副溶血弧菌口服疫苗免疫大菱鲆后IgM基因的變化

摘要：用不同方法制備或不同方式免疫的3種副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）疫苗免疫大菱鲆，實驗分為4組，注射免疫組、口服疫苗免疫組、口服緩釋疫苗免疫組和陰性對照組，于免疫后1周、2周、3周和4周分別取大菱鲆脾、頭腎和后腸3種組織，提取mRNA，應用實時熒光定量PCR檢測3種組織中免疫球蛋白M（IgM）基因的變化。結果顯示：IgM基因在3種組織中表達量均上調，高峰值出現在第4周，表達量是對照組的3～12倍。研究結果為口服疫苗的免疫效果評價提供了基礎數據。

關鍵詞：副溶血弧菌；疫苗；大菱鲆；IgM基因

中圖分類號：S9425文獻標識碼：A

疫苗在水產養殖業中已被廣泛應用，為控制魚類病害的發生發揮重要作用［1］。漁用疫苗共有三種免疫接種方式：注射免疫、浸泡免疫和口服免疫。注射免疫因能有效激活魚體系統免疫反應，起到較好的免疫效果而被普遍使用，是目前最常用的免疫接種方法，然而注射免疫也具有勞動強度大，容易造成魚體應激，對于規格較小的幼魚，操作較為困難等缺點。浸泡免疫因使用量過大而成本高。相比之下，口服免疫具備安全易行、操作方便、使用量小、不受魚類個體大小限制等優勢，具有很好的應用前景［2］。為研究魚類疫苗的免疫效果，對免疫后一些特異性指標及非特異性指標進行檢測，如血清和黏液抗體水平的變化［3-5］、淋巴細胞數量［6］、免疫相關酶活性［7-8］、補體活性［9-10］和呼吸爆發［8］等。近年來，從基因表達水平對疫苗免疫效果進行評價的報道越來越多，常見的基因有免疫球蛋白M（IgM）［11-12］、主要組織相容性復合體Ⅰ（MHC Ⅰ）［13］、MHC Ⅱ［14-15］、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）［16］和自然殺傷細胞增強因子（NKEF）［17-18］等。

1 材料與方法

11 實驗動物

大菱鲆購自天津某水產養殖有限公司，體長10～15 cm，體重50～80 g。大菱鲆在水溫22℃下馴養3周，連續充氣，每日投喂2次配合飼料，合計為魚體重的1%。

12 副溶血弧菌全菌滅活疫苗的制備

將保存的副溶血弧菌菌種接種于營養瓊脂培養基上進行復活，經過37℃培養24 h后，按1∶100接種量接種于營養瓊脂液體培養基中培養24 h，6000 r/min離心5 min去掉培養基，用滅菌PBS洗滌3次，加入終濃度為05%的甲醛37℃滅活24 h，其間可輕輕震蕩2～3次，平板檢測無活菌存在；滅活結束后，6000 r/min離心5 min去除甲醛，用滅菌PBS離心洗滌菌體3次，用滅菌PBS調整菌液濃度至10×1012 cfu/mL，4℃保存備用，為副溶血弧菌口服緩釋疫苗制備提供原料。

13 副溶血弧菌口服緩釋疫苗制備

采用大菱鲆商品化飼料為載體，首先將滅活疫苗均勻噴于飼料表面，制備成疫苗飼料，疫苗有效濃度約為6×109 cfu/g飼料，再進行緩釋層的包衣，包衣材料由乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素（HPMC）等材料制備而成。

14 大菱鲆的免疫

暫養后的大菱鲆分為4組，每組40尾。實驗共分4組，其中實驗1組（test1）為注射免疫組，實驗2組（test2）為口服疫苗免疫組，實驗3組（test3）為緩釋口服疫苗免疫組，實驗4組（control）為陰性對照組，均不設平行組。口服疫苗免疫組每天投喂制備的未包被的口服疫苗2次，緩釋口服疫苗免疫組每天投喂制備的包被的口服疫苗2次，連續投喂7 d，然后投喂正常餌料；陰性對照組每天投喂2次正常顆粒餌料。注射免疫組每尾大菱鲆腹腔注射濃度為1×108 cfu/mL的滅活疫苗01 mL，在口服免疫的第7 d進行注射免疫。每日餌料投喂量為魚體重的1%。

15 大菱鲆的免疫及取樣

免疫后于1周、2周、3周和4周在各組隨機取3尾大菱鲆，分別取脾、頭腎、后腸3種組織，保存于RNA保存液中，4℃過夜，-80℃保存備用，提取組織RNA，用于檢測IgM基因表達的變化。

16 RNA的提取及cDNA的合成

從-80℃冰箱中取各組織樣品約20 mg，應用離心柱海洋動物RNA提取試劑盒（北京天根生化試劑公司）提取RNA，以微量核酸測定儀（NanoDrop One，Thermo）測定RNA的濃度和純度，提取合格的RNA經過反轉錄試劑盒（Takara）合成cDNA，-20℃保存備用。

17 熒光定量PCR所用引物的設計與選擇

根據已知的大菱鲆肌動蛋白（β-actin）、IgM基因的基因序列，采用Primer Premier 50軟件設計各基因特異性引物，隨機選取對照組的脾、頭腎、后腸的cDNA樣品，利用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（Takara），在熒光定量PCR儀（StepOne Plus）上進行擴增，選擇單一溶解曲線的引物進后續實驗。

18 熒光定量PCR檢測

以β-actin為內參，利用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在熒光定量PCR儀（ABI StepOne Plus）上進行擴增，擴增體系為20 μL，即：cDNA模板2 μL，正反向引物各04 μL（引物濃度為10 μmol/L），ROX Reference Dye 04 μL，混合液10 μL，無菌水68 μL，每個樣品設置3個重復實驗，擴增的條件為：95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個循環，獲取Ct值用于后續數據處理及分析。

19 數據處理及分析

熒光定量PCR所得數據按照2-ΔΔCt法進行處理，所有數值均用平均值±標準差（x—±SD）表示。利用Origin Pro 2016軟件作圖，SPSS 130軟件進行數據統計分析，采用t檢驗分析不同時間點基因表達量的差異，以Plt;005作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

21 熒光定量PCR所用引物的獲得

內參基因β-actin、IgM基因引物序列、退火溫度等信息見表1。應用特異性引物進行熒光定量PCR，所有檢測樣品的擴增結果均為單一產物。

22 IgM基因在脾臟、頭腎和后腸中的表達

脾臟中，實驗1組IgM的表達量呈一直上升趨勢，第1周和第2周表達量為對照組的2倍左右，到第4周顯著上調，表達量達到對照組的1209倍（P＜005）；實驗2組前兩周IgM的表達量與對照組無差異，第3周開始上調，為對照組的204倍，第4周繼續上調為對照組的455倍；實驗3組趨勢與實驗2組相近，只是表達量有所提高，第4周時為對照組的787倍（圖1）。頭腎中，各實驗組IgM的表達趨勢一致，前2周均與對照組無差異，實驗1組IgM的表達量從第3周開始上調為對照組的741倍，第4周為2376倍；實驗2組IgM的表達量從第3周開始上調為對照組的356，第4周為584倍；實驗3組第3周IgM的表達量為對照組的40倍，第4周為132倍（圖2）。后腸中，實驗1組IgM的表達量呈現先升后降的趨勢，第2周開始升高，第3周最高，為對照組的337倍，第4周降低到283倍；實驗2組同樣為先升后降，最高值達到336倍；實驗3組到第4周才達到最高值，為對照組的585倍（圖3）。

3 討論

免疫球蛋白IgM是體內免疫反應最早出現的一種免疫蛋白，主要功能是抗菌、抗病毒和中和毒素等，它是一種高效能的抗體，其殺菌、溶菌、溶血、調理及凝集作用較IgG高。注射疫苗可使頭腎、脾等免疫器官引起較強的免疫應答，產生大量的抗體，口服疫苗刺激黏膜免疫器官后，迅速產生相應的免疫球蛋白，只是抗體水平較低。研究報道溶藻弧菌疫苗免疫斜帶石斑魚后，頭腎、脾、胸腺和血液中IgM基因表達量從2周后開始顯著上升，4～5周時達到最高峰［11］，本實驗中脾和頭腎中IgM基因表達量從第3周開始顯著上升，第4周達到最高值，后腸則從第2周開始顯著上升，第4周達到最高值，實驗結果與Cui等［11］研究結果一致。也有研究表明疫苗免疫后IgM基因表達較早，如鰻弧菌注射和浸泡免疫牙鲆后，脾、頭腎和鰓中的IgM表達量在第7天達到最高值，一直持續到14天［12］，嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫鱖魚后，皮膚和鰓中IgM基因表達量第4天達到峰值，脾和腎在第7天達到峰值［19］。IgM基因表達量峰值出現的時間不同，可能與疫苗濃度、魚種及魚體大小等有關［20］。

綜上所述，本實驗制備的副溶血弧菌口服緩釋疫苗效果較好，刺激后腸免疫相關基因表達量顯著高于其他實驗組；在脾和頭腎中，緩釋口服疫苗免疫組免疫相關基因表達量不如注射免疫組，但效果好于口服疫苗免疫組。通過增加口服免疫時間、利用免疫佐劑、加大免疫劑量等方式是否能更有效地引發大菱鲆的特異性免疫并增加免疫保護效果，從而達到與注射免疫相同的免疫效果還有待于進一步的研究。

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