石斛酚對小鼠黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組影響的測序比對分析

摘要 為了鑒定和分析石斛酚對黑色素瘤細(xì)胞作用過程中差異表達(dá)的mRNA和LncRNA，以小鼠黑色素瘤細(xì)胞為試驗對象，采用RNA-Seq技術(shù)和生物信息學(xué)方法對石斛酚組（160 μmol/L）和對照組（0 μmol/L）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，運用DESeq軟件鑒定2組間差異表達(dá)的mRNA和LncRNA，對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析，同時對差異表達(dá)的LncRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，2組間存在588個差異表達(dá)的mRNA。與對照組相比，石斛酚組顯著上調(diào)表達(dá)296個mRNA和顯著下調(diào)表達(dá)292個mRNA；588個差異表達(dá)基因共富集在66個GO功能條目上，主要包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能；富集的KEGG信號通路主要包括P53信號通路、雌激素信號通路、范可尼貧血信號通路、MAPK信號通路和磷脂酰肌醇信號通路等。另外，2組間存在161個差異表達(dá)的LncRNA。與對照組相比，石斛酚組顯著上調(diào)表達(dá)52個LncRNA和顯著下調(diào)表達(dá)109個LncRNA；通過對差異表達(dá)的LncRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，共獲得259個順式作用的靶基因和6 950個反式作用的靶基因。由此可見，石斛酚處理可以改變黑色素瘤中多種mRNA和LncRNA的表達(dá)，這些差異表達(dá)的mRNA和LncRNA可能是石斛酚治療黑色素瘤的藥物靶點。

關(guān)鍵詞 黑色素瘤；石斛酚；轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號 S852.21" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.018

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Sequencing Comparative Analysis of the Effects of Gigantol on the Transcriptome of Mouse Melanoma Cells

Abudumijit·Ahat， HAN Xue， DAI Xiao hua et al

（College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang" 830052）

Abstract In order to identify and analyze the differentially expressed mRNA and LncRNA in the process of dendrophenolics acting on melanoma cells in mouse， the transcriptome sequencing of gigantol group （160 μmol/L） and control group （0 μmol/L） was carried out by RNA Seq technology and bioinformatics methods. The differentially expressed mRNA and LncRNA were identified by DESeq software. The differentially expressed mRNA was annotated by GO function and enriched by KEGG signal pathway， and the target gene of differentially expressed LncRNA was predicted and analyzed.The results showed that there were 588 differentially expressed mRNA between the two groups. Compared with the control group， 296 mRNA were significantly up regulated and 292 mRNA were significantly down regulated in the gigantol group. A total of 588 differentially expressed genes were enriched in 66 GO functional items， mainly including biological processes， cellular components and molecular functions. The enriched KEGG signaling pathways mainly included P53 signaling pathway， estrogen signaling pathway， Fanconi anemia signaling pathway， MAPK signal pathway and phosphatidylinositol signal pathway. In addition， there were 161 differentially expressed LncRNAs between the two groups. Compared with the control group， 52 LncRNAs were significantly up regulatedand 109 LncRNAs were significantly down regulated in the gigantol group.The prediction and analysis of differentially expressed LncRNA target genes showed that 259 cis acting target genes and 6950 trans acting target genes were obtained. In conclusion， gigantol treatment can change the expression of various mRNA and LncRNA in melanoma， and these differentially expressed mRNAs and LncRNAs may be the drug targets of gigantol in the treatment of melanoma.

Key words Melanoma;Gigantol;Transcriptome sequencing

基金項目 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（青年基金）項目（2019 D01B24）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)前期資助項目（XJAU201707）。

作者簡介 阿卜杜米吉提·艾海提（1997—），男，新疆庫車人，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。

*通信作者，講師，碩士，從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期 2023-08-13

黑色素瘤是一種由于黑色素細(xì)胞增殖無法受到控制而引起的最具侵襲性腫瘤，主要發(fā)生于人或動物皮膚的無毛部位。雖然皮膚黑色素瘤占所有皮膚惡性腫瘤的比例不到5%，但由于其具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性^［1］，死亡率在皮膚惡性腫瘤中排第一名，嚴(yán)重危害著人和馬屬動物的健康。目前治療黑色素瘤的藥物只有少數(shù)幾種，如達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺等，但治療有效率較低。因此，研發(fā)新型有效、低毒的抗黑色素瘤藥物對于臨床治療黑色素瘤患者和動物具有重要意義。

中醫(yī)藥在抗腫瘤和抗病毒等方面歷史悠久，從中草藥提取物中篩選低毒、安全、有效的成分作為抗腫瘤藥物一直是學(xué)界的研究熱點^［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，石斛中酚酸類化合物具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、抗凝血及擴(kuò)張血管等活性^［3-6］，而石斛酚對非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等^［7-9］具有顯著的抗癌活性。然而，目前石斛酚對黑色素瘤的作用機(jī)制尚未見報道。LncRNA與mRNA在惡性黑色素瘤進(jìn)化發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色。筆者探討了石斛酚對黑色素瘤中LncRNA和mRNA表達(dá)的影響，以期為將石斛酚應(yīng)用于黑色素瘤的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

供試石斛酚購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMSO購自福州奧研實驗器材有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25% Trypsin amp; 0.02%EDTA、青霉素-鏈霉素溶液、細(xì)胞培養(yǎng)皿（60 mm）均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清FBS購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 試驗藥物與細(xì)胞

1.2.1

小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16。小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2條件下置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%，就將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并將第3代細(xì)胞整合用于后面的試驗。

1.2.2

石斛酚。石斛酚使用0.004%的DMSO進(jìn)行溶解，使其濃度達(dá)到44 mmol/L，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)的濃度，4 ℃下備用。

1.3 試驗分組及藥物干預(yù)

將小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16分成2組，即對照組和石斛酚組，依次加入0、160 μmol/L石斛酚處理24 h后收集細(xì)胞，用于RNA-Seq試驗。

1.4 RNA-Seq文庫構(gòu)建和測序數(shù)據(jù)預(yù)處理

提取對照組和石斛酚組的RNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后建立全轉(zhuǎn)錄組文庫。2組樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增及純化、文庫質(zhì)檢后，上機(jī)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序。隨后，將獲得的原始數(shù)據(jù)用Trimmomatic軟件進(jìn)行過濾，采用滑窗法去除含有帶接頭、低質(zhì)量的序列，并根據(jù)mRNA、LncRNA的特點，保證獲得Clean數(shù)據(jù)；從Clean數(shù)據(jù)中抽取10 000條序列利用NCBINT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對，取e值≤10^-10且相似度gt;90%、覆蓋度gt;80%的比對結(jié)果，計算其物種分布。

1.5 DE mRNAs和DE LncRNAs的篩選與分析

針對對照組和石斛酚組的Clean數(shù)據(jù)，利用R語言中的vegan package進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和樣本間相似程度分析，然后使用DESeq2軟件進(jìn)行差異分析，篩選條件設(shè)置如下：P值≤0.05且差異倍數(shù)|Fold Change|≥2，獲得2組間顯著差異表達(dá)的mRNA和LncRNA。最后，利用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO功能和KECG通路富集分析。

1.6 LncRNA靶基因預(yù)測及功能注釋

利用Bedtools算法預(yù)測LncRNA靶基因，預(yù)測LncRNA靶基因過程中所使用的閾值參數(shù)為S≥150，ΔG≤-125.58 kJ/mol和Demand strict 5′seed pairing，其中S是指匹配區(qū)域內(nèi)single residue pair match scores；ΔG為雙鏈形成時所需的自由能。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛酚組和對照組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

通過建庫測序，從對照組中分別獲得9 271 408 463、6 950 508 120、7 374 448 953個有效總堿基數(shù)，從石斛酚組中分別獲得7 779 118 532、9 921 516 979、11 140 731 042個有效總堿基數(shù)；6組樣本的GC含量為53.16%～55.18%，堿基質(zhì)量Q30數(shù)目分別為8 621 895 070、6 489 612 063、6 870 254 215、7 229 617 505、9 194 455 091、10 335 601 705，堿基質(zhì)量值Q30在92.67%以上，可見樣本質(zhì)量符合測序要求。

2.2 DE mRNAs和DE LncRNAs的鑒定

該研究對DE mRNAs和DE LncRNAs測序結(jié)果的比對分析發(fā)現(xiàn)，對照組和石斛酚組間存在顯著差異表達(dá)的mRNA有588個。與對照組相比，石斛酚組顯著上調(diào)表達(dá)296個mRNA和顯著下調(diào)表達(dá)292個mRNA；存在顯著差異表達(dá)的LncRNA共有161個，與對照組相比石斛酚組顯著上調(diào)表達(dá)52個LncRNA和顯著下調(diào)表達(dá)109個LncRNA；在2組樣本之間，表達(dá)量無顯著差異的mRNA有61 615個，表達(dá)量無顯著差異的LncRNA有45 783個（圖1）。在差異表達(dá)的588個mRNA中，根據(jù)差異倍數(shù)大小，排名前15位的mRNA分別為Slc25a12、Sin3a、Il11ra1、Dhx32、Aldh7a1、Phyhd1、Lrrc47、Nat9、Pqlc2、Npepps、Dusp3、Ccdc136、Lmf1、Pfdn4、Slc35c2。在差異表達(dá)的161個LncRNA中，根據(jù)差異倍數(shù)大小，排名前15位的LncRNA分別為MSTRG.2614.1、Lrrc28、Polg、Dnajc24、Sfi1-AS1、Zfp764、Dbn1、Rasa4、Zfp263、Vps39、Wnk1、Bnc2-AS1、Arid5a、Cyb5r4、Chkb-AS1。

2.3 差異表達(dá)靶基因的GO和KEGG信號通路分析

通過對588個差異表達(dá)mRNA進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)mRNA共富集在66個GO功能條目上，其中與生物學(xué)過程相關(guān)的條目有26個，與細(xì)胞組分相關(guān)的條目有21個，與分子功能相關(guān)的條目有19個。在生物學(xué)過程條目中，細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)3個類別占比較高；在細(xì)胞組分條目中，細(xì)胞組分、細(xì)胞、細(xì)胞器3個類別占比較高；在分子功能條目中，綁定分子功能和催化活性2個類別占比較高。KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)mRNA富集的前5條信號通路分別為P53信號通路、雌激素信號通路、范可尼貧血信號通路、MAPK信號通路和磷脂酰肌醇信號通路（圖2）。

2.4 差異表達(dá)LncRNA靶基因的預(yù)測

通過對對照組和石斛酚組161個差異表達(dá)LncRNA靶基因的預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，石斛酚組共獲得259個順式作用的靶基因和6 950個反式作用的靶基因。其中，按照差異倍數(shù)大小，前15個LncRNA的預(yù)測靶基因總獲得30個順式作用的靶基因（包括Sectm1b、Sectm1a、Lrrc28、Polg、Fanci、Dnajc24、Immp1、Sfi1、Drg1l、Eif4enif1等）和541個反式作用的靶基因（包括Kif21a、Ctsa、Rtkn、Pdzd7、Adnp、Gls、Foxn4、Sh3bp1、Xrra1、Prune1等）。

3 討論

黑色素瘤嚴(yán)重危害人和馬屬動物的健康，目前臨床上仍缺乏安全有效的治療藥物，中草藥因其易獲得、低毒性等特點受到廣大學(xué)者的密切關(guān)注。研究表明，酚類化合物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，包括乳腺癌細(xì)胞MCF-7、非小細(xì)胞肺癌NCI-H460、宮頸癌Hela細(xì)胞和HCC HepG2細(xì)胞系等^［10］。石斛酚具有抗腫瘤、抗癌等活性，但其在黑色素瘤中的作用機(jī)制尚未見報道。筆者所在課題組前期試驗結(jié)果顯示石斛酚對B16細(xì)胞增殖與遷移能力具有抑制作用，該研究在此基礎(chǔ)上采用高通量測序的方法尋找石斛酚可能的作用靶點，為后續(xù)全面揭示石斛酚對黑色素瘤的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

該研究結(jié)果顯示對照組和石斛酚組存在顯著差異表達(dá)的mRNA有588個，其中多個mRNA與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，比如敲低黑色素瘤細(xì)胞中Slc25a12的表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移^［11］；Sin3a與HDAC1/2形成轉(zhuǎn)錄阻遏復(fù)合物，從而沉默BMP6的表達(dá)，進(jìn)而激活SMAD5信號，促進(jìn)黑色素瘤的生長及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散^［12］；Dusp3參與腫瘤黑素細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、存活、凋亡、基因組穩(wěn)定性、黏附和遷移等過程^［13］。此外，對照組和石斛酚組間還存在顯著差異表達(dá)的LncRNA有161個，其中多個LncRNA與癌癥進(jìn)程相關(guān)，比如敲低LncRNA Bnc2-AS1可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力^［14］。由此可見，該研究尋找到的多個差異表達(dá)mRNA和LncRNA極有可能是石斛酚在黑色素瘤中的作用靶點。

該研究結(jié)果顯示對照組和石斛酚組差異表達(dá)mRNA富集到的通路有P53信號通路、雌激素信號通路、范可尼貧血信號通路、MAPK信號通路和磷脂酰肌醇信號通路。以往研究表明，雌激素信號通路、MAPK信號通路和磷脂酰肌醇信號通路等參與黑色素的形成^［15］；石斛酚能夠抑制MAKP信號通路，緩解高糖誘導(dǎo)的腎損傷；石斛酚還可以通過調(diào)節(jié)P53信號通路和磷脂酰肌醇信號通路活性來抑制肝癌細(xì)胞的增殖^［8］。由此可見，石斛酚極有可能通過調(diào)節(jié)差異表達(dá)mRNA影響這些信號通路的活性來發(fā)揮治療黑色素瘤的作用。

該研究利用高通量測序技術(shù)研究石斛酚在黑色素瘤中的潛在靶基因mRNA和LncRNA，并進(jìn)一步分析其可能的作用通路，此結(jié)果有助于后續(xù)挖掘石斛酚治療黑色素瘤的作用機(jī)制，也可為石斛酚的臨床應(yīng)用奠定理論依據(jù)。但是，目前尚缺乏石斛酚對黑色素瘤作用機(jī)制的試驗結(jié)果，仍需要通過大量試驗進(jìn)行驗證。

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