微生物發酵制備紅景天香原料及其特征成分分析

摘要 ［目的］利用釀酒酵母發酵制備紅景天香原料，并分析其特征成分。［方法］紅景天粉末經超聲提取、滅活、接種釀酒酵母種子液、發酵、一次醇提和過濾、二次醇提和過濾、濃縮等步驟得到天然香原料。建立UPLC-MS/MS方法對該香原料中紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素5種成分進行定量分析，探討釀酒酵母糖基轉移酶（UGT）在紅景天苷合成中的作用。［結果］制備所得紅景天香原料具有濃郁芳香氣味，與對照樣品相比，紅景天苷含量提高了14.8%，酪醇含量提高了11.7%，絡塞維、紅景天素、槲皮素含量增加不明顯。［結論］該研究利用微生物發酵技術結合化學成分檢測和qPCR技術，制備了安全穩定、活性成分含量較高的天然香原料，為其在食品添加劑、煙草、日化等領域的應用提供理論依據。

關鍵詞 微生物發酵；紅景天；UPLC-MS/MS；天然香原料；特征成分

中圖分類號 R284" 文獻標識碼 A" 文章編號 0517-6611（2025）03-0163-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Preparation of Rhodiola Perfume by Microbial Fermentation and Analysis of Its Characteristic Components

SONG Kai， LIU Chen， ZANG Zhi peng et al

（Technology Center， Gansu Tobacco Industry Co.， Ltd.， Lanzhou，Gansu 730050）

Abstract ［Objective］To prepare Rhodiola perfume by fermentation with Saccharomyces cerevisiae and analyze its characteristic components.［Method］Rhodiola powder underwent ultrasonic extraction， inactivation treatment， inoculation of Saccharomyces cerevisiae seed solution， fermentation， primary alcohol extraction and filtration， secondary alcohol extraction and filtration， concentration， and other steps to obtain natural aroma raw materials. UPLC MS/MS method was established to quantitatively analyze the five components of salidroside， tyrosol， rosavin， rhodiosin and quercetin in the raw materials. The role of Saccharomyces cerevisiae glycosyltransferase （UGT） in salidroside synthesis was investigated.［Result］The prepared Rhodiola rosea perfume had a strong aromatic aroma. Compared with the control sample， the content of salidroside increased by 14.8%， the tyrosol content increased by 11.7%， and the content of rosavin， rhodiosin and quercetin did not increase significantly.［Conclusion］The microbial fermentation technology combined with chemical composition detection and qPCR technology were used to prepare safe and stable natural aroma raw materials with high content of active ingredients， which provided theoretical basis for their application in food additives， tobacco， daily chemical and other fields.

Key words Microbial fermentation;Rhodiola;UPLC MS/MS;Natural perfume;Characteristic component

作者簡介 宋凱（1990—），女，甘肅蘭州人，工程師，碩士，從事分析化學研究。*通信作者，工程師，碩士，從事煙草微生物學、煙草化學研究。

收稿日期 2024-03-20

紅景天（Rhodiola）為景天屬多年生草本植物，具有抗疲勞、抗抑郁、抗衰老、抗氧化、抗輻射等藥用功能^［1-2］，其主要有效成分為苷類和黃酮類化合物^［3］。苷類化合物主要包括紅景天苷、酪醇、苯丙素類（洛塞琳、絡塞維、洛塞等）^{［4 -6］}。紅景天苷被認為是紅景天中最具藥用價值的功能性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肝纖維化等作用，其含量的高低通常作為評價紅景天藥效的重要因素^［7-8］。黃酮類化合物主要包括紅景天素、槲皮素以及它們的衍生物^［9］。目前紅景天理論研究主要集中于生物功能和藥理活性，應用研究主要集中于藥物、保健品、護膚品等方面^［10-14］，近年來因其提取物香氣豐富、香調獨特、抗氧化抗輻射等特點，應用領域逐漸擴展到煙草行業作為煙用添加劑使用^［15-16］。

紅景天香原料多為以化學方法制備的浸膏、精油、提取物、提取液、固體粉末等^［17］，工藝較復雜且有機試劑使用率較高。利用微生物技術制備紅景天香原料，同時將發酵產物中特征成分紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素作為關鍵指標進行檢測，以驗證發酵效果的研究鮮有報道。該研究結合相關文獻，建立了高效、高靈敏度和高選擇性的UPLC-MS/MS分析方法，對釀酒酵母發酵制備得到的紅景天香原料進行定量分析，并對釀酒酵母糖基轉移酶（UGT）在紅景天苷合成中的作用進行研究，為其在香精香料領域的應用提供了理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

紅景天苷（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；酪醇（純度≥98%，美國Sigma-Aldrich公司）；絡塞維（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；紅景天素（純度≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；槲皮素（純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；茶堿（純度≥98%，北京百靈威科技有限公司）；色譜級甲醇和乙腈（北京百靈威科技有限公司）；色譜級甲酸（北京百靈威科技有限公司）；市售紅景天藥材。水為實驗室自制一級水。菌株為釀酒酵母（保藏編號CICC No.1394）；培養基為PDA培養基。

1.2 儀器

Agilent 1290 UPLC- Ultivo三重四極桿質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-100E超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；QIAcube核酸提取儀（德國Qiagen有限公司）；Qubit熒光定量儀（美國Thermo Fisher Scientific科技公司）；qPCR儀（德國Qiagen有限公司）；離心機（德國Eppendorf股份公司）。

1.3 紅景天香原料的制備

1.3.1

紅景天溶液制備。紅景天藥材低溫（≤40 ℃）粉碎過篩，稱取1 g粉末與水、葡萄糖按質量比1∶20∶3混合均勻，溫度55 ℃、功率500 kW超聲提取60 min，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫得紅景天溶液。

1.3.2

釀酒酵母種子液制備。取釀酒酵母菌株接種于PDA固體培養基，30 ℃下培養5 d，形成釀酒酵母孢子；滅菌玻璃棒從平板上刮取孢子，無菌水稀釋，孢子懸浮液的OD600為1.0，得到釀酒酵母種子液，其中釀酒酵母的濃度為2.88×106 CFU/mL。

1.3.3

紅景天發酵液制備。將紅景天溶液接種釀酒酵母種子液，接種量為紅景天溶液體積的1%，發酵時間68 h，搖床轉速178 r/min，發酵溫度28 ℃，發酵后得到紅景天發酵液。

1.3.4 紅景天發酵液的提取及濃縮。

1.3.4.1

提取。上述所得紅景天發酵液與濃度為75%（V/V）的乙醇按照體積比1∶10混合，進行一次醇提；采用孔徑為60目的濾布過濾，10 000 r/min離心10 min，去除紅景天殘渣和釀酒酵母菌體后，發酵液與濃度為90%（V/V）的乙醇按1∶10比例混合，進行二次醇提，采用膜孔徑為200目的過濾膜進行過濾得到紅景天提取液。

1.3.4.2

濃縮。采用旋轉蒸餾真空減壓法濃縮，濃縮溫度30 ℃、真空度35 hPa，轉速75 r/min，將紅景天發酵提取液減壓濃縮至平均密度為1.20 g/mL，得紅景天香原料。

1.4 紅景天香原料特征成分分析

1.4.1 供試品溶液分析。取100 μL按照“1.3”制備的紅景天香原料，加入50 μL內標溶液，用甲醇稀釋至10 mL，0.22 μm有機相濾膜過濾待UPLC-MS/MS分析。

1.4.2

對照樣品分析。對照樣品為按照“1.3”步驟不發酵、同等工藝條件下制備的紅景天香原料。處理方式同“1.4.1”，0.22 μm有機相濾膜過濾待UPLC-MS/MS分析。

1.5 標準溶液制備

分別稱取紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素0.05 g（精確至0.1 mg）于100 mL容量瓶，甲醇溶解并定容作為標準儲備液。分別量取儲備液4、10、20、40、100、200、400、1 000、2 000 μL，加入內標茶堿溶液（0.1 mg/mL）500 μL，加甲醇定容至100 mL制得20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL紅景天系列標準溶液。標準溶液總離子流色譜圖如圖1所示。

1.6 檢測條件

1.6.1

色譜條件。色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）。流動相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為0.5%甲酸-甲醇溶液，梯度洗脫程序如表1所示；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL，進樣時間8 min。

1.6.2 質譜條件。離子源為AJS ESI源；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣體流速7.0 L/min；噴霧氣壓力206.84 kPa；鞘氣（N2）溫度325 ℃；鞘氣（N2）流速11.0 L/min；毛細管電壓3 500 V。掃描方式為MRM 模式，檢測方式為負離子檢測。5 種待測化合物及內標茶堿質譜參數見表2。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1

線性關系考察。將“1.5”中系列標準溶液按“1.6”條件分析，以樣品濃度與內標濃度比值為橫坐標、樣品峰面積與內標峰面積比值為縱坐標進行線性回歸，以信噪比（S/N）為3和10時的進樣濃度為檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。各組分的回歸方程、線性范圍、LOD和LOQ見表3。

2.1.2 精密度試驗。取“1.5”中濃度為2 000 ng/mL紅景天標準溶液，按“1.6”條件連續測定6次。以紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素的峰面積進行計算，其RSD分別為2.93%、2.05%、3.39%、1.55%、3.12%，表明精密度良好。

2.1.3 穩定性試驗。取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進樣，測定紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素的峰面積，計算其峰面積的RSD分別為2.88%、3.47%、2.55%、2.16%、1.32%，說明樣品在24 h內具有良好的穩定性。

2.1.4

重復性試驗。精密量取供試品溶液6份，取1 μL進樣，考察紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素的峰面積，計算其峰面積的RSD分別為2.64%、2.95%、1.60%、4.03%、2.71%，說明方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗。取各成分含量已知的樣品，分別按照紅景天苷、酪醇、絡塞維、紅景天素、槲皮素含量的80%、100%、120%加入不同體積的各標準品單一儲備液，按“1.6”條件測定，每個濃度水平測定3次，結果發現（表4），5種活性成分的加樣回收率為97.2%～106.2%，RSD為0.96%～3.48%，說明方法準確度較高。

2.2 樣品測定

按照“1.3”方法制備紅景天香原料（n=5），按照“1.4”和“1.6”進行檢測，由表5可知，微生物處理后的紅景天香原料樣品與未經微生物處理的紅景天樣品（對照樣品）相比較，紅景天苷含量提高了14.8%，酪醇含量提高了11.7%，絡塞維、紅景天素、槲皮素含量增加不明顯。樣品總離子流圖如圖2所示。

2.3 UGT在紅景天苷合成中的作用

紅景天苷是一種由其苷元酪醇與葡萄糖通過苷鍵結合而成的糖苷，紅景天苷生物合成途徑的最后一步反應已被證實是由糖基轉移酶（UGT）催化的，該酶將底物酪醇與尿苷二磷酸葡萄糖結合生成紅景天苷^［18-19］。酪醇可以通過釀酒酵母以酪氨酸為底物，經過轉氨脫羧反應合成^［20-21］。已有研究指出，UGT家族中的UGTC1、UGTC2和UGTR基因在紅景天苷的合成過程中發揮著重要作用^［22-23］。該研究利用qPCR技術測定與紅景天苷生物合成途徑相關基因的表達水平，結果顯示（圖3），釀酒酵母發酵后，UGTC1、UGTC2和UGTR基因的表達量均顯著增加，這表明釀酒酵母中過表達的UGTC1、UGTC2和UGTR基因編碼的酶能夠有效催化底物酪醇與葡萄糖合成紅景天苷，與發酵后樣品中紅景天苷含量增高這一結果相符合。

3 討論

現有文獻報道中，孫劍峰等^［24-25］利用黑曲霉菌發酵紅景天原藥材，提高了紅景天苷和酪醇的含量；吳捷等^［26］分離篩選出能將L-酪氨酸轉化成酪醇的酵母及乳酸菌菌株應用于紅景天，提高了紅景天苷和酪醇含量，且酪氨酸和紅景天苷的微生物轉化基于多酶反應，其中酪氨酸脫羧酶在連接反應中作為初級代謝和次級代謝之間的重要酶，影響反應的速度和進程。黃秋嵐^［27］對釀酒酵母體內酪醇合成量、酪醇轉化率2個方面進行了研究，提高了紅景天苷合成量。這些結果表明微生物發酵技術在提高紅景天苷和酪醇含量方面具有顯著效果。

上述研究主要采用高效液相色譜（HPLC）法進行定量分析，檢測成分僅限于紅景天苷和酪醇。但已有文獻報道釀酒酵母可被設計用于高水平合成槲皮素^［28］，提示多成分檢測有利于深入挖掘和應用釀酒酵母的生物功能。該研究結合現有文獻^［29-31］，解決了HPLC方法檢測靈敏度低、檢測時間長、目標化合物較少等問題^［32-33］，優化了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）^［34-35］方法，通過各成分的特征離子檢測，排除微生物發酵復雜基質中雜質的干擾。該方法穩定高效，明顯提高了可靠性、專屬性和靈敏度。這一方法為紅景天香原料質量評價提供了方法基礎和技術支持，通過適當的樣品前處理，適用于紅景天提取物、精油、浸膏等不同類型樣品的多成分分析。

該研究化學檢測結果表明，紅景天苷含量提高了14.8%，酪醇含量提高了11.7%，槲皮素含量也有增加。qPCR結果表明，釀酒酵母發酵后UGTC1、UGTC2和UGTR基因的表達量顯著增加，與紅景天苷含量的增加相一致，表明釀酒酵母中的UGT基因在紅景天苷的生物合成中發揮了關鍵作用，催化酪醇與葡萄糖合成紅景天苷。該研究結果為進一步優化紅景天苷的生物合成途徑提供了重要信息。通過調控UGT基因的表達和代謝途徑提高紅景天苷的產量，對于紅景天苷的工業化生產也具有重要意義。

4 結論

該研究通過微生物發酵技術制備了紅景天香原料，提高了其關鍵活性成分含量。該香原料具有香氣協調、香味豐富飽滿、來源天然、制備周期短、綠色環保、穩定可控等優點，同時結合化學檢測技術及微生物技術，為進一步揭示釀酒酵母發酵紅景天的機理提供理論支撐，也為新型香原料在煙用添加劑領域的應用提供參考。

參考文獻

［1］ CAI L，WANG H，LI Q，et al.Salidroside inhibits H2O2 induced apoptosis in PC12 cells by preventing cytochromec release and inactivating of caspase cascade［J］.Acta biochimica et biophysica sinica，2008，40（9）：796-802.

［2］ 王愛玲，曲瑋，梁敬鈺.紅景天屬植物化學成分及藥理作用研究進展［J］.海峽藥學，2014，26（1）：1-8.

［3］ 張佳琦.紅景天中紅景天苷的提取及化學合成［D］.天津：天津科技大學，2018.

［4］ 何寶佳，魏蔚.不同產地紅景天中紅景天苷提取工藝研究［J］.通化師范學院學報，2013，34（10）：42-43.

［5］ 王曙，張曙光，徐小平，等.4 種紅景天屬植物根莖中Rosavin和紅景天苷的含量測定［J］.華西藥學雜志，2002，17（6）：443-444.

［6］ 張慧云.玫瑰紅景天中絡塞維的純化及抗疲勞特性研究［D］.無錫：江南大學，2013.

［7］ 周思思.紅景天中有效成分的分離純化、鑒定及活性研究［D］.廣州：華南理工大學，2018.

［8］ 杜玫，謝家敏.云南大花紅景天化學成分研究［J］.化學學報，1994（9）：927-931.

［9］ 劉長姣.紅景天總黃酮超高壓提取工藝及其粗提物生物活性的研究［D］.長春：吉林大學，2007.

［10］ 李維衛，胡鳳祖，陳世龍，等.青藏高原紅景天藥材的HPLC指紋圖譜［J］.西北植物學報，2004，24（9）：1744-1747.

［11］ 何寶佳，魏蔚，鄭友蘭.紅景天藥材指紋圖譜的研究［J］.寧夏大學學報（自然科學版），2013，34（3）：254-258.

［12］ 遲曉峰，矯曉麗，董琦，等.青藏高原紅景天屬植物藥材中五種有效成分HPLC分析［J］.天然產物研究與開發，2012，24（10）：1343-1347.

［13］ 劉孟華，李沛波，蘇薇薇.紅景天化學成分及其藥理作用研究進展［J］.中南藥學，2006，4（6）：463-466.

［14］ 李教社，王軍憲，張晉秀，等.小叢紅景天化學成分的研究［J］.西安醫科大學學報：中文版，1997，18（3）：368-370.

［15］ 譚燁，呂品，潘婷婷.紅景天提取物及其作為煙草制品添加劑的用途：CN200910062791.X［P］.2010-12-29.

［16］ 何金星，代家紅，尹康德.含有紅景天的卷煙紙：CN201010131764.6［P］.2010-08-18.

［17］ 程中琴，劉小妹，施崇精，等.紅景天作為新型固體香料的可行性研究［J］.廣州化工，2017，45（16）：13-14.

［18］ GRECH BARAN M，SYKOWSKA BARANEK K，PIETROSIUK A.Biotechnological approaches to enhance salidroside，rosin and its derivatives production in selected Rhodiola spp.in vitro cultures［J］.Phytochem Rev，2015，14（4）：657-674.

［19］ LIU X，DING W T，JIANG H F.Engineering microbial cell factories for the production of plant natural products：From design principles to industrial scale production［J］.Microb Cell Fact，2017，16（1）：1-9.

［20］ SENTHESHANMUGANATHAN S，ELSDEN S R.The mechanism of the formation of tyrosol by Saccharomyces cerevisiae［J］.Biochem J，1958，69（2）：210-218.

［21］ TORRENS SPENCE M P，PLUSKAL T，LI F S，et al.Complete pathway elucidation and heterologous reconstitution of Rhodiola salidroside biosynthesis［J］.Molecular Plant，2018，11（1）：205-217.

［22］ 薛飛燕，楊明峰，馬蘭青.微生物法合成紅景天苷［J］.生物工程學報，2019，35（7）：1184-1192.

［23］ 于寒松.紅景天糖基轉移酶家族基因克隆、鑒定及轉基因發根系統的建立［D］.長春：吉林大學，2008.

［24］ 孫劍峰，劉玉應，宋偉舟，等.紅景天發酵提高紅景天苷含量的研究［J］.四川大學學報（自然科學版），2009，46（4）：1171-1175.

［25］ 宋偉舟，孫劍峰，劉玉應，等.雙菌株協同發酵提高紅景天中苷和酪醇含量的研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（1）：156-159.

［26］ 吳捷，吳傳超，顧秋亞，等.紅景天有效成分微生物發酵高值化轉化［J］.食品與發酵工業，2019，45（9）：29-34.

［27］ 黃秋嵐.利用釀酒酵母生產紅景天苷的初步探索［D］.濟南：山東大學，2020.

［28］ 李玲玲，劉雪，邱澤天，等.植物多酚的微生物合成［J］.生物工程學報，2021，37（6）：2050-2076.

［29］ 關瀟瀅，王鐵杰，李軍，等.HPLC法同時測定大株紅景天中紅景天苷、酪醇和沒食子酸的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27（5）：377-380.

［30］ 林夏，胡軍華，崔培超，等.HPLC同時測定大花紅景天提取物中沒食子酸、紅景天苷、酪醇、對香豆酸的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（10）：102-105.

［31］ 馬小冬，李占強，蘇姍姍，等.UHPLC測定唐古特紅景天根中 5 種酚類成分的含量［J］.中藥材，2017，40（8）：1895-1897.

［32］ 姚慧，劉小花，陳心悅，等.UPLC-ESI-MS法測定貞芪扶正膠囊中毛蕊異黃酮- 7-O-β-D- 葡萄糖苷、紅景天苷和黃芪甲苷的含量［J］.分析測試技術與儀器，2016，22（4）：204-208.

［33］ 文檢，趙彩云，唐策，等.UPLC測定大花紅景天中 5 種化學成分的含量［J］.中草藥，2018，41（1）：151-154.

［34］ 于然，陳亮，王曉杰.UHPLC MS-QQQ同時測定紅景天中 4 種有效活性成分研究［J］.中國食品添加劑，2019（8）：154-157.

［35］ 支旭然，郭彩會，劉洪濤，等.UPLC-MS/MS法測定大株紅景天注射液中紅景天苷和酪醇的含量［J］.中國臨床藥理學雜志，2019，35（13）：1378-1380.