基于轉(zhuǎn)錄組學探討歐前胡素改善乳腺癌多柔比星耐藥的機制

中圖分類號 R965；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0529-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.04

摘要 目的 研究歐前胡素（IMP）對乳腺癌多柔比星（DOX）耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及可能機制。方法 采用MTT法考察IMP最大無毒質(zhì)量濃度（100 μg/mL）與DOX不同質(zhì)量濃度（12.5、25、50、75、100 μg/mL）聯(lián)用對MCF-7/DOX細胞增殖的影響；將MCF-7/DOX細胞分為空白對照組（1‰ 二甲基亞砜）、DOX 組（50 μg/mL）、IMP+DOX 組（100 μg/mL IMP+50 μg/mL DOX）和IMP 組（100μg/mL），檢測各組細胞中多藥耐藥蛋白1（MDR1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1 的mRNA及其蛋白表達水平；采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析篩選IMP改善乳腺癌DOX耐藥相關(guān)的通路和靶點，并進行驗證。結(jié)果 與單用DOX 比較，IMP 與DOX 聯(lián)用后，DOX 對MCF-7/DOX 細胞的半數(shù)抑制濃度從81.965 μg/mL 下降至43.170 μg/mL，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.90；且聯(lián)用可顯著下調(diào)MDR1 的mRNA表達（P＜0.05）。GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，IMP逆轉(zhuǎn)乳腺癌DOX耐藥主要與調(diào)節(jié)解毒、多生物過程、細胞殺傷等生物過程有關(guān)，主要涉及p53 信號通路，關(guān)鍵靶點為組成型光形態(tài)建成蛋白1（COP1）、細胞周期蛋白E1（CCNE1）、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白45A（GADD45A）及GADD45B。驗證實驗結(jié)果顯示，與DOX組比較，IMP+DOX 組細胞中COP1 的mRNA表達有上調(diào)趨勢，但CCNE1、GADD45A及GADD45B的mRNA 表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 IMP 逆轉(zhuǎn)乳腺癌DOX 耐藥的作用可能與調(diào)控p53 信號通路中COP1、CCNE1、GADD45A及GADD45B的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 歐前胡素；乳腺癌；多柔比星耐藥；轉(zhuǎn)錄組學；p53 信號通路

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為全球女性癌癥死亡的主要原因[1]。目前，對乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放療、化療等。多柔比星（doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類抗生素，對乳腺癌以及多種惡性腫瘤有效，是臨床應(yīng)用廣泛的抗癌化療藥。然而，部分患者在經(jīng)DOX 治療后會出現(xiàn)耐藥性，使其應(yīng)用受到限制[2]。因此，尋找化療增敏劑、改善乳腺癌耐藥是亟待解決的關(guān)鍵問題。

歐前胡素（imperatorin，IMP）是一種天然的呋喃香豆素，存在于白芷、大戟和當歸根等多種中藥中，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和保護心血管等多種藥理作用[3]。近年來，IMP 作為潛在的抗癌藥物引起了人們的關(guān)注。IMP 可抑制肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種不同腫瘤細胞的生長，其作用機制主要包括抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移，誘導腫瘤細胞凋亡、自噬和阻滯腫瘤細胞周期[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，IMP 可拮抗藥物外排蛋白的功能[4]，增強DOX、紫杉醇、吉西他濱等化療藥物對腫瘤耐藥細胞的細胞毒作用[5―6]，靶向髓樣細胞白血病蛋白1（myeloidcell leukemia-1，MCL-1）逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對順鉑的耐藥性[7]，靶向MCL-1 促進非特異性免疫T 淋巴細胞誘導CD 133+肺癌細胞凋亡[8]。上述研究提示，IMP具有抑制多種腫瘤細胞耐藥的作用，然而關(guān)于其對乳腺癌DOX耐藥是否有逆轉(zhuǎn)作用尚不明確。因此，本研究以人乳腺癌DOX耐藥株MCF-7/DOX為研究對象，考察IMP對乳腺癌DOX耐藥的影響，通過轉(zhuǎn)錄組學篩選IMP 對乳腺癌DOX耐藥的關(guān)鍵靶點，分析IMP 改善乳腺癌DOX耐藥的生物學途徑及相關(guān)信號通路，并對關(guān)鍵靶點進行驗證，旨在為闡明IMP 緩解乳腺癌DOX耐藥的作用及可能機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括SpectraMax Plus384 型全波長酶標儀（美國Molecular Devices 公司），T100TMThermal Cycler 型PCR 儀、CFX96TM 型Real-Time PCR儀、Mini-PROTEAN?Tetra Cell 型電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），MI52-N型倒置生物顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司），WJ-Ⅲ型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

IMP 對照品（批號PS000723，純度＞98.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司；鹽酸DOX原料藥（批號827G033，純度≥99%）購自北京索萊寶科技有限公司；MTT試劑（批號EZ7890B104）購自德國BioFroxx 公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（批號分別為AM91949A、AM62046A、AMF1769A）均購自日本Takara公司；兔源多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrugresistance-associated protein 1，MRP1）單克隆抗體（批號Ab260038）購自英國Abcam 公司；鼠源多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）單克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為sc-55510、sc-47778）均購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗（批號分別為H681481011、H681006001）均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；MEM培養(yǎng)基（批號MA0217-Nov-08H）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號A121028）購自美國Gemini 公司；RIPA 裂解緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒及顯影定影試劑盒（批號分別為112023240207、070721211202、022823230802、042420201023）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞

人乳腺癌耐DOX細胞株MCF-7/DOX 購自中國科學院細胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

參考文獻[9]方法培養(yǎng)MCF-7/DOX細胞。

2.2 IMP對MCF-7/DOX細胞活力的影響

參考文獻[9]方法，采用MTT 法考察12.5、25、50、100、200 μg/mL 的IMP 對MCF-7/DOX 細胞活力的影響，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個復孔；以含1‰二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基為空白對照。藥物作用48 h 后，采用酶標儀于492 nm 波長處檢測各孔光密度（optical density，OD）值并計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝藥物孔OD 值/空白對照孔OD 值×100%。采用GraphPadPrism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；符合正態(tài)分布的定量資料以x±s 表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，進一步組間兩兩比較采用Tukey 檢驗；檢驗水準α＝0.05。結(jié)果見圖1。

由圖1 可知，與空白對照比較，200 μg/mL 的IMP可顯著降低MCF-7/DOX 細胞存活率（P＜0.05），而12.5～100 μg/mL 的IMP 對該細胞存活率無明顯影響（P＞0.05）。因此，本研究選用100 μg/mL 作為最大無毒質(zhì)量濃度繼續(xù)后續(xù)實驗。

2.3 IMP與DOX聯(lián)用對MCF-7/DOX細胞增殖的影響

將細胞以8 000 個/孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加藥。細胞分為空白對照組、DOX不同質(zhì)量濃度組、IMP（100 μg/mL）+DOX不同質(zhì)量濃度組，每組設(shè)置6 個復孔。根據(jù)本課題組前期研究[9]將DOX質(zhì)量濃度設(shè)定為12.5、25、50、75、100 μg/mL，空白對照組加入1.5‰DMSO。藥物作用48 h 后，采用MTT法測定各孔OD值，計算細胞增殖抑制率，并計算藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（reverse fold，RF）。細胞增殖抑制率（%）＝（空白對照組OD值－藥物組OD值）/空白對照組OD 值×100%；RF＝DOX 單用組IC50/IMP 和DOX 聯(lián)用組IC50。結(jié)果顯示，DOX不同質(zhì)量濃度組、IMP+DOX不同質(zhì)量濃度組細胞的增殖均受到不同程度影響，且細胞增殖抑制率隨著DOX質(zhì)量濃度的升高而升高。DOX單獨使用時，其對MCF-7/DOX細胞的IC50為81.965 μg/mL；DOX 和IMP 聯(lián)用時，其對細胞的IC50 下降為43.170μg/mL，RF為1.90。

2.4 IMP與DOX聯(lián)用對MCF-7/DOX細胞耐藥相關(guān)基因表達的影響

參考文獻[9]方法，將MCF-7/DOX細胞以1×105個/皿的密度接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，隨機分為空白對照組（1‰DMSO）、DOX 組（50 μg/mL）、IMP+DOX 組（100 μg/mL IMP+50 μg/mL DOX）和IMP組（100 μg/mL），每組設(shè)置6 個復孔。藥物作用48 h 后，按照Trizol 試劑盒說明書方法提取細胞中總RNA，并對其進行純度和質(zhì)量檢驗。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板采用熒光定量PCR儀進行擴增[引物序列由本課題組自行設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1]。PCR反應(yīng)體系（20 μL）如下：cDNA 模板2 μL，PCR 試劑10 μL，正、反向引物各1 μL，dd H2O 6 μL。擴增條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用雙標準曲線法計算目的基因MDR1、MRP1 的相對表達量，并以空白對照組為參照進行歸一化處理。按“2.2”項下方法進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果（表2）顯示，與空白對照組比較，DOX組、IMP+DOX組細胞中MDR1、MRP1 的mRNA以及IMP 組細胞中MDR1 的mRNA表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）；與DOX 組比較，IMP+DOX 組細胞中MDR1 的mRNA表達進一步下調(diào)（P＜0.05）。

2.5 IMP與DOX聯(lián)用對MCF-7/DOX細胞耐藥相關(guān)蛋白表達的影響

細胞接種、分組和加藥同“2.4”項下。藥物作用48 h后，提取細胞中總蛋白，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，100 ℃下加熱6 min 進行蛋白變性。取10 μg 蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳（100 V 恒壓）分離，電泳結(jié)束后，在90 V恒壓下轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用5% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h；加入MDR1（稀釋比例1∶500）、MRP1（稀釋比例1∶1 500）、β-actin（稀釋比例1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜；以PBST 漂洗，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1∶20 000）、山羊抗小鼠二抗（稀釋比例1∶10 000），室溫孵育1 h；以PBST 再次漂洗，利用ECL 發(fā)光液顯影，采用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，并以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平（結(jié)果以空白對照組為參照進行歸一化處理）。按“2.2”項下方法進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果（表2、圖2）顯示，與空白對照組比較，IMP+DOX 組細胞中MDR1、MRP1 蛋白及IMP 組細胞中MDR1 蛋白的表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）。

2.6 轉(zhuǎn)錄組學實驗篩選IMP 逆轉(zhuǎn)乳腺癌DOX耐藥的關(guān)鍵靶點

2.6.1 RNA測序及cDNA文庫構(gòu)建

細胞接種、分組和加藥同“2.4”項下。藥物作用48 h后，每組收集3 個樣本，快速凍存于液氮中，采用干冰保存運輸至北京百邁客生物科技有限公司進行RNA 測序，并通過PCR富集得到cDNA文庫。將轉(zhuǎn)錄組測序所得的“Raw Data”過濾，得到“Clean Data”，并將后者與指定的參考基因組進行序列比對，得到“Mapped Data”，然后通過插入片段長度檢測、隨機性檢驗等進行cDNA文庫質(zhì)量評估。

2.6.2 生物信息學分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄本在各樣本中的表達量進行差異表達分析：采用DESeq2_EBSeq 軟件篩選差異表達基因（differentiallyexpressed genes，DEGs），篩選標準為錯誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.01 且︱log2FC︱≥2[式中，F(xiàn)C 為差異倍數(shù)（fold change）][10]。采用R 包cluster‐Profiler 對DEGs進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，通過CytoScape 3.7.2軟件將結(jié)果進行可視化展示。

DEGs 分析結(jié)果（圖3）顯示，與空白對照組比較，DOX 組細胞中上調(diào)基因1 134 個，下調(diào)基因91 個；與DOX組比較，IMP+DOX組細胞中上調(diào)基因641 個，下調(diào)基因998 個。

GO富集分析結(jié)果表明，所有DEGs 被注釋到60 個功能類別中，包括24 個生物過程、19 個細胞組分、17 個分子功能，詳見表3（該表僅列出了每個功能類別的前10項）。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，與空白對照組比較，DOX組細胞中有500 個DEGs，涉及核糖體、溶酶體、抗原加工和呈遞、吞噬體以及p53 信號通路等270 條信號通路；與DOX 組比較，IMP+DOX 組細胞中有514 個DEGs，涉及叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）以及p53 等271 條信號通路。選取排前20 名的信號通路繪制可視化氣泡圖，詳見圖4。由圖4可知，在空白對照組和DOX組、DOX組和IMP+DOX組DEGs 富集得到的前20 條信號通路中，p53 信號通路為二者共有，因此，本研究進一步對與p53 信號通路相關(guān)的DEGs進行可視化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組和DOX組、DOX組和IMP+DOX組之間存在共同的DEGs，分別為COP1、CCNE1、GADD45A和GADD45B。

2.7 關(guān)鍵靶點的基因表達驗證

采用熒光定量PCR 實驗驗證組成型光形態(tài)建成蛋白1（constitutively photomorphogenic 1，COP1）、細胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白45A（growth arrest and DNA damage inducibleprotein 45A，GADD45A）、GADD45B等關(guān)鍵靶點的基因表達情況。其引物序列及產(chǎn)物長度見表1，具體測定方法同“2.4”項下，數(shù)據(jù)分析方法同“2.2”項下。

結(jié)果（表4）顯示，與空白對照組比較，DOX組細胞中COP1 的mRNA 表達顯著下調(diào)（P＜0.05），CCNE1、GADD45B 的mRNA 表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；IMP+DOX 組細胞中COP1、CCNE1、GADD45A、GADD45B的mRNA 表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）；IMP 組細胞中COP1 的mRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05）。與DOX組比較，IMP+DOX 組細胞中COP1 的mRNA 表達呈上調(diào)趨勢，但CCNE1、GADD45A、GADD45B 的mRNA 表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

DOX屬于蒽環(huán)類抗生素，是臨床乳腺癌治療的常用一線化療藥物，但部分乳腺癌患者對蒽環(huán)類抗生素具有耐藥性，限制了該類藥物的臨床使用。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（如MDR1 和MRP1 等）高表達是腫瘤細胞耐藥的主要原因，其可外排抗腫瘤藥物，減弱抗腫瘤藥物的細胞毒作用[11]。一些中藥單體成分如香豆素類化合物、黃酮類化合物可通過作用于MDR1 和MRP1 來增強蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤作用[12]。現(xiàn)有研究顯示，IMP 不論單獨使用還是與蒽環(huán)類藥物聯(lián)用均可下調(diào)MDR1 表達，抑制MDR1 介導的藥物外排，逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥[5]。本研究結(jié)果顯示，IMP 可增強乳腺癌MCF-7/DOX 細胞對DOX的敏感性，且IMP 與DOX 聯(lián)用可協(xié)同降低細胞中MDR1、MRP1 的mRNA及其蛋白表達水平，逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX細胞的DOX耐藥。

研究表明，p53 是一種重要的腫瘤抑制因子，其被激活后可調(diào)控細胞周期阻滯、DNA修復、細胞凋亡等多種生物學過程，從而抑制腫瘤細胞的生長或惡性轉(zhuǎn)化[13]。已有研究證實，IMP 可通過調(diào)節(jié)p53 信號通路和胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)來誘導腫瘤細胞凋亡[14]。本研究選擇p53信號通路進行DEGs的KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組和DOX組、DOX組和IMP+DOX 組之間存在4 種共同的DEGs，分別為COP1、CCNE1、GADD45A和GADD45B。COP1 具有E3 泛素連接酶活性，其在乳腺癌中呈雙重作用——在雌激素受體α陽性乳腺癌患者中高表達，誘導細胞增殖；而在三陰性乳腺癌患者中低表達，導致他莫昔芬耐藥[15]。CCNE1 是細胞周期進程中的重要調(diào)控因子。研究顯示，CCNE1 在人乳腺癌帕博西尼耐藥細胞MCF7-palR 和T47D-palR 中高表達，沉默CCNE1 基因可恢復乳腺癌耐藥細胞對帕博西尼的敏感性[16]。GADD45 是DNA損傷修復的關(guān)鍵基因，GADD45表達水平的高低對不同類型腫瘤細胞的耐藥性會產(chǎn)生不同的影響。有研究顯示，上調(diào)伊馬替尼耐藥株人慢性髓系白血病細胞K562IR 中GADD45A 的表達，可增強其對伊馬替尼的敏感性[17]；而高水平的GADD45B可增強前列腺癌細胞對化療藥物的敏感性[18]。也有研究認為，下調(diào)GADD45A的表達可增強黑色素瘤細胞對順鉑的敏感性[19]，下調(diào)GADD45B的表達可提高人肺腺癌細胞PC-9 對吉非替尼的敏感性[20]。本研究結(jié)果顯示，IMP可通過調(diào)節(jié)p53 信號通路，作用于COP1、CCNE1、GADD45A及GADD45B靶點，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)乳腺癌DOX耐藥作用。

綜上所述，IMP 聯(lián)合DOX可增強MCF-7/DOX細胞對DOX 的敏感性，抑制細胞增殖，協(xié)同降低細胞中MDR1、MRP1 的mRNA及其蛋白表達水平。IMP 改善MCF-7/DOX細胞DOX耐藥的作用機制與調(diào)控p53 信號通路中COP1、CCNE1、GADD45A及GADD45B 的表達有關(guān)。

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（收稿日期：2024-08-26 修回日期：2025-02-17）

（編輯：林靜）

基金項目國家自然科學基金項目（No.82060733）；江西省衛(wèi)生健康委科研課題（No.202311141）；江西科技師范大學創(chuàng)新訓練項目（No.XJ202411318115）；江西中醫(yī)藥大學校級課題（No.jzyjg-2023-07）