玉米ZmWaxy的生物信息學分析

摘要 為給糯玉米分子育種工作提供數(shù)據(jù)支撐，對玉米ZmWaxy蛋白序列利用現(xiàn)代生物信息學軟件進行信號肽、保守結構域、跨膜結構域以及蛋白高級結構、進化樹及理化特性等分析。結果表明：玉米ZmWaxy基因有3 676 bp開放讀碼框，并編碼1個穩(wěn)定的由609個氨基酸構成的弱酸性親水蛋白，其分子量大小為66.61 kD。玉米ZmWAXY蛋白預測有49個磷酸化修飾位點，12個糖基化修飾位點。有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結構域，但不含有信號肽結構和跨膜結構域。其二級結構和三級結構以無規(guī)則卷曲為主，伴有大量α-螺旋和少量β轉角。進化關系中，玉米與高粱最近，次之為水稻和谷子，與小麥進化關系最遠。

關鍵詞 糯玉米；ZmWaxy蛋白；生物信息學

中圖分類號 S-058" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0096-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Bioinformatics Analysis of ZmWaxy of Zea mays L.

XING Lei， CHEN Yong xin， FAN Rui et al

（Maize Research Institute of Shanxi Agricultural University， Xinzhou， Shanxi 034000）

Abstract To provide certain data support for molecular breeding of glutinous corn， this study analyzed the signal peptide， conserved domain， transmembrane domain， protein advanced structure， evolutionary tree， and physicochemical properties of corn ZmWaxy protein sequence using modern bioinformatics software. The results showed that the maize ZmWaxy gene has an open reading frame of 3 676 bp and encodes a stable weakly acidic hydrophilic protein composed of 609 amino acids， with a molecular weight of 66.61 kD. The corn ZmWAXY protein is predicted to have 49 phosphorylation modification sites and 12 glycosylation modification sites， carrying out rich protein post translational modification activities. It had a typical conserved domain of GT5 Glycogen synthase DULL like protein， but did not contain signal peptide structures and transmembrane domains. Its secondary and tertiary structures were mainly characterized by irregular curls， accompanied by a large number of α Spiral and small amount β Corner. In evolutionary relationships， corn was closest to sorghum， followed by rice and millet， and had the farthest evolutionary relationship with wheat.

Key words Waxy corn;ZmWaxy protein;Bioinformatics

基金項目 山西省科技重大專項計劃揭榜掛帥項目“甜糯玉米種質創(chuàng)新與新品種選育”（202201140601025-1-06）；山西省玉米產業(yè)技術體系（2023CYJSTX01-08）；忻州市科技成果轉化引導專項“優(yōu)質白色甜加糯玉米新品種晉甜糯2號示范推廣”（20230403）；忻州市重點研發(fā)計劃項目“甜糯玉米抗逆優(yōu)異種質材料創(chuàng)制與挖掘利用”（20230203）。

作者簡介 邢磊（1994—），女，山西忻州人，實習研究員，碩士，從事甜糯玉米種質材料創(chuàng)新與品種選育研究。*通信作者，二級研究員，從事甜糯玉米種質材料創(chuàng)新與品種選育研究。

收稿日期 2023-12-28；修回日期 2024-05-07

玉米是人們日常生活中重要的糧食作物之一^［1-2］。近年來，由于產業(yè)結構升級，鮮食玉米兼具營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值的特點，使其成為特色高效農業(yè)和農業(yè)產業(yè)化發(fā)展的新亮點，備受社會和農業(yè)學家的關注^［3-4］，因此玉米育種工作作為影響玉米品質和產量的重要因素，也受到了極高的重視。支鏈淀粉含量高達98%以上的糯玉米，富含多種維生素、氨基酸，口感軟糯，清香滿口，適口性極好，是人們餐桌上必不可少的美味^［5］，其黏滯性強，結構獨特，也是造紙、飼料的優(yōu)質原料^［6］。

Waxy基因又叫蠟質基因，編碼顆粒凝結型淀粉合成酶（GBSSI）。GBSSI是植物儲藏器官中顆粒結合蛋白的主要部分，存在于胚乳中，控制胚乳直鏈淀粉的合成^［7-11］。普通玉米由于GBSSI活性較高，成熟胚乳積累超23%的直鏈淀粉表現(xiàn)為非糯性^［12-13］。糯玉米由于其Waxy基因的缺失、突變或GBSSI酶活的降低而導致直鏈淀粉合成受阻，胚乳中只積累支鏈淀粉，表現(xiàn)為糯性^［14-16］。筆者對玉米ZmWaxy蛋白的信號肽、跨膜結構域、保守結構域以及蛋白高級結構、進化樹、理化特性等進行分析，旨在為糯玉米分子育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 序列

玉米（Zea mays L.）ZmWaxy［GeneID=541854］、谷子（Setaria italica）SiWaxy［GeneID=101761090］、小麥（Triticum aestivum）TaWaxy［GeneID=543395］、水稻（Oryza sativa）OsWaxy［GeneID=4340018］、高粱（Sorghum bicolor）SbWaxy［GeneID=8068390］基因序列與蛋白均來源于檢索工具NCBI。

1.2 生物信息學軟件

1.2.1 基因閱讀框分析。

利用檢索工具NCBI獲得玉米及其他植物的Waxy基因及蛋白序列，通過NCBI的“ORF finder”在線平臺（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析玉米Waxy基因序列的開放讀碼框。

1.2.2 性質及功能分析。

通過Protscale、ProtParam在線平臺分析玉米ZmWaxy蛋白的親疏水性和理化性質，通過NetOGlyc4.0和Netphos3.1分析玉米ZmWaxy蛋白的糖基化及磷酸化位點；使用TMHMM、SingalP 4.1 Server和ScanProsite軟件分析預測玉米ZmWaxy蛋白的跨膜結構域、信號肽及保守結構域；采用Psort Prediction和Cell-PLoc 2.0在線平臺對玉米ZmWaxy蛋白進行亞細胞定位；使用COILS、SOPMA、PSIPRED 4.0和Phyre2、PyMol在線平臺預測玉米ZmWaxy蛋白的二級和三級結構。該研究涉及的在線平臺及軟件見表1。

1.2.3 多序列比對及系統(tǒng)進化樹構建。

通過DNAMAN 6.0將玉米與其他植物的Waxy蛋白進行多序列比對，分析其序列的同源性。通過MEGA 7.0構建玉米與其他植物的ZmWaxy蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹，對其進化關系進行分析。

2 結果與分析

2.1 玉米ZmWaxy蛋白理化性質及親疏水性預測

玉米ZmWaxy蛋白由碳、氫、氧、氮和硫5種元素組成，利用ORF finder和ProtParam在線分析工具分析其理化性質，其開放閱讀框在3 676 bp，原子總數(shù)為9 331，蛋白分子量為66.61 kD。預測中ZmWaxy蛋白的理論等電點為6.59，呈酸性。結合Protscale在線分析工具分析其親疏水性（圖1），ZmWaxy蛋白比較穩(wěn)定（不穩(wěn)定系數(shù)31.54），親水性較低（-0.144 7），脂溶指數(shù)83.78。

2.2 玉米ZmWaxy信號肽、跨膜結構域及保守結構域預測

采用SignalP 4.1在線平臺對玉米ZmWaxy蛋白的信號肽序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其不存在信號肽和剪切位點，由此推測，玉米ZmWaxy蛋白為非分泌型蛋白，直接在細胞質基質中起作用，并不參與蛋白質轉運任務。使用在線平臺TMHMM 2.0預測玉米ZmWaxy蛋白的跨膜結構域，結果如圖2所示，玉米ZmWaxy蛋白不存在跨膜結構域，也并未發(fā)現(xiàn)膜內的氨基酸序列，位于膜外，屬于非膜蛋白。

通過在線平臺NCBI中的CD Search和InterPro中的EBI數(shù)據(jù)庫預測ZmWaxy蛋白的保守結構域，結果如圖3所示。由圖3可知，ZmWaxy具有明顯GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白結構域，屬于糖基轉移酶GTB類型。

2.3 玉米ZmWaxy亞細胞定位及磷酸化、糖基化位點預測

通過在線平臺Cell-PLoc 2.0及Psort Prediction，對ZmWaxy蛋白進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)ZmWaxy蛋白主要定位于葉綠體中。

使用NetPhos3.1在線工具分析，發(fā)現(xiàn)ZmWaxy蛋白存在眾多磷酸化位點，預測結果如圖4所示，在系統(tǒng)設定的閾值之上，ZmWaxy含有Thr（蘇氨酸）位點16個、Ser（絲氨酸）位點20個，以及Tyr（酪氨酸）位點13個。同時使用NetOGlyc 4.0在線平臺預測得到12個ZmWaxy蛋白的糖基化位點，這暗示ZmWaxy蛋白在生物體中參與了復雜的蛋白質翻譯后修飾過程。

2.4 玉米ZmWaxy二級、三級結構預測

通過Expasy平臺的Coils工具分析ZmWaxy蛋白的卷曲螺旋結構，發(fā)現(xiàn)其有明顯的卷曲螺旋。使用PSIPRED和SOPMA平臺分析ZmWaxy蛋白的二級結構，結果如圖5，表明ZmWaxy蛋白以無規(guī)則卷曲（41.54%）的氨基酸殘基為主，伴有大量α-螺旋（36.29%）和少量β轉角（7.06%）。

通過同源建模軟件Phyre2對ZmWaxy蛋白的三維結構進行模型模擬，得到模板c3vufA.1（與ZmWaxy蛋白相似度最高），根據(jù)該模板對ZmWaxy蛋白進行同源建模，得到覆蓋度為88.80%的模型。利用PyMOL對ZmWaxy蛋白的三級結構進行三維建模模擬，并展示其同源建模結果，同時以二級結構標記顏色（圖6）。

2.5 玉米ZmWaxy與其他植物蛋白的多序列比對及系統(tǒng)進化樹構建

以ZmWaxy的蛋白序列為探針，搜尋并下載NCBI中與ZmWaxy蛋白相似性較高的序列，通過軟件 DNAMAN 對得到的玉米、小麥、高粱、谷子和水稻的Waxy蛋白序列進行比對（圖7），發(fā)現(xiàn)5種植物的Waxy蛋白序列比對的一致性為80.23%，氨基酸相似度較高，保守性高。這表明不同植物的Waxy蛋白序列相對保守。玉米、高粱、水稻和谷子都有其特有的GT5糖原合成酶保守結構域，而小麥有糖基轉移酶GTB型超家族保守結構域。通過軟件MEGA7.0（NJ法）構建5種植物Waxy蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖8），發(fā)現(xiàn)在進化關系中，玉米ZmWaxy蛋白與高粱親緣最近，再次為水稻和谷子，而與小麥進化關系最遠。

3 結論與討論

該研究通過現(xiàn)代生物信息學工具對玉米ZmWaxy基因及蛋白序列進行信號肽、跨膜結構域、保守結構域、理化特性以及蛋白高級結構、進化樹等特性進行分析。結果表明，該基因存在3 676 bp的開放讀碼框，編碼由609個氨基酸構成穩(wěn)定弱酸性親水蛋白，其分子量大小為66.61 kD。不含有信號肽結構和跨膜結構域，但擁有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結構域，其定位于葉綠體中，非膜蛋白，有可能在細胞質基質中起作用。其二級結構和三級結構以無規(guī)則卷曲為主，伴有大量α-螺旋和少量β轉角。進化關系中，玉米與高粱最近，次之為水稻和谷子，與小麥進化關系最遠。

磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、糖基化等是蛋白質翻譯后修飾的重要形式^［17-18］。玉米ZmWAXY蛋白具有12個糖基化修飾位點和49個磷酸化修飾位點。眾多的磷酸化修飾位點中包括unsp、cdc2、PKA、PKC、CK1、CK2等多個磷酸激酶作用位點。蛋白質磷酸化參與植物幾乎所有的生命過程，通過調節(jié)蛋白質的穩(wěn)定性、活性以及蛋白質之間的相互作用，在信號傳遞與信號轉導途徑中發(fā)揮著關鍵作用^［19-20］。而蛋白質糖基化為蛋白質打上不同標記，改變多肽的構象并增加蛋白質的穩(wěn)定性^［21-22］，在生物體內有著重要的生理意義，在細胞黏附、細胞增殖、細胞信號傳輸?shù)确矫嫫鹬匾饔谩Ｒ虼耍瑢mWaxy蛋白翻譯后修飾的進一步研究迫在眉睫，為甜糯玉米優(yōu)良糯性品質的分子機制的進一步揭示奠定基礎。

玉米ZmWaxy擁有典型的GT5-Glycogen-synthase-DULL-like蛋白保守結構域。GT5淀粉合成酶在葡糖基轉移酶11的催化下介導葡糖基轉移。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫，GT5屬于GTB超家族（http：∥www.cazy.org/），并且可以結合葡糖基供體（ADP-Glc）的保守氨基酸殘基，通常合并到淀粉合成酶的堿性催化區(qū)起作用^［20］。

王慧等^［22］利用Eco-TILLING分析糯玉米種質材料的Waxy基因序列變異情況，發(fā)現(xiàn)不同來源糯玉米種質糯質表現(xiàn)型在DNA序列上表現(xiàn)為 SNP、InDel 等不同類型的突變。丁敏等^［23］通過Waxy基因的1個 InDel 位點和移碼突變以及單堿基突變位點進行Waxy基因功能標記開發(fā)，利用開發(fā)的標記對山西省糜子資源進行基因分型，為糜子糯性品質育種提供了分子檢測工具。這對利用Waxy基因功能對糯玉米進行標記提供了新思路，為糯玉米分子育種提供了標記工具。

參考文獻

［1］ 陳瑞杰，劉東勝，孫招.玉米育種的現(xiàn)狀與發(fā)展方向［J］.花卉，2020（2）：294-295.

［2］ 郭慶瑞，郭鳳琴，殷建軍，等.雜交玉米新品種同玉008的選育及特性研究［J］.種子，2019，38（12）：122-124.

［3］ 彭楷，黃世歡，閉獻燦，等.10個鮮食糯玉米品種比較試驗研究［J］.農業(yè)研究與應用，2020，33（2）：6-12.

［4］ 李洪濤，許瀚元，祝慶，等.鮮食玉米新品種連花糯2號選育［J］.作物研究，2020，34（5）：476-479.

［5］ 范瑞，陳永欣，邢磊，等.14個鮮食甜糯玉米新組合產量相關性狀分析與品種篩選［J］.山西農業(yè)科學，2022，50（7）：945-953.

［6］ 宋旭東，喻俊杰，張振良，等.江蘇省鮮食糯玉米優(yōu)質高效生產技術［J］.大麥與谷類科學，2022，39（6）：55-59.

［7］ 袁文婭，趙曉雷，周旭梅，等.waxy基因功能標記開發(fā)及在糯玉米育種中的應用［J］.作物雜志，2020（4）：99-106.

［8］ 傅雪梅，陳發(fā)波.植物Waxy基因研究現(xiàn)狀及展望［J］.農業(yè)科技通訊，2014（6）：24-26.

［9］ ZHAI Z Y，LIU H，SHANKLIN J.Ectopic expression of OLEOSIN 1 and inactivation of GBSS1 have a synergistic effect on oil accumulation in plant leaves［J］.Plants，2021，10（3）：1-10.

［10］ 李春艷，張潤琪，付凱勇，等.小麥淀粉合成關鍵酶基因和相關蛋白表達對不同施磷量的響應［J］.麥類作物學報，2018，38（4）：401-409.

［11］ XU Z K，SONG L L，MING S X，et al.Removal of starch granule associated proteins affects annealing of normal and waxy maize starches［J］.Food hydrocolloids，2022（131）：1-8.

［12］ 張烈，李娜，崔如清，等.主要禾谷類作物糯質基因Waxy的系統(tǒng)進化及表達分析［J］.分子植物育種，2019，17（1）：14-20.

［13］ LIU F S，MAKHMOUDOVA A，LEE E A，et al.The amylose extender mutant of maize conditions novel protein protein interactions between starch biosynthetic enzymes in amyloplasts［J］.Journal of experimental botany，2009，60（15）：4423-4440.

［14］ GU X T，YANG S L，LI G H，et al.Starch morphological，structural，pasting，and thermal properties of waxy maize under different heat stress durations at grain formation stage［J］.Food and energy security，2022，11（2）：378-387.

［15］ 朱丹，曹漢威，李媛，等.植物蛋白磷酸化的檢測方法［J］.植物學報，2020，55（1）：76-82.

［16］ 趙曉亭，毛凱濤，徐佳慧，等.蛋白質磷酸化修飾與種子休眠及萌發(fā)調控［J］.植物學報，2021，56（4）：488-499.

［17］ 張世子，楊麗云，高靜，等.柱花草響應炭疽菌侵染的差異磷酸化蛋白質組學分析［J］.草地學報，2023，31（3）：699-709.

［18］ ZHOU Q F，MENG Q，TAN X M.Protein phosphorylation changes during systemic acquired resistance in Arabidopsis thaliana［J］.Frontiers in plant science，2021，12：1-16.

［19］ 付彬，梁宇穎，陸豪杰.離子遷移譜-質譜技術及其在蛋白質糖基化研究中的應用［J］.質譜學報，2022，43（5）：564-579.

［20］ 許英一，馬鑫蕊，徐艷霞，等.不同種類糖對燕麥蛋白糖基化產物功能性質及結構的影響［J］.中國油脂，2023，48（2）：48-54.

［21］ QU J Z，XU S T，ZHANG Z Q，et al.Evolutionary，structural and expression analysis of core genes involved in starch synthesis［J］.Scientific reports，2018，8（1）：1-16.

［22］ 王慧，于典司，施標，等.糯玉米種質waxy基因的Eco-TILLING分析［J］.分子植物育種，2017，15（4）：1177-1183.

［23］ 丁敏，段政勇，王宇卓，等.糜子GBSSI基因功能標記的開發(fā)與驗證［J］.作物學報，2023，49（3）：703-718.