極為重要的調(diào)控作用[34]。IL-6在激活與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及參與炎性反應(yīng)中扮演著極為重要的角色，其能使炎癥損傷程度加劇，同時(shí)對機(jī)體免疫功能造成影響，從而促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展[35]。JUN基因的作用主要在調(diào)控細(xì)胞惡變方面，其對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸均存在重要作用[36]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測PI3K/AKT信號的激活在黑色素瘤中起著重要作用，與黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后密切相關(guān)，PI3K/AKT信號通路可能成為黑色素瘤治療的重要靶標(biāo)通路。為了更好地驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，本研究采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。體外細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ZJDD能夠有效抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化修飾表達(dá)，從而抑制PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT、mTOR的蛋白及mRNA表達(dá)水平，說明FZJDD治療黑色素瘤的可能機(jī)制與下調(diào)PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對FZJDD治療黑色素瘤進(jìn)行初步研究，相對科學(xué)可靠地預(yù)測FZJDD治療黑色素瘤的分子作用機(jī)制并加以驗(yàn)證，豐富了FZJDD治療黑色素瘤的機(jī)制研究，為中醫(yī)藥治療黑色素瘤提供了新思路，但中藥成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多，其藥效機(jī)制仍需要更進(jìn)一步的研究探討。

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〔收稿日期〕2024-08-31

〔基金項(xiàng)目〕湖南省研究生科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（CX20210680）;湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（21A0224）;湖南省教育廳科學(xué)研究優(yōu)秀青年項(xiàng)目（23B0377）;湖南省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研課題（C2024012）;2024年湖南省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202410541030）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校院聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2023XYLH002）。

〔通信作者〕*陳其華，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：1105165868@qq.com。