miR-1247-5p/Smad2軸對胃癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化的影響

摘要：目的 探討miR-1247-5p在胃癌中的表達情況及其對胃癌細胞遷移、侵襲的影響機制。方法 分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫癌旁組織與胃癌組織中差異表達的miRNA；受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-1247-5p對惡性腫瘤預后的預測價值；實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測本院收集的10例胃癌和癌旁組織中miR-1247-5p的表達水平；蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）分析miR-1247-5p下游靶基因；雙螢光素酶實驗觀察miR-1247-5p與Smad2的結合情況；Transwell實驗檢測過表達miR-1247-5p對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響；RT-qPCR、Western blot實驗檢測miR-1247-5p對Smad2和上皮間質轉化（EMT）標記分子表達水平的影響。結果 TCGA數據庫及本院收集的胃癌組織中miR-1247-5p表達水平均低于癌旁正常組織；ROC曲線分析表明miR-1247-5p表達水平是絕大部分腫瘤類型患者預后的獨立預測指標。過表達miR-1247-5p顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。生物信息學分析提示miR-1247-5p下游靶基因參與EMT等與腫瘤轉移密切相關的通路。PPI分析表明Smad2是EMT信號通路中的Hub基因。雙螢光素酶實驗表明miR-1247-5p和Smad2存在結合位點。RT-qPCR、Western blot實驗證實miR-1247-5p可抑制Smad2表達和EMT過程。結論 miR-1247-5p在胃癌組織中低表達，過表達miR-1247-5p可抑制EMT信號通路，降低胃癌細胞遷移和侵襲能力。

關鍵詞：胃腫瘤；上皮-間質轉化；細胞運動；腫瘤浸潤；Smad2蛋白質；miR-1247-5p

中圖分類號：R735.2 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240634

Abstract： Objective To explore the expression of miR-1247-5p in gastric cancer and its effect on" migration and invasion of gastric cancer cells. Methods The differentially expressed miRNAs in adjacent non-cancerous tissue versus gastric cancer tissue of TCGA database were analyzed. The prognostic value of miR-1247-5p in malignant tumor was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curve. RT-qPCR assay was used to detect expression levels of miR-1247-5p of gastric cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue collected in 10 cases from our hospital. Protein-Protein Interaction （PPI） analysis was used to identify downstream target genes of miR-1247-5p. Dual-luciferase reporter assay was used to observe the binding of miR-1247 to Smad2. Transwell assay was used to investigate the effect of miR-1247-5p overexpression on migration and invasion abilities of gastric cancer cells. RT-qPCR and Western blot experiments were used to examine the impact of miR-1247-5p on expression levels of Smad2 and epithelial-mesenchymal transition （EMT） marker molecules. Results The expression levels of miR-1247-5p were lower in gastric cancer tissue collected from both TCGA database and our hospital than those in adjacent normal tissue. ROC curve analysis indicated that the expression level of miR-1247-5p was an independent prognostic indicator for most tumor types. Overexpression of miR-1247-5p significantly inhibited the migration and invasion abilities of gastric cancer cells. Bioinformatics analysis suggested that the downstream target genes of miR-1247-5p were involved in EMT and other pathways closely related to tumor metastasis. PPI analysis revealed that Smad2 was a Hub gene in the EMT signaling pathway. Dual-luciferase reporter assay demonstrated the existence of binding sites between miR-1247-5p and Smad2. RT-qPCR and Western blot experiments confirmed that miR-1247-5p can inhibit the expression of Smad2 and the process of EMT. Conclusion miR-1247-5p is lowly expressed in gastric cancer tissue， and overexpression of miR-1247-5p can inhibit EMT signaling pathway and reduce the invasive metastatic potential of gastric cancer cells.

Key words： stomach neoplasms; epithelial-mesenchymal transition; cell movement; neoplasm invasiveness; Smad2 protein; miR-1247-5p

胃癌是我國常見的消系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率均占全國惡性腫瘤的第3位，腫瘤進展是導致胃癌患者死亡的主要原因之一，但目前胃癌進展的具體機制仍不明確［1］。探明胃癌發生發展的機制對開發新的治療靶點，改善胃癌患者預后有重要意義。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是關鍵的轉錄后負調控因子，在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、分化和轉移灶定植等多種生物學進程中發揮重要作用［2］。既往研究表明，miR-1247-5p在多種惡性腫瘤組織中低表達，是大部分腫瘤預后的保護因素，例如在乳腺癌中，miR-1247-5p通過靶向散亂片段極性蛋白1/Wnt/β-連環蛋白信號抑制腫瘤細胞生長［3］；在人肝細胞癌細胞中，miR-1247-5p通過靶向Wnt3發揮腫瘤抑制作用［4］。然而，miR-1247-5p在胃癌中的作用尚不清楚。本研究通過分析胃癌組織中miR-1247-5p的表達情況，探討miR-1247-5p對胃癌侵襲、轉移的作用及相關機制，以期為胃癌的臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細胞AGS、HEK293T細胞及miR-NC、miR-1247-5p mimics慢病毒購自湖南豐暉生物技術有限公司。10%胎牛血清（FBS）、DMEM培養基購自武漢普諾賽生物技術有限公司，Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR? Premix Ex Taq試劑盒購自寶日醫生物技術有限公司。cDNA合成試劑盒、RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒、Stop amp; Glo? Reagent、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液和二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。兔抗Smad2抗體、兔抗波形蛋白（Vimentin）抗體、兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、兔抗N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔/鼠二抗購自艾博抗貿易有限公司。Mini-PROTEAN電泳儀、iMark多功能酶標儀購自伯樂生命醫學產品有限公司；Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析儀購自凱杰生物工程有限公司；CX43普通光學顯微鏡購自奧林巴斯株式會社。

1.2 組織樣本采集 收集2021年1—6月就診于我院經病理確診為胃癌的患者10例，其中男6例，女4例，年齡43～68歲，平均（53.63±8.22）歲。收集胃癌患者的腫瘤組織及距離腫瘤組織邊緣2 cm以上的癌旁組織各10例。納入標準：（1）患者臨床資料完整。（2）胃癌及癌旁組織樣本新鮮，RNA提取質量達標（RIN值≥7.0）。（3）患者或其家屬簽署知情同意書。排除標準：（1）轉移性胃癌或其他非原發性胃部惡性腫瘤。（2）術前接受放療、化療等治療。（3）合并其他嚴重疾病（如自身免疫性疾病、血液系統疾病等）。新鮮組織取出后的30 min內將其放入液氨快速冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 生物信息學分析 采用癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫分析胃癌及癌旁組織中差異表達的miRNA，利用R軟件的“limma”包對TCGA數據進行差異基因分析，篩選條件為|log2FC|＞1，P＜0.05。根據miR-1247-5p在胃癌中的中位表達量將其分為高表達組和低表達組，采用CIBERSORT算法計算樣品中免疫細胞的相對含量，并使用R包中的“corrplot”工具確定不同免疫細胞之間的關系。CancerMIRNome網絡數據（http：//bioinfo.jialab-ucr.org/CancerMIRNome）［5］分析腫瘤組織中差異表達的miRNA。利用ENCORI數據庫（https：//rna.sysu.edu.cn/encori/index.php）預測miR-1247-5p下游靶基因并進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，ENCORI平臺通過深入挖掘RNA互作數據，能夠全面注釋和發現RNA-RNA及蛋白質-RNA之間的相互作用［6］。使用GSCA在線分析網站（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA）對miR-1247-5p的靶基因進行基因及基因組［表達、單核苷酸變異（SNV）、拷貝數變異（CNV）和甲基化］和免疫基因組（24種免疫細胞）分析［7］。使用String數據庫（https：//cn.string-db.rog/cgi/input.pl）和Cytoscape 3.9.1軟件對miR-1247-5p的靶基因進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein，PPI）分析。

1.4 細胞培養及mimics慢病毒感染 胃癌細胞AGS用含有10%FBS的DMEM培養基，于5%CO2、37 ℃條件下培養，定期傳代。感染前1 d在6孔板上接種細胞（1×105個/孔），按照說明書分別用NC mimics慢病毒（序列：CGGGGACGAACGGGACGGGU）、mimics-miR-1247-5p慢病毒（序列：ACCCGUCCCGUUCGUCCCCGGA）感染AGS細胞。

1.5 RT-qPCR檢測組織中miR-1247-5p表達 取100 μg胃癌和癌旁組織樣本，提取組織中總RNA，定量并反轉錄為cDNA。采用整合型microRNA qPCR試劑盒，并結合實時PCR檢測系統實施qPCR分析。反應體系（20 μL）：cDNA 2.0 μL，miRNA上、下游引物各1.0 μL，2×qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15～30 s，55 ℃退火30～60 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。引物序列見表1。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-1247-5p的表達水平。

1.6 RT-qPCR檢測細胞中Smad2、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達 待胃癌細胞密度增至80%（1×106個）時使用TRIzol法提取總RNA，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行逆轉錄，按照SYBR? Premix Ex Taq試劑盒進行RT-qPCR反應。反應體系（20 μL）：2×StarScriptⅡ Green One Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScriptⅡ One Step Enzyme Mix 2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，RNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反應條件：50 ℃反轉錄10 min，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，不同目標基因設定不同溫度（Smad2 57 ℃、Vimentin 60 ℃、" E-cadherin 55 ℃、N-cadherin 58 ℃）退火15 s，70 ℃延伸30 s，共35個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各目標基因的表達水平。引物序列見表1。[基因 引物序列（5'→3'） 產物大小/bp miR-1247-5p 上游：ACCCGTCCCGTTCGTC 90 下游：TGCAGGGTCCGAGGTATTC U6 上游：CTCGCTTCGGCAGCACA 694 下游：AACGCTTCACGAATTTGC Smad2 上游：CTCACTGTAGATGGCTTTACAG 156 下游：GATCTTCAGATTACAGCCTGG Vimentin 上游：AGTCCACTGAGTACCGGAGAC 781 下游：CATTTCACGCATCTGGCGTTC E-cadherin 上游：AGGCCAAGCAGCAGTACATT 186 下游：ATTCACATCCAGCACATCCA N-cadherin 上游：GACAATGCCCCTCAAGTGTT 345 下游：CCATTAAGCCGAGTGATGGT GAPDH 上游：GGTCTCCTCTGACTTCAACA 558 下游：GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT ][Tab.1 Primer sequences

1.7 雙螢光素酶實驗檢測miR-1247-5p和Smad2 mRNA結合 將HEK293T細胞以1×104個/孔接種于96孔板，當細胞密度達50%～70%時進行質粒轉染。將10 μL DMEM與0.16 μg Smad2 3'-非翻譯區（UTR）靶質粒和5.0 pmol miR-1147-5p/陰性對照組混合，室溫下靜置20 min。每孔加入100 μL的1×PLB搖勻后，在4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清液至EP管中；加入工作液和操作液，將上述液體混勻后讀數，此值為內參值；然后再加入100 μL Stop amp;Glo? Reagent，混勻后測定讀取螢光強度值，此值即為報告基因發光值。

1.8 Transwell實驗 （1）遷移實驗。AGS細胞轉染NC mimics或mimics-miR-1247-5p 24 h后，胰酶消化細胞，并調整細胞懸液中的細胞含量為5×105/mL，按照分組滴加100 μL的細胞懸液至Transwell上室，下室滴加含10%FBS的培養液500 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h，然后使用4%多聚甲醛固定，1%結晶紫進行染色，于倒置光學顯微鏡下對遷移細胞進行拍照并計數。（2）侵襲實驗。用無血清培養基1∶3稀釋基質膠，每個小室內加入100 μL稀釋后的基質膠，其余步驟同遷移實驗。

1.9 Western blot實驗 收集1×106個細胞樣品于EP管中，RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA進行蛋白定量。SDS-PAGE分離蛋白質，而后轉移至PVDF膜上，室溫封閉1 h后，加入兔抗Smad2（1∶2 000）、Vimentin（1∶2 000）、" " " " " " "E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）一抗，于4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的山羊抗兔/鼠二抗（1∶5 000）室溫下孵育2 h。使用超敏發光液可視化免疫反應條帶，于Tanon 5200化學發光成像儀下成像，運用Image J軟件分析各個條帶的灰度值，以β-actin蛋白為內參，實驗重復3次。

1.10 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-1247-5p在不同腫瘤中的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-1247-5p在腫瘤組織中的表達情況 使用TCGA數據庫分析胃癌組織及癌旁組織中差異表達的miRNA，共有349個異常表達的miRNA，其中192個上調、157個下調，見圖1A；胃癌組織中miR-1247-5p表達水平低于癌旁組織（t=2.505，P＜0.05），見圖1B。ROC曲線分析表明miR-1247-5p表達水平是絕大部分腫瘤類型患者預后的獨立預測指標，見圖1C；泛癌分析顯示miR-1247-5p在大部分惡性腫瘤組織中低表達，見圖1D。RT-qPCR檢測結果證實，胃癌組織中miR-1247-5p表達水平低于癌旁組織（P＜0.05），見圖1E。

2.2 miR-1247-5p下游靶基因的生物信息學分" " "析 KEGG分析結果顯示，miR-1247-5p靶基因參與癌癥相關通路（pathways in cancer），絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway），Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等致癌通路，局灶性黏附（focal adhesion）、肌動蛋白細胞骨架的調控（regulation of actin cytoskeleton）等與腫瘤轉移密切相關通路亦顯著富集，見圖2A。GSCA在線分析網站分析發現miR-1247-5p靶基因的表達與上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路中E-cadherin蛋白的相關性最高（r=0.213，P＜0.001），見圖2B。

2.3 Smad2是miR-1247-5p的下游靶基因之一 對EMT通路中的靶基因進行PPI網絡分析發現，Smad2是該通路的Hub基因，見圖3A。miR-1247-5p與野生型Smad2的結合位點如圖3B所示。雙螢光素酶實驗結果發現，miR-1247-5p在野生型（WT）構建體中顯著抑制螢光素酶活性（t=8.032，P=0.002），在突變型（Mut）構建體中螢光素酶活性無明顯變化（t=0.153，P＞0.05），見圖3C。

2.4 過表達miR-1247-5p可抑制胃癌細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結果顯示，mimics-miR-1247-5p組胃癌細胞系AGS的遷移和侵襲能低于mimics-NC組（P＜0.05），見圖4、表2。

2.5 過表達miR-1247-5p抑制胃癌細胞中的EMT通路 與mimics-NC組比較，mimics-miR-1247-5p組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平升高，Smad2、N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖5、表3。

3 討論

胃癌的發生發展涉及多個分子機制的復雜調控網絡，其中非編碼RNA，特別是miRNA在腫瘤發生、發展、侵襲及轉移過程中發揮重要作用［8］。既往研究表明miR-1247-5p在乳腺癌［3］、肝癌［4］、肺癌［9］中發揮腫瘤抑制作用，但其在胃癌中的作用及相關機制尚不完全清楚［10］。因此，深入探索miR-1247-5p對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響，對揭示胃癌的分子機制、發現新的治療靶點具有重要意義。

本研究首先分析了TCGA數據庫中胃癌和正常胃組織樣本差異表達的miRNA。泛癌分析表明miR-1247-5p在大部分惡性腫瘤組織中低表達。ROC曲線分析表明miR-1247-5p是絕大部分腫瘤類型患者的預后的獨立預測指標。為驗證以上生物信息學分析的結果，本研究收集了10對胃癌組織和癌旁組織，RT-qPCR結果證實miR-1247-5p在胃癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織。進一步通過mimics過表達胃癌細胞中的miR-1247-5p，Transwell實驗證實miR-1247-5p明顯降低胃癌細胞的侵襲和遷移能力，這證實了miR-1247-5p作為抑癌分子，在抑制胃癌進展過程中發揮了重要作用。為探索miR-1247-5p在胃癌組織中表達下調并抑制胃癌進展的機制，本研究通過生物信息學網站預測了miR-1247-5p的靶基因，KEGG富集分析表明靶基因參與多種致癌通路（如癌癥相關通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、Wnt信號通路）以及與腫瘤轉移相關途徑（如局灶性黏附、肌動蛋白細胞骨架的調控）。

EMT是上皮細胞過渡到間充質狀態的細胞發育過程，也是與腫瘤侵襲和轉移相關的過程，其中細胞失去上皮標志物并獲得間充質特征。在EMT期間，上皮細胞失去其細胞-細胞黏附和頂端-基底極性，同時獲得間充質細胞特有的遷移和侵襲特性［11-13］。有研究證實，癌細胞中EMT的異常激活與腫瘤侵襲和轉移密切相關，是癌癥患者死亡的主要原因［14-15］。本研究通過GSCA分析發現miR-1247-5p靶基因的表達與EMT通路激活最為相關，PPI分析和雙螢光素酶實驗表明miR-1247-5p是通過特異性調節EMT路中的Smad2而發揮作用的；進一步的RT-qPCR和Western blot結果亦表明，過表達miR-1247-5p能夠顯著上調E-cadherin的表達，下調Smad2、N-cadherin、Vimentin的表達，提示miR-1247-5p可通過調節Smad2抑制胃癌細胞發生EMT，從而阻止胃癌的進展。由于EMT是腫瘤進展的早期，miR-1247-5p在此過程中發揮了重要作用，使miR-1247-5p可能成為胃癌早期檢測和干預的新靶標［16］。

綜上所述，胃癌中miR-1247-5p表達水平降低，促使EMT異常激活，導致腫瘤侵襲、轉移能力增強，在胃癌進展過程中發揮了重要作用。miR-1247-5p在胃癌發生發展過程中的具體作用機制尚待進一步探究。

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（2024-06-05收稿 2024-10-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）