基于DNA條形碼的天津渤海灣魚類資源鑒定及遺傳分析

摘 要：為探索DNA條形碼對渤海灣部分魚類物種鑒定的有效性并進行相關的遺傳分析，對天津渤海灣10種海水魚類共177條線粒體COI基因序列進行擴增測序和比對分析。結果表明，10種海水魚類COI基因T、C、A和G堿基平均含量分別為30.0%、27.9%、24.1%、18.0%，具有堿基偏倚性，177個基因序列共檢測到70個單倍型。遺傳多樣性分析顯示，總體的單倍型多樣性為0.432 7～0.947 4，核苷酸多樣性為0.000 8～0.006 3，其中焦氏舌鰨（Cynoglossus joyneri）的變異位點、單倍型數和單倍型多樣性最高。遺傳距離結果顯示，種間遺傳距離為0.237 5～0.357 5，其中種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的77倍。系統進化樹具有明顯的分化譜系，與形態學的鑒定結果相吻合。研究結果表明，DNA條形碼技術可以對天津近岸海域常見的10種魚類進行有效鑒定，相關遺傳分析可為天津渤海灣魚類資源保護提供數據支持。

關鍵詞：DNA條形碼；COI基因；遺傳多樣性；魚類

中圖分類號：S917.4 """"文獻標志碼：A

文章編號：1004-6755（2025）01-0025-07

我國海洋生物資源豐富，海洋生物多樣性是檢測生態系統健康的一個重要指標。魚類作為其中的重要組成部分，在海洋生態系統中占據了關鍵地位。在傳統的魚類物種鑒定中，多以形態學為基礎進行分類鑒定，不僅難以準確辨別形態相似性很高的物種，同時還必須在樣本完整的前提下完成。而DNA條形碼技術可以利用生物體DNA中的一個或多個標準化短遺傳標記來識別其屬于特定物種[1-2]。DNA條形碼在2003年被引入作為動物生物物種識別的方法，Hebert等[3]建議將線粒體細胞色素c氧化酶亞基1（COI）基因的650 bp左右片段作為動物物種全球生物學鑒定的通用標記或“DNA條形碼”。目前該技術已成為一種高效的分子分類工具，越來越多的研究表明其可快速、準確地鑒定魚類物種并進行遺傳多樣性分析[4-5]。

天津海域位于半封閉的渤海灣頂部，所轄海域面積約2 146 km2，海岸線北起天津河北行政區域北界線與海岸線交點（澗河口以西約2.4 km處），南至歧口，全長153.2 km。其自然條件優越，基礎餌料豐富，曾是渤海灣多種經濟洄游魚、蝦類產卵場，潮間帶更是蘊藏著豐富的貝類生物資源，歷史上有“天然漁場”之稱。

據近幾年的漁業資源調查結果顯示，天津渤海灣漁業資源無論是種類還是數量上，都明顯少于歷史調查數據[6]。全面了解天津近岸海域經濟海洋水產生物資源和生態環境狀況是開展水生生物資源養護，合理開發和利用海洋漁業資源的前提。本研究在形態學鑒定基礎上對天津渤海灣10種魚類177條線粒體COI基因序列進行分析，探討COI基因序列作為DNA條形碼在天津渤海灣魚類分類中的應用，建立條形碼數據庫，了解和掌握天津渤海灣魚類分布規律，為制定合理的漁業資源保護措施提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據海岸線的走向及其包括的海域，共設8個站點，均勻分布于整個渤海灣（見圖1）。租用247 kW漁業生產船只，使用單拖網（網口寬12 m，囊網網目20 mm），在設定的站位拖網0.5 h，拖速2～3 kn，對游泳動物進行采樣。每個種類樣本數量見表1，剪取鰭條組織放入裝有無水乙醇的離心管中，對樣本進行編號，放入低溫冰箱-80 ℃保存備用。

1.2 樣品分類

根據《天津水域魚類資源種類名錄及原色圖譜》[7]進行形態學的初步鑒定，177個樣品個體歸屬于4目，8科，10屬，10種（表1）。

1.3 DNA提取、PCR擴增及序列測定

本實驗采用醋酸銨沉淀法提取基因組DNA[8]，NanoDrop ND-1000紫外分光光度計檢測DNA濃度和質量，-20 ℃保存備用。擴增引物為魚類DNA條形碼擴增的通用引物[9]，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為Fish11F：TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC；Fish11R：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR擴增反應總體系為50 μL，含5 μL 10×Buffer，5 μL dNTP（10 mmol/L）、正反向引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板2.5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL ，ddH2O 35 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物后，送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

將測序結果用BioEdit 7.0.5軟件進行編輯校正。用MEGA v11軟件[10]進行同源比對，確定序列長度，并統計DNA序列的堿基組成。統計得到序列堿基分布及變異情況，計算種內及種間遺傳距離，構建分子系統樹，經過1 000次重復抽樣檢測的Bootstrap值表示樹上各分支的置信度。用DNAsp v6軟件[11]計算單倍型數、單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數。

2 結果與分析

2.1 COI基因序列分析與單倍型分布

測序結果經過校正和比對分析，獲得10種魚類177個個體的COI基因序列，長度為631 bp。MEGA 7.0軟件分析結果顯示，序列的T、C、A和G堿基平均含量分別為30.0%、27.9%、24.1%、18.0%，A+T含量（54.1%）略高于G+C含量（45.9%）。其中G+C在密碼子第1位點的含量最高（55.4%），除C以外，其余3個堿基在密碼子第1、2、3位點分布都不平均（表2）。COI基因密碼子的變異統計結果顯示，共有不變位點509個，轉換位點（69個）多于顛換位點（52個），轉換與顛換比為5.36（表3），說明在序列中轉換多于顛換。10種魚類177個個體，共檢測到70個單倍型，單倍型Genebank序列號見表4。

2.2 遺傳多樣性分析

10種魚類的遺傳多樣性分析結果顯示，所比對序列中共檢測出保守位點370個、多態性位點261個，其中簡約信息位點260個、單突變位點1個?？傮w的單倍型多樣性為0.972 1，核苷酸多樣性為0.193 1。其中焦氏舌鰨的變異位點、單倍型數和單倍型多樣性均最高，斑尾刺蝦虎魚的最低（表5）。

2.3 種內距離與種間距離

對于本次實驗所收集的177條COI序列，利用MEGA v11軟件，基于K2P雙參數模型，計算出177條魚的種間遺傳距離和種內遺傳距離（見表6）。結果顯示，10種魚類的種內平均遺傳距離為0.003 8，并且10種魚類的種內遺傳距離均小于DNA條形碼規定的最小種內遺傳距離0.020 0。其中焦氏舌鰨的種內遺傳距離最大，為0.006 8；斑尾刺蝦虎魚的種內遺傳距離最小，為0.002 1。

10種魚類的種間平均遺傳距離0.293 6，是種內平均遺傳距離的77倍。其中銀鯧和斑鰶的種間遺傳距離最大，為0.357 5；銀鯧和藍點馬鮫的種間遺傳距離最小，為0.237 5。

2.4 系統進化樹

通過鄰接法NJ（Neighbor-Joining）構建了10種魚類70個單倍型的系統進化樹（圖2），結果顯示同種魚類的不同單倍型均聚為一支，具有明顯的分化譜系，與形態學的鑒定結果相吻合。

3 討論

天津渤海灣位于渤海西部，是眾多魚、蝦、蟹、貝等海洋生物的產卵場、索餌場和育肥場，素有“天然魚池”之稱，在我國漁業水域中占有非常重要的地位。近年來，由于海洋污染和過度捕撈等因素的影響，渤海灣的漁業資源量曾經歷顯著下降。有研究表明2019年和2020年的游泳動物平均密度和生物量均低于2015年和2016年，種群特征顯示生物多樣性水平并不高[6]。近幾年通過開展人工增殖放流、投放人工魚礁、設立禁漁期等多項措施，監測評估漁業資源正在逐步恢復。在大多數硬骨魚中，COI基因序列的AT含量均高于GC含量，具有一定的AT偏倚性[12]。本研究結果A+T含量（54.1%）略高于G+C含量（45.9%），與已有研究結果一致。其中密碼子的第一位點堿基GC分布頻率最高，為55.4%，這與劉凱瑩[13]研究結果相似。在分子進化研究中，轉換顛換比值可以體現DNA序列的進化方向和物種間的關系，同時也可反映進化頻率[14]。本研究中堿基變異的轉換與顛換比為5.36，轉換多于顛換，說明序列可能在進化過程中經歷了較少的突變。

遺傳多樣性是評估種群資源狀況的一個重要依據，因此加強魚類遺傳多樣性的保護和研究具有重要意義[15]。遺傳多樣性指的是物種群體內所有遺傳信息的總和，魚類遺傳多樣性是魚類生存、適應和進化的基礎，對于維護水生生態系統的平衡和穩定具有重要意義。一般遺傳多樣性較高的物種，具有更強的適應生存能力和進化潛力。遺傳多樣性主要包括線粒體DNA的單倍型多樣性和核苷酸多樣性指標[16]。Grant等[17]研究結果表明，單倍型多樣性的臨界值為0.5，核苷酸多樣性的臨界值為0.005。兩者的值越高，遺傳多樣性程度就越高。本研究中的10種魚類總體的單倍型多樣性達到0.972 1，除斑尾刺蝦虎魚和黃鯽的單倍型多樣性較低（0.432 7和0.5000 ）外，其他9種魚類的單倍型多樣性都在0.5以上，其中斑鰶（0.781 8）、焦氏舌鰨（0.947 4）、髭縞蝦虎魚（0.867 6）和梭魚（0.875 0）的單倍型多樣性相對更高。從渤海灣漁業資源近年來的調查中可以看出，斑鰶、焦氏舌鰨和髭縞蝦虎魚為優勢種[6]，具有較強的適應環境能力和進化潛力，而梭魚的高多樣性可能與天津市開展的增殖放流工作有關。核苷酸多樣性結果顯示總體的核苷酸多樣性為0.193 1，焦氏舌鰨最高（0.006 3），其余9種魚類的核苷酸多樣性均較低，在0.000 8～0.002 8之間。在10種海水魚中，焦氏舌鰨的單倍型多樣性大于0.5，核苷酸多樣性大于0.005，屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性類型，說明該種群中存在多種遺傳變異，具有較高的遺傳多樣性。這些變異可能是由一個大而穩定的種群經過長時間歷史演化所導致，也可能是被兩個不同系群的種群二次接觸影響產生的結果[18]。其余9種魚類均屬于高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性類型，說明這些種群曾經歷過瓶頸效應后，發生了種群的快速擴張與變異的不斷積累[19]。

通過對天津渤海灣10種魚類的COI基因進行分析，我們發現不同物種之間COI基因序列組成有很大的差異性，說明該基因在不同物種之間有一定的代表性。利用DNA條形碼技術進行物種分類和鑒定的關鍵在于兩點，一個是不同物種在系統發育樹上可以檢測到物種的單系性，本研究中的系統進化樹分析結果表明同種魚類的不同單倍型均聚為一大支；另一個是物種之間的遺傳距離應明顯大于物種內的遺傳距離，而且種間的遺傳距離約為種內的遺傳距離的10倍以上。Hebert等[3]分析研究了一萬多個物種，結果發現絕大多數物種的種內距離低于0.01。本研究的10種海水魚類，種內的遺傳距離在0.002 1～0.006 8，均小于0.01；而種間的平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的77倍，結果證明COI基因可以對天津近岸海域常見的10種海魚類進行有效鑒定。

本研究利用DNA條形碼技術中COI基因對天津渤海灣的10種海水魚類進行了物種分子鑒定可行性和有效性的測定，結果顯示鑒定結果快速有效。同時我們也初步掌握了渤海灣部分魚類的遺傳數據信息，為后續的魚類遺傳多樣性的保護和研究奠定基礎，為天津渤海灣魚類資源保護提供數據支持。

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Identification and genetic analysis of fish resources in Tianjin Bohai Bay based on DNA barcodes

HE Xiaoxu， BAI Xiaohui， WANG Xiaoyu， MENG Yigeng

（Tianjin Fisheries Research Institute， Tianjin 300221，China）

Abstract：In order to explore the effectiveness of DNA barcode on the identification of some fish species in the Bohai Bay and conduct relevant genetic analysis， an amplified sequencing and comparison analysis were carried out on a total of 177 mitochondrial COI gene sequences of 10 species of marine fish in Bohai Bay， Tianjin.The results showed that the average content of bases T， C， A， and G of COI gene of 10 kinds of marine fish was 30.0%， 27.9%， 24.1%， and 18.0% respectively， with base bias， and a total of 70 haplotypes were detected in 177 gene sequences. Genetic diversity analysis showed that the overall haploid diversity was 0.432 7～0.947 4， and the nucleotide diversity was 0.000 8～0.006 3， among which Cynoglossus joyneri had the highest mutation sites， haplotypes， and haploid diversity. The results of genetic distance showed that the genetic distance between species was 0.237 5～0.357 5， of which the average genetic distance between species was 77 times that of the average genetic distance within the species. The systematic evolutionary tree also had an obvious differentiation spectrum， which coincides with the morphological identification results. The results of this study showed that DNA barcode technology can effectively identify 10 species of fish commonly found in the coastal waters of Tianjin， and relevant genetic analysis can provide data support for the protection of fish resources in Tianjin Bohai Bay.

Key words：DNA barcode; COI gene; genetic diversity; fish

（收稿日期：2024-09-24）