麝香通心滴丸對晚期糖基化產物誘導的心臟微血管內皮細胞氧化應激的影響

摘要 "目的：探討麝香通心滴丸對晚期糖基化產物（AGEs）誘導的心臟微血管內皮細胞（CMECs）氧化應激的影響CMEG。方法：分離和培養小鼠CMECs，用AGEs模擬糖尿病高糖毒性對CMECs的損害，以麝香通心滴丸作為干預藥物，將細胞分為對照組、AGEs組、AGEs＋麝香通心滴丸組。采用亞甲基藍法檢測各組細胞中硫化氫（H2S）濃度，二氯熒光素（DCF）法測定細胞內活性氧（ROS）水平，蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測細胞中蛋白相對表達改變，實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法（qRT-PCR）檢測細胞中mRNA相對表達情況，酶聯免疫吸附測定法（ELISA）法測定細胞內谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等氧化應激相關指標。結果：麝香通心滴丸干預增加了CMECs中H2S的生成，并抑制細胞中ROS水平（P＜0.05）；麝香通心滴丸干預上調CMECs中核因子E2相關因子2（Nrf2）表達，Nrf2下游抗氧化基因血紅素氧合酶-1（HO1）、醌氧化還原酶1（NQO1）的表達也相應上調（P＜0.05）；麝香通心滴丸增加了細胞中GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶的含量（P＜0.05）。結論：麝香通心滴丸可通過增加H2S的生成顯著上調Nrf2的表達，從而增加抗氧化酶的生成來抑制細胞氧化應激，改善微循環。

關鍵詞 "心臟微血管內皮細胞；麝香通心滴丸；晚期糖基化產物；氧化應激

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.01.007

Effect of Shexiang Tongxin Dropping Pill on Oxidative Stress of Cardiac Microvascular Endothelial Cells Induced by Advanced Glycation End Products

ZHAO Jian

Second Affiliated Hospital of Naval Medical University， Shanghai 200003， China， E-mail： drzhaojiansmmu@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of Shexiang Tongxin Dropping Pill on oxidative stress in cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） induced by advanced glycation end products（AGEs）.Methods：CMECs were isolated and cultured from mice，AGEs were used to simulate the damage of high glucose toxicity in CMECs，while Shexiang Tongxin Dropping Pill was used as an intervention drug.Cells were divided into control group，AGEs group，and AGEs＋Shexiang Tongxin Dropping Pill group.The concentration of H2S in each group of cells was detected by Methylene Blue method，the level of intracellular reactive oxygen species（ROS） was determined by DCF method.Western Blot was used to detect the relative expression changes of proteins in cells.Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect mRNA relative expression in cells.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the oxidative stress related indexes such as glutathione reductase（GSH-Px），superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT） in cells.Results：Shexiang Tongxin Dropping Pill increased H2S production in CMECs and inhibited ROS levels in cells（P＜0.05）.Shexiang Tongxin Dropping Pill up-regulated the expression of nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2） in CMECs，and the expression of Nrf2 downstream antioxidant genes HO1 and NQO1 were also up-regulated（P＜0.05）.The contents of GSH-Px，SOD，CAT and other antioxidant enzymes in cells were increased by Shexiang Tongxin Dropping Pill（P＜0.05）.Conclusion：Shexiang Tongxin Dropping Pill can significantly up-regulate the expression of Nrf2 by increasing the production of H2S，thereby increasing the generation of antioxidant enzymes to inhibit cellular oxidative stress and improve microcirculation.

Keywords " "article type：cardiac microvascular endothelial cells; Shexiang Tongxin Dropping Pill; advanced glycation end products; oxidative stress

微循環障礙是糖尿病的主要心血管系統并發癥，而冠狀動脈微循環障礙（coronary microvascular dysfunction，CMD）則是糖尿病在心臟中的主要微血管問題。糖尿病人群的CMD發生率高達64%，無論其是否合并冠狀動脈狹窄都可能有不同程度的CMD［1］。CMD嚴重影響糖尿病病人預后，顯著增加其心肌梗死等主要不良心血管事件的發生風險［2］。目前，增加冠狀動脈微血管血流灌注的西藥主要包括尼可地爾和鈣離子拮抗劑等，但療效均不盡如人意，并不能帶來明顯的臨床獲益［3］。因此，仍缺乏公認的經大規模臨床試驗證實可有效針對糖尿病CMD的藥物。

CMD病理生理上表現為冠狀動脈前小動脈和小動脈的結構和（或）功能異常所致的心肌缺血，主要是內皮細胞依賴的血管舒張異常。前期動物模型研究發現，麝香通心滴丸這一傳統中藥可以激活小鼠心肌組織硫化氫合成酶的表達，繼而增加氣體信號分子硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）的含量，從而改善小鼠的冠狀動脈微循環，加快血流速度［4］。但對于麝香通心滴丸增加H2S生成后是如何發揮作用改善冠狀動脈微循環的機制，目前尚不清楚。既往研究顯示，H2S可激活核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2）的表達增加抗氧化酶的產生，從而發揮抗氧化應激的作用，對于維持正常血管內皮功能具有重要的生理意義［5］。而氧化應激正是糖尿病CMD的關鍵發病機制，氧化應激產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）對心臟微血管內皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）具有多種危害，抑制氧化應激將能減少ROS從而改善CMD［6-7］。本研究擬采用晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）誘導CMECs建立糖尿病高糖毒性對心臟微血管內皮細胞損傷模型，并應用麝香通心滴丸進行細胞干預，探究麝香通心滴丸對細胞氧化應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

參考文獻［8］實驗方法分離、培養CMECs。簡要步驟為：無菌剪取新生雄性小鼠［1～3 d，購自上海實驗動物中心，無特定病原體（SPF）級］心臟，去除血凝塊，剪碎至1 mm3大小的組織塊，放入50 mL離心管中，再加入2 g/L的Ⅱ型膠原酶消化，同時加入胎牛血清（FBS）1滴，37 ℃、80 r/min水浴搖床消化40 min后，吸管輕輕吹打組織塊2 min分散細胞。用吸管吸取細胞懸液放入15 mL離心管中，加入含體積分數10%FBS的高糖/Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）終止消化，收獲細胞，所有的細胞懸液用200目篩網過濾。1 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀中加入含體積分數10%FBS的高糖/DMEM 8 mL，吹打均勻后接種至2個3.5 cm培養皿中，培養4 h后用DMEM沖洗去除未貼壁細胞。貼壁的細胞于DMEM完全培養基中，置體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中培養。免疫熒光染色CD31/血管性血友病因子（vWF）抗原陽性，鑒定為所需的CMECs。本研究獲得醫院倫理委員會批準（No.2016LS038）。

1.1.2 主要試劑及儀器

麝香通心滴丸購自內蒙古康恩貝藥業有限公司，AGEs購自美國BioVision生物科技有限公司，ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗Nrf2多克隆抗體購自美國CST生物公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（MA-6000）購自蘇州雅睿公司；蛋白凝膠電泳儀（TY-80）購自南京普陽公司；凝膠成像儀（GenoSens 2000 Touch）購自上海勤翔公司；SYBR PremixEx TaqTM試劑盒購自日本Takara生物公司；Nanodrop 2000c購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 分組

取CMECs細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，分為對照組、AGEs組、AGEs＋麝香通心滴丸組，AGEs組給予AGEs 0.3 mg/mL；AGEs＋麝香通心滴丸組給予AGEs 0.3 mg/mL＋麝香通心滴丸100 μg/mL；對照給予等劑量細胞培養液。處理24 h。

1.2.2 H2S含量檢測

收集各組細胞，加入裂解液冰上裂解30 min。首先配制標準曲線。管中依次加入0.5 mL 1%醋酸鋅、10 mmol/L 硫氫化鈉（NaHS）、0.5 mL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸、0.5 mL 30 mmol/L 氯化鐵（FeCl3）、3.5 mL去離子水，避光反應20 min。取200 μL放入酶標儀中在670 nm處檢測吸光度值。吸取430 μL勻漿上清液，加入20 μL 10 mmol/L的L-半胱氨酸、20 μL 2 mmol/L的5磷酸吡多醛及30 μL PBS共500 μL于玻璃離心管中，震蕩混合均勻。將玻璃離心管封口，37 ℃水浴孵育30 min。加入250 μL 1%的醋酸鋅。加入250 μL 10%的三氯醋酸。加入133 μL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸，133 μL 30 mmol/L FeCl3。避光20 min后取200 μL終反應液，于670 nm測量吸光度。根據標準曲線計算H2S的含量。

1.2.3 氧化應激指標檢測

采用二氯熒光素（DCF）法測定細胞內ROS水平，吸掉舊培養基，PBS洗細胞1次。加入多聚甲醛固定15 min，PBS洗掉多余溶液。配置探針孵育工作液：避光操作，用培養基稀釋探針（1∶1 000），終濃度10 μmol/L。避光操作，每孔加入250 μL探針工作液，37 ℃培養箱孵育10～20 min。棄掉探針孵育工作液，PBS溫和洗2～3次，然后各孔加入250 μL 4′，6′-二脒基-2-苯咪基吲哚（DAPI）進行復染細胞核。PBS溫和洗2次或3次。利用熒光顯微鏡觀察。采用ELISA試劑盒測定細胞中谷胱甘肽還原酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的含量。

1.2.4 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法（qRT-PCR）檢測細胞中mRNA相對表達情況

收集細胞，應用Trizol提取細胞中RNA，Nanodrop 2000c測定每個標本RNA濃度，用于后續反轉錄。根據測定的RNA濃度，加入500 ng RNA至10 μL體系，然后加入2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，最后用RNase Free dH2O補齊至10 μL反應體系。根據反轉說明書設置反轉儀，反轉錄獲得cDNA。采用SYBR PremixEx TaqTM試劑盒配制10 μL反應體系，即將獲得的cDNA用Easy Dillution稀釋10倍。然后每孔加入1 μL稀釋后的底物、1 μL混合引物、4 μL酶預混物和4 μL RNase Free dH2O，設置3個副孔，進行qRT-PCR，采用內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參。相關引物序列見表1。

1.2.5 蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測細胞中蛋白相對表達改變

收集各組細胞，加入蛋白裂解液（RIPA裂解液），冰上裂解細胞30 min。裂解液于12 000 r/min離心15 min。收集上清液，于－20 ℃保存備用，并利用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度。完成定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，并用1×蛋白上樣緩沖液稀釋待測標本至2.5 mg/mL。上樣時，吸取10 μL加至上樣孔。恒壓110 V，電泳至溴酚藍跑至分離膠最下方。根據分離膠上目的條帶尺寸，剪下適宜的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。將PVDF膜用甲醇浸泡約5 min，激活。然后按照濾紙、膠、膜、濾紙的順序夾好，膠對著負極。加入轉膜液，轉膜液周圍用冰袋保持低溫，恒流250 mA轉膜90 min。然后用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST液）將膜沖洗兩次，用TBST配備的5%BSA溶液于搖床上室溫封閉1 h。封閉結束后用TBST沖洗1次，然后依次進行一抗孵育和二抗孵育。最后，顯色前取適量增強化學發光法（ECL）發光液A液和B液等體積混合。然后取適量滴于PVDF膜上，于凝膠成像系統顯色并保存。將獲取的圖像用Image J軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8軟件進行數據和繪圖分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 麝香通心滴丸增加CMECs中H2S的生成

AGEs組CMECs中H2S含量相比對照組顯著降低（Plt;0.01），而AGEs＋麝香通心滴丸組H2S含量高于AGEs組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 麝香通心滴丸抑制CMECs中ROS水平

熒光顯微鏡觀察，AGEs組ROS水平相比對照組升高，而AGEs＋麝香通心滴丸組ROS水平低于AGEs組。詳見圖2。

2.3 麝香通心滴丸上調CMECs中Nrf2和下游抗氧化基因HO1、NQO1表達

AGEs組CMECs中Nrf2蛋白表達相比對照組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸組Nrf2蛋白表達高于AGEs組，差異有統計學意義（P＜0.05）。AGEs組Nrf2的下游抗氧化基因HO1、NQO1 mRNA表達相比對照組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸組HO1、NQO1 mRNA表達高于AGEs組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖3～圖6。

2.4 麝香通心滴丸增加CMECs細胞中GSH-Px、SOD和CAT氧化酶含量

AGEs組GSH-Px、SOD和CAT含量相比對照

組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸GSH-Px、SOD和CAT含量高于AGEs組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖7～圖9。

3 討 論

CMD在糖尿病心肌病的發生發展中發揮重要作用，主要表現為糖尿病病人的冠狀動脈血流儲備較非糖尿病對照顯著降低，微循環阻力升高［9］。CMD是糖尿病病人心血管死亡的獨立危險因素，但嚴格的血糖控制并不能有效改善冠狀動脈微循環和延緩糖尿病心肌纖維化進展［10］。氣虛血瘀是CMD在內的心血管疾病發生發展的重要因素，治療上應首先益氣，兼以活血化瘀祛痰［11-12］。麝香通心滴丸兼具益氣活血雙重功效，是治療“胸痹”的良方，可促進微小血管的血運及灌注，活血化瘀輔助改善大動脈血管的狹窄與阻塞［13-14］。動物研究證實，麝香通心滴丸可通過抗氧化、抗凋亡、促進血管新生等多種機制減輕心肌缺血［15-16］，減少微血栓的形成［17］，增加心肌血流灌注，改善缺血再灌注后冠脈微循環障礙和心功能不全［18］；研究發現，舌下含服麝香通心滴丸可即時加快冠狀動脈慢血流病人的冠狀動脈血流速度，而冠狀動脈慢血流與CMD高度相關［19］。

氧化應激是導致糖尿病CMD的主要機制。正常情況下，ROS處于低水平，病理條件下，ROS代謝產物增加，可直接引起血管內皮功能障礙。ROS是多種信號通路的中心分子，參與了血小板衍生生長因子、轉化生長因子-β等誘導微血管重構的病理過程［20］。糖尿病條件下，ROS生成增多，影響心肌微血管系統和心肌代謝，是造成糖尿病病人心肌缺血的重要因素［6］。本研究也發現糖尿病組ROS生成顯著增加，抗氧化酶表達下降，證實了高糖情況下氧化應激損害，影響內皮細胞活力。因此，抑制氧化應激減少ROS的生成是CMD重要的干預靶點。H2S是繼一氧化氮之后另一重要的氣體信號分子，可通過多種通路發揮抗氧化、抗凋亡、抗炎和促進血管新生等心臟保護作用。本研究中，糖尿病組H2S生成減少，Nrf2表達受到抑制，而應用麝香通心滴丸干預后，內皮細胞的H2S生成得到很大程度的提高，繼而激活Nrf2，增加抗氧化酶基因的表達和下游抗氧化酶的生成，繼而抑制ROS的生成，減少氧化應激。既往研究也顯示，H2S能誘導Nrf2的表達并使其進入細胞核與抗氧化元件結合，啟動下游編碼CAT、SOD、GSH-Px等多種抗氧化酶基因的表達，從而清除ROS，發揮抗氧化應激、保護心血管的作用［21-22］。

從中醫的角度分析，糖尿病中氧化應激反應產生的ROS等氧化物質增多，可類比于“痹癥”中心脈的血瘀痰濁，H2S生成缺乏則可類比于“氣虛”。本研究發現麝香通心滴丸可顯著增加H2S的合成，減少ROS，減輕心肌微血管內皮的損傷。該結果證實了麝香通心滴丸在中醫理論中“益氣通脈”的功效與增加氣體信號分子H2S產生的關系，中西醫理論和實踐相互呼應，異曲同工印證了本研究設想的合理性。

綜上所述，麝香通心滴丸可有效降低糖尿病狀態下的晚期糖基化產物誘導的CMECs的氧化應激，是一種潛在的可有效改善糖尿病心臟微循環的藥物，可為糖尿病冠狀動脈微循環障礙的防治提供重要的理論基礎。深入研究不但有助于揭示益氣通脈方藥防治冠狀動脈微循環障礙的新機制，還為進一步深入挖掘傳統中醫藥治療冠狀動脈微循環障礙奠定相關基礎。

參考文獻：

［1］ LIAO K P，HUANG J，HE Z L，et al.Coronary microvascular dysfunction in rheumatoid arthritis compared to diabetes mellitus and association with all-cause mortality［J］.Arthritis Care amp; Research，2021，73（2）：159-165.

［2］ HU X Y，ZHANG J L，LEE J M，et al.Prognostic impact of diabetes mellitus and index of microcirculatory resistance in patients undergoing fractional flow reserve-guided revascularization［J］.International Journal of Cardiology，2020，307：171-175.

［3］ HOKIMOTO S，KAIKITA K，YASUDA S，et al.JCS/CVIT/JCC 2023 guideline focused update on diagnosis and treatment of vasospastic angina（coronary spastic angina） and coronary microvascular dysfunction［J］.Circulation Journal，2023，87（6）：879-936.

［4］ ZHANG Y D，ZHAO J，HE Z Q，et al.Shexiang Tongxin dropping pill improves peripheral microvascular blood flow via cystathionine-γ-lyase［J］.Medical Science Monitor，2019，25：6313-6321.

［5］ YARMOHAMMADI F，HAYES A W，KARIMI G.The cardioprotective effects of hydrogen sulfide by targeting endoplasmic reticulum stress and the Nrf2 signaling pathway：a review［J］.BioFactors，2021，47（5）：701-712.

［6］ SEVERINO P，D′AMATO A，NETTI L，et al.Myocardial ischemia and diabetes mellitus：role of oxidative stress in the connection between cardiac metabolism and coronary blood flow［J］.Journal of Diabetes Research，2019，2019：9489826.

［7］ LIU Z W，ZHU H T，MA Y P，et al.AGEs exacerbates coronary microvascular dysfunction in NoCAD by activating endoplasmic reticulum stress-mediated PERK signaling pathway［J］.Metabolism，2021，117：154710.

［8］ WANG J F，ZHOU J M，WANG Y Y，et al.Qiliqiangxin protects against anoxic injury in cardiac microvascular endothelial cells via NRG-1/ErbB-PI3K/Akt/mTOR pathway［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2017，21（9）：1905-1914.

［9］ HORTON W B，BARRETT E J.Microvascular dysfunction in diabetes mellitus and cardiometabolic disease［J］.Endocrine Reviews，2021，42（1）：29-55.

［10］ VALENZUELA-GARCIA L F，MATSUZAWA Y，SARA J D，et al.Lack of correlation between the optimal glycaemic control and coronary micro vascular dysfunction in patients with diabetes mellitus：a cross sectional study［J］.Cardiovascular Diabetology，2015，14：106.

［11］ 李淵芳，謝盈彧，徐士欣，等.淺析氣血同治法在冠脈微循環障礙中的應用［J］.遼寧中醫雜志，2019，46（9）：1855-1858.

［12］ 李磊.冠脈微循環障礙模型的建立及雙參寧心膠囊的干預作用研究［D］.北京：中國中醫科學院，2019.

［13］ 楊廣智.寬心益氣湯聯合麝香通心滴丸在氣虛血瘀型冠心病心絞痛治療中的效果分析［J］.中國現代藥物應用，2020，14（7）：196-198.

［14］ 趙晶晶.麝香通心滴丸對糖尿病心肌病心肌重構及微循環障礙的改善作用探討［D］.杭州：浙江大學，2020.

［15］ LIU H H，ZHAO J J，PAN S L，et al.Shexiang Tongxin dropping pill protects against sodium laurate-induced coronary microcirculatory dysfunction in rats［J］.J Tradit Chin Med，2021，41（1）：89-97.

［16］ LU X Y，YAO J K，LI C X，et al.Shexiang Tongxin dropping pills promote macrophage polarization-induced angiogenesis against coronary microvascular dysfunction via PI3K/AKT/mTORC1 pathway［J］.Frontiers in Pharmacology，2022，13：840521.

［17］ DING Y，ZHU H Y，ZHANG L Z，et al.Shexiang Tongxin dropping pill reduces coronary microembolization in rats via regulation of mitochondrial permeability transition pore opening and AKT-GSK3β phosphorylation［J］.Chinese Journal of Integrative Medicine，2021，27（7）：527-533.

［18］ 姚玉斯，曾智桓，趙艷群，等.麝香通心滴丸改善豬心肌缺血再灌注后冠脈微循環和心功能［J］.南方醫科大學學報，2020，40（6）：899-906.

［19］ WANG S H，CHU L，XU Z，et al.Effect of Shexiang Tongxin dropping pills on the immediate blood flow of patients with coronary slow flow［J］.Chinese Journal of Integrative Medicine，2019，25（5）：360-365.

［20］ BURGOS-MORóN E，ABAD-JIMéNEZ Z，MARA?óN A M，et al.Relationship between oxidative stress，ER stress，and inflammation in type 2 diabetes：the battle continues［J］.Journal of Clinical Medicine，2019，8（9）：1385.

［21］ LING K，ZHOU W，GUO Y，et al.H2S attenuates oxidative stress via Nrf2/NF-κB signaling to regulate restenosis after percutaneous transluminal angioplasty［J］.Experimental Biology and Medicine，2021，246（2）：226-239.

［22］ CORSELLO T，KOMARAVELLI N，CASOLA A.Role of hydrogen sulfide in NRF2- and sirtuin-dependent maintenance of cellular redox balance［J］.Antioxidants，2018，7（10）：129.

（收稿日期：2023-05-18）

（本文編輯 鄒麗）