生物有機肥施用對連作植煙土壤養分及微生物多樣性的影響

摘要 ［目的］解決烤煙生長連作障礙。［方法］通過2021—2023年生物有機肥定位試驗，研究連續3年生物有機肥施用對連作植煙土壤養分及微生多樣性的影響。［結果］連作種植下連續3年施用生物有機肥的植煙土壤pH及有機質呈上升趨勢，堿解氮含量降低，有效磷及速效鉀含量保持穩定。MiSeq高通量測序技術對植煙土壤細菌16S DNA V3～V4區域及真菌ITS ITS1 的檢測結果顯示，連作種植下隨著生物有機肥施用年限的增加，植煙土壤中的細菌及真菌OTUs數目、Chao1指數、香濃指數及物種數目呈增加趨勢。在門水平上，連作植煙土壤酸桿菌門（Acidobacteria）豐富度隨著生物有機肥施用年限的增加而增加，而擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度減少；植煙土壤生物有機肥施用1年，子囊菌門（Ascomycota）豐富度最高，連續施用2年擔子菌門（Basidiomycota）豐富度最高。［結論］生物有機肥能夠降低連作植煙土壤酸化狀況，提高土壤有機質含量，增加土壤微生物多樣性，對穩定土壤速效養分具有一定的作用，為解決煙區連作障礙提供一定的理論依據。

關鍵詞 生物有機肥；連作；植煙土壤；微生物多樣性

中圖分類號 S154.3" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Biological Organic Fertilizer Application on Soil Nutrients and Microbial Diversity of Continuous Cropping Tobacco

ZHANG Ben qiang， ZHANG Yang， LI Xi kun et al

（Shandong Tobacco Industrial Co.， Ltd .，Jinan，Shandong" 250014）

Abstract ［Objective］ To solve the continuous cropping obstacles of flue cured tobacco. ［Method］ Through the positioning test of biological organic fertilizer from 2021 to 2023， the effects of biological organic fertilizer application on soil nutrients and microbial diversity of continuous cropping tobacco were studied. ［Result］ The pH and organic matter of continuous cropping tobacco planting soil increased， the content of alkali hydrolyzable nitrogen decreased， and the content of available phosphorus and available potassium remained stable when biological organic fertilizer was applied continuously for 3 years. The detection results of bacterial 16S DNA V3"" V4 region and fungal ITS ITS1 in tobacco planting soil by MiSeq high throughput sequencing technology showed that the number of bacterial and fungal OTUs， Chao1 index， aroma index and species in tobacco planting soil increased with the increase of the application years of biological organic fertilizer under continuous cropping. At the phylum level， the abundance of Acidobacteria increased with the application of biological organic fertilizer， while the abundance of Bacteroidetes decreased; the richness of Ascomycota was the highest when the bio organic fertilizer was applied for one year， and that of Basidiomycota was the highest when the bio organic fertilizer was continuously applied for two years. ［Conclusion］ Bio organic fertilizer can reduce soil acidification， increase soil organic matter content， increase soil microbial diversity， play a certain role in stabilizing soil available nutrients， and provide a certain theoretical basis for solving continuous cropping obstacles under continuous cropping in tobacco areas.

Key words Biological organic fertilizer;Continuous cropping;Tobacco planting soil;Microbial diversity

基金項目 山東中煙工業有限責任公司科技項目““泰山”品牌導向型高端原料生產模式構建與示范”（202101001）。

作者簡介 張本強（1985—），男，山東濟寧人，農藝師，碩士，從事煙草栽培與調制研究。

*通信作者，農藝師，碩士，從事煙草栽培研究。

收稿日期 2024-04-16；修回日期 2024-05-16

烤煙作為我國的重要經濟作物之一，近年來，由于連作嚴重影響烤煙的生長及產量產值。輪作雖然一直成為烤煙種植推廣的重點，但由于部分煙區耕地資源限制及種植模式單一，部分煙區烤煙連作現象逐漸增加，嚴重制約了我國煙葉的可持續發展及土壤利用^［1-2］。

連作障礙導致土壤養分失調，土壤內在養分不平衡，抑制土壤的生化過程。對于連作障礙的產生主要是作物、微生物及土壤生態系統間的失調，其中土壤理化性質及微生物變化是導致連作障礙的重要原因^［3-5］。研究表明，連作破壞了植煙土壤微生物平衡，導致酶活性降低，土壤種群的多樣性及功能多樣性降低^［6-7］。作為土壤養分循環驅動者的微生物具有的生態功能性也降低^［8］。在有限的耕地資源及單一種植模式影響下，如何在烤煙連作種植情況下，打破傳統連作障礙成為烤煙種植的重要問題之一。生物有機肥作為一種兼顧微生物肥料及有機效應的肥料，在調節土壤養分及改善微生物群落結構方面具有一定作用^［9］。筆者在淄博煙區烤煙連作種植的基礎上，連續3年施用生物有機肥，旨在探究連續施用生物有機肥對連作植煙土壤養分及微生物群落多樣性的影響，為解決煙區因連作種植導致土壤連作障礙提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗點位于山東省淄博市沂源縣南魯山鎮流水村（118.198 652°E，36.284 265°N）。該地區地處暖溫帶，屬半濕潤、半干旱大陸性氣候，年平均氣溫在13 ℃左右，年降雨量650 mm，，無霜期為200 d左右。土壤類型為棕壤。

1.2 試驗材料

以2021年連作5年的煙田植煙根際土壤為材料，生物有機肥由ETS（天津）生物科技發展公司生產，N+P2O5+K2O≥8%；有機質≥20%；有效活菌數≥0.2 億/g。主栽品種為云煙97。

1.3 試驗設計

2021—2023年在煙田開展生物有機肥施用定位試驗，試驗區面積為667 m2，生物有機肥在每年3月土地翻耕前，將1 500 kg/hm2的生物有機肥均勻撒施土壤表面，然后翻耕耙均。分別于2021、2022及2023年11月采集土壤樣品，分別標記為C、B、A處理，生物有機肥測序（rbt1）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品采集及處理。

采用5點取樣法，并將5個點的樣品混合，放于無菌袋中，用冰盒帶回實驗室。過2 mm篩后，一部分土樣自然風干檢測土壤理化指標，另一部分土樣放置于-80 ℃的冰箱中檢測土壤微生物群落多樣性。

1.4.2 土壤理化性質檢測。

土壤pH、堿解氮、有效磷、有機質及速效鉀參照常規土壤農化分析進行測定。

1.4.3 土壤微生物多樣性檢測。

采集的土壤樣品由上海歐易生物醫學科技有限公司，基于IIIumina Hi Seq測序平臺進行微生物細菌及真菌高通量測序。

（1）根際土壤DNA提取與PCR擴增。

采用Magpure Soil DNA LQ Kit（Magen，廣東）進行土壤微生物DNA提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）檢測DNA的濃度及完整性。細菌通用引物16S V3～V4區引物（前端引物：343F-5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′；后端引物：798R-5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），真菌多樣性鑒定采用通用引物ITS ITS1區引物（前端引物：ITS1F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；后端引物：ITS2-5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。

（2）Illumina Miseq測序數據處理及比對。

原始數據為FASTQ格式。使用 Trimmomatic^［10］軟件對原始雙端序列進行去雜。去雜參數：檢測并截去模糊堿基N；并采用滑窗法檢查平均堿基質量，當質量低于20時，截取前面高質序列。去雜后的雙端序列利用 FLASH^［11］軟件進行。拼接參數：最小的overlap為10 bp，最大的Overlap為200 bp，最大錯配率為20%。為保證結果的準確性，進行精準去雜，去除含有模糊堿基（ambiguous）、單堿基高重復區（homologous）的序列以及長度過短的序列。精準去雜參數：去掉含有N堿基的序列，保留堿基質量分數Q20達到至少 75% 的序列。同時，利用UCHIME檢測并去除序列中的嵌合體序列。測序數據進行預處理生成優質序列之后，采用Vsearch^［12］ 軟件，根據序列的相似性，將序列歸為多個OTU。參數為序列相似度大于或等于97% 被歸為一個OTU單元。使用QIIME^［13］ 軟件包挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數據庫進行比對注釋。16S使用Silva（version132）數據庫比對，物種比對注釋使用 RDP classifier^［14］ 軟件，保留置信區間大于0.7的注釋結果。ITS使用Unite數據庫比對。物種比對注釋使用BLAST^［15］軟件。

1.5 數據分析

采用Excel 2007和SPSS 23.0軟件對試驗數據進行統計分析，應用t檢驗法對土壤微生物相對豐度進行差異顯著性檢驗，其他均應用最小顯著差數（LSDlt;0.05）法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

生物有機肥連續施用對烤煙根際土壤理化指標的影響見表1。由表1可知，土壤pH及有機質含量隨著生物有機肥施用年限的增加呈上升趨勢；土壤速效磷、速效鉀含量不同施肥年限間差異不顯著；堿解氮含量隨著生物有機肥施肥年限的增加而呈下降趨勢?？梢姡B續施用生物有機肥能夠減緩植煙土壤連作土壤酸化狀況，提高連作植煙土壤pH，減少土壤堿解氮含量，而土壤速效磷及速效鉀含量差異不顯著。

2.2 微生物多樣性檢測

2.2.1 OTUs分析。

對不同處理植煙土壤的tags數目及OTUs數目進行統計，結果見表2。由表2可知，細菌群落OTUs數目的大小為rbt1lt;Clt;Blt;A，真菌OTUs數目大小為Clt;rbt1lt;Blt;A。說明生物有機肥中的細菌OTUs數目小于施肥后的連作植煙土壤，而連續施用2年以上的連作植煙土壤真菌OTUs數目大于生物有機肥。與此同時，連作種植下隨著生物有機肥施用年限的增加，植煙土壤中的細菌及真菌OTUs數目呈增加的趨勢。

生物有機肥（rbt1）與連作試驗土壤（A、B、C）細菌群落共有243個OTUs，A特有318個OTUs，B特有143個OTUs，C特有211個OTUs，rbt1特有122個OTUs。分別占各自OTUs總數的14.18%、7.14%、10.69%、23.33%。生物有機肥（rbt1）與連作試驗土壤（A、B、C）真菌群落共有192個OTUs，A特有157個OTUs，B特有86個OTUs，C特有62個OTUs，rbt1特有110個OTUs。分別占各自OTUs總數的21.63%、13.29%、12.76%、22.18%（圖1）。

2.2.2 物種多樣性分析。

由表3可知，不同處理樣本的覆蓋率均在99%以上，可以比較準確地反映不同處理樣本的真實情況，施用生物有機肥后的植煙土壤（A、B、C）細菌及真菌的Chao1指數、香濃指數及物種數目均大于生物有機肥（rbt1），且呈現Agt;Bgt;C，說明連作種植下隨著生物有機肥施用年限的增加，植煙土壤微生物多樣性增加。

2.2.3 物種群落結構分析。

在門水平上，各個處理土壤樣本細菌群落主要分為25個門56綱129目137種230科399屬。對各個處理相對豐度前15的菌門進行統計，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及放線細菌（Actinobacteria）占總菌門數量的85%以上。植煙土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度呈Agt;Bgt;Cgt;rbt1，而酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度呈rbt1gt;Cgt;Bgt;A。說明連作植煙土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）隨著生物有機肥施用年限的增加而增加，而擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度減少。

真菌群落主要分為9個門30個綱124個科202個屬。真菌群落以子囊菌門（Ascomycota）及擔子菌門（Basidiomycota）為主，其中C處理子囊菌門豐富度最高，B處理擔子菌門（Basidiomycota）豐富度最高（圖2）。

3 討論

研究表明^［16-18］，產生連作障礙的原因較多，其中土壤堿解氮含量增加，有機質、有效磷及速效鉀含量降低以及土壤微生物結構失調是產生連作障礙的重要原因。因此，研究植煙土壤養分變化及微生物多樣性具有重要意義。連作極易導致土壤酸化，土壤速效養分增加，土壤養分流失比較嚴重^［19-21］。而該研究發現，在連作情況下，隨著生物有機肥施用年限的增加，土壤pH呈上升趨勢，有機質增加，堿解氮降低，其他速效養分基本保持不變或略有上升。為了追求高產，長期連作導致植煙土壤氮素含量積累，過多的氮素含量會降低烤根系脫氫酶活性，影響烤煙生長發育，對烤煙品質產生一定的影響。

生物有機肥中富含大量的有機質，有機質具有一定的保肥能力，有機質中所含有的腐殖質具有一定吸附陰、陽離子的作用^［22］，因此對于有效磷、速效鉀等速效養分具有一定的穩定作用。進一步說明植煙土壤在常年連作的情況下，生物有機肥能夠提高植煙土壤pH，增加有機質含量，穩定植煙土壤速效養分，減少養分流失。而且隨著生物有機肥施用年限的增加，效果更加明顯。

多樣性作為評價微生物群落的重要指標，多樣性指數越高則表明土壤微生物種類越豐富，植煙土壤越穩定^［23］。長期連作導致植煙土壤微生物群落結構被破壞，微生物多樣性降低，土壤的穩定性被打破^［2，24］。該研究中，在烤煙連作情況下，施用生物有機肥能夠提高連作植煙土壤中的細菌及真菌OTUs數目，植煙土壤微生物多樣性指數（Chao1指數、香濃指數、物種數目）也提高，且隨著生物有機肥施用年限的增加而增加。傳統烤煙種植多以有機肥配施化肥，而該研究以生物有機肥替代傳統的有機肥方式，生物有機肥不僅含有有機肥的功能，而且本身含有有益菌，隨著生物有機肥施用年限的不斷增加，植煙土壤中的外源有益菌也不斷增加，對于因連作導致微生物群落多樣性及結構的破壞具有一定的修復作用。因此，3年生物有機肥施用對于連作植煙土壤微生物多樣性提高具有一定的作用。

4 結論

連續3年生物有機肥施用能夠提高連作植煙土壤pH，減少酸化，促進土壤速效養分的釋放，提高土壤微生物多樣性，為煙區因耕地資源有限及烤煙單一種植模式而進行連作種植方式導致連作障礙提供了新的解決方法。

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