CLIC1對膠質母細胞瘤細胞系凋亡影響的實驗研究

【摘要】 目的 研究CLIC1對膠質母細胞瘤（GBM）細胞系U251、T98凋亡的影響。方法 根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析CLIC1相關臨床表達差異、生存曲線等。設計兩條慢病毒序列，穩(wěn)定敲低U251、T98細胞系中CLIC1表達。平板克隆形成實驗、CCK8細胞增殖實驗評估對照組、敲低組GBM細胞增殖能力。使用流式檢測對照組、敲低組細胞凋亡率。使用免疫熒光、Western Blot檢測對照組、敲低組凋亡相關蛋白變化。裸鼠異種移植模型建立，觀察CLIC1對裸鼠顱內腫瘤生長的影響、腫瘤大小、凋亡及增殖蛋白染色強度，Western Blot檢測鼠腦凋亡蛋白表達量。結果 泛癌分析表明，CLIC1在廣泛腫瘤中較正常組織高表達，包括膠質瘤，且在膠質瘤中CLIC1表達隨級別呈遞增趨勢，高表達CLIC1的患者整體生存期縮短。敲低CLIC1可抑制GBM細胞克隆形成，降低細胞活力，且能增加GBM細胞系凋亡率，增加凋亡蛋白BAX、Cleaved-Caspase3表達，減少抗凋亡蛋白BCL2表達。體內實驗結果表明，CLIC1在維持腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。結論 敲低CLIC1可抑制GBM細胞增殖，促進GBM細胞凋亡和延緩顱內進展。

【關鍵詞】 膠質母細胞瘤；氯離子胞內通道 1；細胞凋亡

【中圖分類號】 R739.41" 【文獻標志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2025）01-0047-08

Experimental study on the effect of CLIC1 on apoptosis in glioblastoma cell lines

Abstract： Objective To investigate the effect of CLIC1 on apoptosis in glioblastoma（GBM） cell lines U251 and T98. Methods The clinical expression differences and survival curves related to CLIC1 were analyzed using data from The Cancer Genome Atlas（TCGA） database. Two lentiviral sequences were designed to stably knock down CLIC1 expression in U251 and T98 cell lines. A plate clone formation assay and CCK-8 cell proliferation assay were conducted to evaluate the proliferation ability of GBM cells in control and knockdown groups. The apoptosis rate in these groups was assessed via flow cytometry. Immunofluorescence and Western blotting were employed to detect changes in apoptosis-related protein expression. A nude mouse xenograft model was established to study the impact of CLIC1 on intracranial tumor growth. The tumor size， the intensity of apoptotic and proliferative protein expression were observed. Western blotting was used to detect apoptotic protein expression in the mouse brain." Results Pan-cancer analysis revealed that CLIC1 was significantly overexpressed in various tumors， including gliomas， compared to normal tissues. In gliomas， CLIC1 expression increased with tumor grade， and high CLIC1 expression correlated with shorter overall survival in patients. Knockdown of CLIC1 inhibited GBM cell clone formation， reduced cell viability， and increased the apoptosis rate. Additionally， knockdown enhanced the" expression of pro-apoptotic proteins BAX and Cleaved-Caspase3， while decreasing the anti-apoptotic protein BCL2. In vivo experiments demonstrated that CLIC1 played a critical role in sustaining tumor"progression. Conclusions Knockdown of CLIC1 inhibits GBM cell proliferation， promotes GBM cell apoptosis， and delays intracranial progression.

Key words： glioblastoma; CLIC1; cell apoptosis

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，大約每10萬人中有4人患病，可占全部原發(fā)惡性中樞系統(tǒng)腫瘤的50%［1］。GBM具有高病死率、高致殘率、高復發(fā)率，GBM患者目前采用的標準治療方案是以手術治療為主，術后輔以放化療［2］。目前最常用的化療方案是熟知的Stupp方案，但是對于O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）未甲基化的GBM患者，整體生存率并沒有明顯的延長［1］。目前，正在積極尋找更加有效的化療藥物來延長患者生存期。胞內氯離子通道1（chlo-ride intracellular channel 1，CLIC1）是豐富的細胞內陰離子通道蛋白，參與細胞內多種功能，包括膜電位調節(jié)、細胞體積穩(wěn)態(tài)、鹽酸分泌和攝取的控制等［3］。現(xiàn)有研究表明，CLIC1參與調節(jié)細胞周期、細胞增殖、凋亡、腫瘤侵襲遷移等［45］，CLIC1對GBM細胞凋亡的影響研究尚少，本文主要研究CLIC1對膠質瘤細胞系凋亡相關指標的影響，為日后靶向化療藥物的研究提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫樣本分析 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.com） 獲得了33種腫瘤的RNAseq數(shù)據(jù)和相應的臨床信息。使用R軟件V4.0.3進行統(tǒng)計分析。秩和檢驗檢測兩組數(shù)據(jù)的差異，Plt;0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.2 生存分析 從TCGA數(shù)據(jù)集（https：//portal.gdc.com）獲得膠質瘤的RNAseq數(shù)據(jù)和相應的臨床信息。GTEx數(shù)據(jù)來自V8版本（https：//gtexportal.org/home/datasets）。使用R軟件v4.0.3進行統(tǒng)計分析。Plt;0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.3 基因集富集分析 為了探索CLIC1潛在的生物學功能，針對TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質瘤樣本CLIC1的表達水平，分為CLIC1高表達、低表達組，并對所有CLIC1差異基因進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.4 研究對象 GBM細胞系U251、T98購自上海細胞庫，液氮凍存。CLIC1、BAX、BCL2、Cleaved-Caspase3、內參Tubulin和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG以及山羊抗兔IgG抗體均購買于美國CST公司。DMEM培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清購買于美國Gibco公司。

1.5 平板克隆形成實驗 將不同分組的U251、T98細胞消化、重懸、計數(shù)，將600個細胞鋪于6孔板中，每組至少重復三遍，每孔加入2 mL培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2周，每隔3天更換一次培養(yǎng)基。2周后，棄上清液，4%細胞多聚甲醛固定30 min后，結晶紫染色5～10 min。拍照獲取圖像，Image J定量分析。

1.6 CCK8細胞增殖實驗 將3 000個U251、T98細胞接種在96孔板中，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入10% CCK8試劑，充分混勻，避光孵育2 h，在450 nm波長處測量每個孔的光密度（optical density，OD）值，根據(jù)吸光度值的變化來評估細胞的增殖。

1.7 細胞培養(yǎng) 采用10%的胎牛血清于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)U251、T98細胞。當細胞融合度達到70%左右，棄上清液，使用細胞磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）輕輕緩慢沖洗培養(yǎng)皿中殘留血清，然后用胰蛋白酶消化細胞5 min，加入等量10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞于離心管中離心、重懸傳代。

1.8 慢病毒轉染 由吉凱基因設計并構建的shRNA慢病毒，序列：shCLIC1#1∶5′CUUCAAUGU-UACCACCGUU-3′；shCLIC1#2∶5′GUGGAUGAA-ACCAGUGCUG-3′將適量慢病毒加入細胞培養(yǎng)皿中過夜，用0.5%嘌呤霉素（Puromycin）進行篩選，待細胞篩選穩(wěn)定后，Western Blot檢測其敲低效率。

1.9 Western Blot檢測相關蛋白表達 提取不同處理組的細胞總蛋白，離心后獲取上清液。使用BCA比色法測定蛋白濃度，并配置成相同濃度后，加入上樣緩沖液，混勻，在100 ℃下變性5 min。設置電壓為70 V進行電泳，待上層膠分離后，將電壓增加至140 V直至電泳結束。在冰浴條件下，以恒定電流350 mA轉膜45～90 min。轉膜后，將膜置于5％牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液中，室溫下在慢搖床上封閉1 h。加入稀釋比例為1∶2 000的對應抗體（兔抗Tubulin、兔抗BAX、兔抗Cleaved-Caspase3、兔抗CLIC1、鼠抗BCL2），在4 ℃下緩慢孵育過夜（至少8 h）。隨后在快搖床上洗滌3次，每次5～10 min。再加入相應二抗，室溫下在慢搖床上孵育1 h，再次洗滌3次后顯影，并使用軟件進行量化分析。

1.10 免疫熒光染色檢測BCL2、Cleaved-Caspase3的表達 將賴氨酸包被的無菌玻片置于12孔板底部，加入適量處理組的U251和T98細胞，充分混勻后培養(yǎng)至貼壁。當細胞達到約70%融合度時，棄去上清液，使用PBS緩沖液洗滌3次。隨后，用4%多聚甲醛固定細胞25 min，再用0.5% Triton X-100進行15 min穿膜處理，隨后再用PBS洗滌3次。接著加入3%BSA，在室溫下封閉1 h。棄去上清液，洗滌3次后待玻片干燥，加入稀釋后的抗體：小鼠抗人BCL2（1∶200）和兔抗人Cleaved-Caspase3（1∶200），在4 ℃環(huán)境下孵育過夜（至少8 h）。之后，用PBS洗滌3次，每次5 min。再加入熒光標記的二抗（山羊抗兔1∶200，山羊抗小鼠1∶200），室溫避光條件下孵育1 h。最后，用DAPI溶液染色細胞核，避光條件下使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.11 流式凋亡檢測 使用適量胰蛋白酶消化不同處理組的U251和T98細胞，離心收集后用PBS清洗3次。加入100 μL檢測緩沖液重懸細胞，依次加入10 μL FITC標記的Annexin-V和5 μL PI，避光反應10 min后，再加入400 μL檢測緩沖液，并在15 min內進行檢測。

1.12 染色 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin eosin，HE）時，將鼠腦進行固定，石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染色，伊紅染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色時，準備石蠟組織切片，首先對切片進行去蠟和水化，將切片浸泡在二甲苯中以去除石蠟，再通過不同濃度的乙醇進行水化，最后用蒸餾水清洗。接著，通過熱修復或酶修復處理切片，暴露抗原位點。然后，用過氧化氫溶液處理切片，抑制內源性過氧化氫酶活性，并使用封閉液封閉非特異性結合位點。隨即，將切片與稀釋的一抗孵育，通常在4 ℃過夜或室溫孵育1～2 h，之后用PBS緩沖液洗滌切片以去除未結合的一抗。接著，將切片與稀釋的二抗孵育，通常在室溫下孵育30～60 min，隨后再次用PBS洗滌切片。染色反應通過加入DAB顯色底物完成，目標抗原在切片中形成棕色沉淀，顯色時間需嚴格控制，以免過度染色。染色結束后，用蘇木精進行對比染色，隨后依次通過不同濃度的乙醇進行脫水，并用二甲苯透明化。最后，使用封片劑將切片封片，待固化后在顯微鏡下觀察染色結果，分析目標抗原的表達情況。

1.13 裸鼠顱內成瘤 將轉有熒光病毒的CLIC1敲低和未敲低的U251細胞進行裸鼠顱內原位移植，分別在第7、14、28天進行小動物活體成像分析，觀察腫瘤進展，待裸鼠自然死亡后，繪制生存曲線，取出鼠腦固定，切片，進行HE、IHC染色，觀察腫瘤大小及凋亡相關蛋白染色強度，并研磨敲低組和未敲低組鼠腦組織，進行Western Blot實驗，檢測凋亡相關蛋白表達量。

1.14 統(tǒng)計學分析 使用Image J軟件對實驗獲得的WB數(shù)據(jù)進行量化，并用GraphPad Prism9軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 CLIC1泛癌分析 對TCGA數(shù)據(jù)庫中33例癌癥樣本中所采集的數(shù)據(jù)分析顯示，以TCGA+GTEx數(shù)據(jù)庫正常的對應組織做對照，除了急性髓細胞樣白血病（acute myeloid leukemia-like，LAML）、惡性間皮瘤（malignant mesothelioma，MESO）、嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）、肉瘤樣肺癌（sarcoma like lung cancer，SARC）、胸腺癌（thymic carcinoma，THYM）、葡萄膜惡性黑色素瘤（uveal melanoma，UVM）外，CLIC1在其他腫瘤的表達水平均高于正常對照組（P＜0.05）。在GBM中，CLIC1的表達明顯高于正常腦組織（P＜0.000 1），表明CLIC1可能參與膠質瘤惡性進展（圖1）。

2.2 CLIC1在腦膠質瘤中的表達及生存分析 對TCGA數(shù)據(jù)庫中采集膠質瘤相關數(shù)據(jù)，并進行分析。結果顯示，CLIC1在膠質瘤各級別中表達量均高于正常腦組織，且在膠質瘤中CLIC1表達量隨著級別呈遞增趨勢（圖2A）。生存分析表明，在膠質瘤患者中，高表達CLIC1的患者中位生存期呈明顯下降趨勢（圖2B）。

2.3 敲低CLIC1對GBM細胞增殖能力的影響為了研究CLIC1對GBM細胞增殖能力的影響，設計了兩條慢病毒序列。Western Blot實驗驗證其敲低效率（圖3A），平板克隆形成實驗表明，U251、T98細胞在六孔板中培養(yǎng)14 d后，細胞增殖能力明顯高于sh-1、sh-2組（圖3B），CCK-8細胞增殖實驗表明，敲低組U251、T98細胞增殖曲線較未敲低組平坦，同樣說明了敲低組細胞增殖能力下降（圖3C）。這表明，下調CLIC1表達可抑制GBM細胞增殖能力。

2.4 CLIC1對GBM細胞凋亡的影響 本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質瘤患者的轉錄組數(shù)據(jù)篩選出與CLIC1高度相關的3 249個差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），其中1 915個上調基因、1 334個下調基因（圖4A），然后對CLIC1差異表達基因進行GSEA分析，結果表明，膠質瘤中的CLIC1相關基因在凋亡通路中富集（圖4B）。為了進一步證明CLIC1參與GBM細胞凋亡，本研究通過流式細胞術檢測對照組和敲低組GBM細胞凋亡率的變化，結果表明，敲低組的GBM細胞凋亡率明顯增加（圖4C）。本研究用免疫熒光染色技術檢測相關凋亡蛋白表達，結果表明敲低組的凋亡蛋白Cleaved-Caspase3熒光強度增加，而抗凋亡蛋白BCL2熒光強度下降（圖4D）。這表明，敲低組的GBM細胞發(fā)生了促凋亡作用。為了進一步驗證，本研究對不同處理組的細胞進行凋亡相關蛋白免疫印跡分析，并進行定量分析。結果表明，促凋亡蛋白BAX、Cleaved-Caspase3增加，抗凋亡蛋白BCL2減少（圖4E）。以上表明，CLIC1敲低促進了GBM細胞系U251、T98發(fā)生了凋亡。

2.5 CLIC1對裸鼠顱內腫瘤生長的影響 為了驗證CLIC1對裸鼠顱內成瘤的影響，本研究將轉有熒光病毒的CLIC1敲低和未敲低的U251細胞進行裸鼠顱內原位移植，分別于第7、14、28天進行小動物活體成像分析，動態(tài)觀察腫瘤大小。待裸鼠自然死亡后，取出鼠腦進行HE染色觀察腫瘤大小。結果表明，敲低組裸鼠顱內腫瘤生長較對照組緩慢（圖5A），對熒光值進行統(tǒng)計分析，結果表明從第14天開始具有統(tǒng)計學意義（圖5B）。對小鼠生存時間繪制生存曲線，結果表明，敲低組小鼠生存時間明顯延長且具有統(tǒng)計學意義（圖5C）。HE染色結果表明，敲低組小鼠腫瘤明顯小于對照組，對鼠腦切片進行IHC染色分析，結果表明，敲低組促凋亡指標Cleaved-Caspase3染色強度增高，抗凋亡指標BCL2染色強度降低，增殖指標Ki-67染色強度降低（圖5D）。為了進一步分析CLIC1對體內腫瘤的凋亡作用，本研究對裸鼠腦組織進行研磨，提取總蛋白進行Western Blot實驗分析，結果顯示，敲低組抗凋亡指標BCL2蛋白表達量下降，促凋亡指標BAX、Cleaved-Caspase3蛋白表達量升高（圖5E），這與細胞實驗結果相符。以上結果表明，CLIC1參與膠質瘤的惡性進展。

3 討 論

膠質瘤目前的治療方案，仍以手術為主，術后輔以放化療［6］。由于替莫唑胺耐藥的原因，導致膠質瘤患者生存期并沒有得到較大的延長［7］。基于對膠質瘤發(fā)生、發(fā)展機制的較好認識和理解，靶向治療已經初見成效。目前，F(xiàn)DA已經批準了近百種具有治療作用的抗體，其中有近1/3可用于癌癥治療［8］。例如，抗VEGF單克隆抗體之一的貝伐單抗，已被廣泛用于膠質瘤術后靶向治療［9］，以及被廣泛用于治療黑色素、肺癌、頭頸癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌的人源化抗體pembrolizumab ［1012］。本研究以CLIC1為基礎，研究CLIC1對膠質瘤細胞凋亡的影響，希望建立一個新的精準靶點。

CLIC1是由241個氨基酸構成的離子通道蛋白［13］，CLIC1在小腸、胃、膽管、胰腺等人體正常組織中皆有表達［14］。研究表明，CLIC1可通過激活MAPK信號通路促進胃癌進展［15］，以及參與胃癌淋巴轉移、淋巴浸潤等［16］，F(xiàn)eng等［17］證實了CLIC1可通過整合素/ERK通路促進口腔鱗癌進展，Tian等［18］證實了CLIC1通過MAPK/ERK信號通路促進前列腺癌轉移，以及Nong等［19］證實了CLIC1通過影響自噬賦予胃癌耐藥性，以上表明CLIC1可通過影響多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移、自噬等功能參與腫瘤進展。最近發(fā)表的一篇多組學分析表明，CLIC1參與神經膠質瘤的進展，抑制CLIC1可誘導神經膠質瘤凋亡［20］。因此，本文主要針對CLIC1對GBM細胞系凋亡影響展開分析。

本研究通過泛癌分析結果得出，CLIC1在絕大多數(shù)腫瘤中是高表達的，其中就包括膠質瘤。通過TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進一步分析可知，CLIC1不僅在膠質瘤中高表達，且CLIC1表達量隨著膠質瘤級別遞增而增加。生存分析結果表明，高表達CLIC1的患者，生存時間縮短。同時，GSEA富集分析結果表明，CLIC1差異相關基因在凋亡通路中富集。基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析結果，本研究假設敲低CLIC1可能會影響膠質瘤細胞表型。結果表明，敲低CLIC1可明顯抑制GBM細胞增殖，通過流式細胞凋亡分析、免疫熒光染色以及Western Blot技術分析可知，敲低CLIC1促進GBM細胞系U251、T98發(fā)生凋亡，并且促進了凋亡相關蛋白Bax、Cleaved-Caspase3的表達，抑制抗凋亡蛋白BCL2的表達。體內實驗結果表明，敲低CLIC1延緩裸鼠顱內腫瘤進展，且明顯延長了裸鼠生存時間，HE染色結果顯示，敲低組鼠腦腫瘤明顯小于對照組，IHC染色結果顯示，敲低組Cleaved-Caspase3染色強度增高，BCL2、Ki-67染色強度降低，對裸鼠腦組織進行Western Blot分析，結果與細胞實驗結果相符。

雖然，本研究的初步結果證實了CLIC1參與GBM惡性進展的可能，但是針對CLIC1如何影響GBM細胞凋亡的具體過程并沒有展開具體的研究。希望在日后的研究中，能針對CLIC1影響GBM凋亡的具體過程展開詳細敘述。

綜上可知，CLIC1在膠質瘤中高表達，參與膠質瘤惡性進展，敲低CLIC1可促進GBM細胞系U251、T98發(fā)生凋亡，延緩進展。

［參 "考 ""文 ""獻］

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