基于高效液相色譜法檢測鯽肌肉中5種氟喹諾酮類藥物

摘要：為檢測鯽肌肉中5種氟喹諾酮類（FQs）藥物（諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹）的殘留量，建立了一種高效液相色譜檢測方法。本方法使用T3色譜柱，流動相為01%的甲酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脫法，利用熒光檢測器檢測。結果表明5種氟喹諾酮類藥物在001～200 μg/mL藥物濃度條件下有良好線性關系（r2gt;0999）；5種藥物的檢出限為006～013 μg/kg；定量限為018～038 μg/kg；藥物回收率為9227%～11476%，相對標準偏差（RSD）為141%～850%。結果表明方法準確、靈敏、穩定，滿足氟喹諾酮類藥物的檢測要求，可為水產品中FQs的檢測和研究提供技術參考。

關鍵詞：鯽；氟喹諾酮；高效液相色譜

中圖分類號：TS2547文獻標識碼：A

作為人工合成的新型抗菌藥物，氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，FQs）藥物具有抗菌作用強、抗菌譜廣、高效、低毒、半衰期較長、用藥次數少等特點，目前被廣泛應用于水產養殖業［1-3］。中國是漁業大國，水產養殖水域廣闊，水產品種類豐富，水產品產量持續上升［4］。然而，隨著FQs在水生生物養殖中的廣泛應用，水產品體內藥物殘留情況也愈發嚴重，這對人類生命健康構成了一定的風險［5］。因此，對水產品開展FQs藥物殘留檢測，對嚴控水產品質量和保障人民食品安全具有重要意義。目前水產品藥物殘留檢測方法主要有色譜法、免疫分析法、毛細管電泳法、電化學傳感器法和光譜法等［6-7］，這些方法各有特點，適用于不同要求和目的的檢測項目。色譜法中的高效液相色譜法（HPLC）因其具有強大的分離能力和極高的靈敏度，是一種藥物檢測的經典方法。

我國于2021年發布了關于液相色譜法測定水產品中氟喹諾酮類藥物殘留量的標準（GB 316563—2021）［8］，本研究以《GB 316563—2021》為基礎，通過改變色譜柱類型、流動相等進行試驗，用熒光檢測器的高效液相色譜儀梯度洗脫檢測，測定水產品中FQs殘留，旨在拓展和優化當前已有的檢測方法，提高檢測精度和效率，為后續水產品中FQs類藥物的研究和檢測奠定基礎。

1 材料與方法

11 材料與儀器

供試樣本：鯽，來自江西省水產科學研究所。

藥品：諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹5種藥物標準品均為Stanford Analytical Chemical Inc生產。其中諾氟沙星、環丙沙星和氟甲喹純度均為99%，恩諾沙星和噁喹酸純度均為98%。

試劑：甲醇（Honeywell，GR）、乙腈（Honeywell，GR）、正己烷（Honeywell，GR）、甲酸（Honeywell，GR）、洗脫液（氨水＋甲醇，體積比為1∶3）；酸化乙腈溶液：取乙腈250 mL，加鹽酸溶液2 mL，充分混勻；乙腈飽和正己烷溶液：取正己烷200 mL于250 mL分液漏斗中，加適量乙腈后劇烈振蕩，待分配平衡后，棄乙腈層即得。

儀器：液相色譜儀（Agilent 8890）、分析天平（EX125DZH）、氮吹儀（HSC-24B）、高速離心機（TG10K）、固定式混勻儀（MX-F）和旋蒸儀（RE100-S）。

12 方法

121 標準曲線

標準儲備液（100 μg/mL）：稱取環丙沙星和恩諾沙星各001 g（精確至00001 g，下同），分別用色譜純級甲醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液；取諾氟沙星001 g，用01 mol/L鹽酸溶液10 mL使其溶解，用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液；取噁喹酸和氟甲喹各001 g，用01 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，分別用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液。以上儲備液均4℃冷藏保存，有效期3個月。

標準工作液（10 μg/mL）：量取5種標準儲備液各1 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用01%的甲酸溶液稀釋至刻度，配制成10 μg/mL 5種藥物的標準工作液。

標準曲線制備：分別準確吸取一定量的諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹標準工作液于6個容量瓶中，用01%的甲酸溶液稀釋成濃度為001、005、010、050、100、200 μg/mL的標準溶液，每個容量瓶中5種藥物的濃度保持一致。以藥物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

122 檢出限和定量限

檢出限：根據儀器的信噪比（I/N）來計算方法的檢出限，計算公式為：

123 樣品前處理

取鯽背部肌肉5 g（準確至±002 g），加酸化乙腈溶液20 mL、無水硫酸鈉10 g，高速均質2 min，3000 r/min離心5 min，取上清液至分液漏斗，用酸化乙腈溶液20 mL重復提取2次后合并上清液。加乙腈飽和正己烷溶液60 mL，振蕩20 min后靜置，取下層乙腈至梨形瓶，40℃旋轉蒸發至干。加磷酸鹽緩沖液4 mL，超聲振蕩1 min，靜置30 s，溶液轉移至15 mL離心管。再重復提取殘余物2次，溶液轉移至同一離心管，合并3次殘余物溶解液，3000 r/min離心5 min，取上清液。取上清液過活化后的C18固相萃取柱，用3 mL水淋洗，抽干后加洗脫液5 mL，使用氮吹儀在50℃下吹干，加1 mL 01%的甲酸溶液溶解，過022 μm微孔濾膜后備用。

124 回收率和精密度

取5 g（準確至±002 g）鯽肌肉樣品4份，其中1份為空白檢測樣，3份為測試樣。向每份測試樣中加入諾氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹標準工作液，使諾氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹在每份測試樣中的濃度分別為6、12、100 μg/kg；向測試樣中加入環丙沙星標準工作液，使環丙沙星在每份測試樣中的濃度分別為5、10、100 μg/kg。按照“123”前處理方法處理空白檢測樣和測試樣后上機檢測。

每份樣品平行測定6次，計算樣品回收率，其計算公式為：

2 結果與分析

21 色譜分離

諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹在本色譜條件下的出峰時間分別為：9695、10534、13064、23186和24091 min，具體見圖1，結果表明，5種氟喹諾酮類藥物可以獲得良好的分離和峰型，并且樣品中其余雜峰對主峰基本無干擾。

22 標準曲線

以藥物濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），得出5種氟喹諾酮類藥物的標準曲線，諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹的回歸方程和線性相關系數見表3，5種藥物濃度和峰面積在001～200 μg/mL呈現出線性關系（r2gt;0999）。不同藥物濃度下色譜圖如圖2所示。

23 檢出限和定量限

當進樣量為10 μL，濃度為001 μg/mL時，諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹的信噪比（S/N）分別為726、476、988、609和931。檢出限和定量限結果如表4所示，諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹檢出限分別為008、013、006、010和006 μg/kg，定量限分別為025、038、018、030和019 μg/kg。

24 回收率和精密度

環丙沙星在5、10、100 μg/kg添加水平下的加標回收率分別為9650%～11476%；諾氟沙星在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標回收率分別為9324%～11366%；恩諾沙星在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標回收率分別為9227%～10705%；噁喹酸在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標回收率分別為10672%～11464%；氟甲喹在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標回收率分別為9519%～10715%，具體見表5。諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹的相對標準偏差RSD分別為141%、486%、850%、141%和421%，具體見表6。結果表明回收率穩定，精密度可滿足檢測需要。

25 樣品測定結果

本實驗的水產品樣品測定結果見表7，鯽背部肌肉中未檢測出諾氟沙星、環丙沙星、噁喹酸和氟甲喹，恩諾沙星檢測結果為35540 μg/kg。

3 討論

不同的流動相對藥物分離效果有著直接影響，本研究采用01%的甲酸水溶液和乙腈作為流動相，5種氟喹諾酮類藥物分離效果較好。馮濤等［9］以pH=30的甲酸水溶液（002%）和乙腈作為流動相，環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星等4種氟喹諾酮類藥物有著較好的分離度。蘭承興等［10］采用四丁基溴化銨和乙腈作為流動相，結果表明4種氟喹諾酮類藥物的方法回收率和分離效果較好。這說明檢測過程中pH值、流動相種類及其比例不是固定不變的，適當的調整和多次試驗才能優化藥物分離效果，后續研究可以考慮通過調整以上色譜條件，摸索出可分離更多種FQs藥物、用時更短的色譜方法。

本研究利用T3色譜柱進行檢測，與C18色譜柱相比，T3色譜柱具有更寬的pH值適用范圍，具備應對復雜、多組分樣品分離的能力，而本研究中流動相為01%甲酸溶液，選擇T3色譜柱也能較大程度降低對色譜柱的損害。T3色譜柱已經被應用于多種化學藥物殘留檢測領域，比如測定畜禽肉及內臟中的新生霉素、莫匹羅素、豐加霉素和茴香霉素［11］，化妝品中葡糖酸、葡糖酸內酯和乳糖酸［12］，保健品中的脂溶性維生素［13］等藥物。

本研究選用T3色譜柱，以甲酸和乙腈為流動相對鯽背部肌肉中的5種FQs藥物進行測定，分離效果好，檢測靈敏度高，基線平穩，且流動相配制簡單，適用于實際工作中水產品中FQs物質的檢測。

參考文獻

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