菊花水提物改善大鼠缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的作用及機制

中圖分類號 R965；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0535-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.05

摘要 目的 研究菊花水提物對大鼠缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的改善作用及機制。方法 將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、三磷酸腺苷組（10 mg/kg）和菊花水提物高、低劑量組（1.08、0.54 g/kg）。除假手術組外，其余各組大鼠均采用大腦中動脈栓塞法復制缺血性腦卒中模型。術后第1 天，各組大鼠灌胃相應藥物/生理鹽水，每日1 次，連續7 d。術后第7 天，測定大鼠體重并進行運動功能（包括Longa 評分、運動距離和握力）評價；檢測大鼠骨骼肌電生理信號；觀察大鼠比目魚肌病理形態；檢測大鼠血清和比目魚肌中腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；檢測大鼠比目魚肌中TNF-α/c-Jun 氨基末端激酶（JNK）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路相關蛋白表達水平。結果 與假手術組比較，模型組大鼠體重、握力、運動距離均顯著減小/縮短（P＜0.01）；骨骼肌電生理峰間值顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；Longa 評分、血清和比目魚肌中TNF-α水平以及比目魚肌中TNF-α、磷酸化JNK、磷酸化MAPK、肌肉環指蛋白1、肌萎縮蛋白Fbox-1 的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；比目魚肌的骨骼肌細胞明顯萎縮，橫截面積顯著減小（P＜0.01）。與模型組比較，菊花水提物各劑量組上述指標水平均顯著逆轉（P＜0.05 或P＜0.01），比目魚肌的骨骼肌細胞明顯增大。結論 菊花水提物可改善大鼠缺血性腦卒中后的骨骼肌萎縮，其作用機制可能與抑制TNF-α/JNK/MAPK信號通路的激活有關。

關鍵詞 菊花；水提物；缺血性腦卒中；骨骼肌萎縮；TNF-α/JNK/MAPK信號通路

缺血性腦卒中作為一種嚴重威脅人類健康的腦血管疾病，具有高發病率和高致死率的特點，此外還可導致患者運動功能障礙，進而引發骨骼肌萎縮等一系列繼發性問題[1]。盡管各國或地區機構的現行指南推薦了抗炎、抗氧化、營養支持和神經保護等干預缺血性腦卒中的措施，但仍缺乏療效確切的藥物干預手段。

侯氏黑散首載于《金匱要略·中風歷節病脈證并治五》，具有治大風、四肢煩重的功效[2]。菊花作為該經典方劑的君藥，在方中用量遠超其他藥味。本課題組前期研究發現，菊花水提物對缺血性腦卒中模型大鼠繼發性的骨骼肌萎縮具有顯著改善作用[3]，然而，其具體作用機制尚未得到深入闡釋。

研究表明，缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的發生與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的激活密切相關，TNF-α作為炎癥過程中的關鍵細胞因子，參與了炎癥反應的發生與擴散；缺血性腦卒中發生后，TNF-α與骨骼肌細胞膜上的TNF-α受體結合[4]，從而激活JNK/MAPK信號通路，進而促進肌肉環指蛋白1（muscle ring-finger protein-1，MuRF-1）和肌萎縮蛋白Fbox-1（Atrogin-1）等骨骼肌萎縮相關分子的表達[5]，最終導致肌肉損傷。基于此，本研究擬基于TNF-α/JNK/MAPK信號通路進一步研究菊花水提物對大鼠缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的改善作用及機制，以期為菊花在臨床用于缺血性腦卒中提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Cubis?Ⅱ型電子天平（德國Sartorius 公司）、Varioskan Flash 型全波長多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、RM6240XC 型多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠）、RFSLI ZW/RFLS Ⅲ型激光散斑系統（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司）、Pannoramic SCAN Ⅱ型病理切片掃描儀（山東斯瑞締醫療科技有限公司）、ChemiDoc 型免染型化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

菊花購自中國北京同仁堂（集團）有限責任公司，經成都中醫藥大學中藥資源與鑒定系周濤副教授鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat. 的干燥頭狀花序。Zoletil 50（批號BN8LXLA）購自法國Virbac 公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）購自廣州白云山醫藥集團股份有限公司；TNF-α 試劑盒（批號MM-0180R1）購自江蘇酶免實業有限公司；膠原酶Ⅱ、兔抗大鼠TNF-α抗體（批號分別為40508ES76、AF8208）均購自上海碧云天生物技術股份有限公司；兔抗大鼠JNK、磷酸化JNK（p-JNK）抗體（批號分別為A4867、AP1337）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗大鼠MAPK、磷酸化MAPK（p-MAPK）抗體（批號分別為8690T、4511T）均購自美國CST 公司；兔抗大鼠MuRF-1抗體（批號55456-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗大鼠Atrogin-1、黏著斑蛋白（Vinculin）抗體（批號分別為T58766S、T40106）均購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（批號BA1055）購自武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠（SPF 級，6～8 周齡，體重220～250 g）購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（北京）2019-0010。所有動物在實驗開始前，適應性飼養7 d。飼養環境保持恒定溫度（22～25 ℃）和濕度（40%～60%），并實施12 h 光照與12 h 黑暗交替飼養。本實驗中的動物護理與使用嚴格遵循成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會制定的《動物護理與使用指南》，并已獲得該委員會的倫理批準，批準編號為2024054。

2 方法

2.1 菊花水提物的制備

將250 g 菊花用高速粉碎機粉碎，過10 目篩，棄去殘渣。參考本課題組前期研究方法提取：按照1∶500（g/mL）的料液比加入純水，超聲處理30 min，然后在60 ℃恒溫下冷凝回流提取3 次；合并所有提取液，在60 ℃恒溫下減壓濃縮至250 mL，經冷凍干燥后得到菊花凍干粉25 g（得率為10%，采用高效液相色譜法檢測其中綠原酸、木犀草素、異綠原酸含量分別為2.5、1.0、1.5 mg/g）。臨用時用蒸餾水溶解，備用。

2.2 動物分組、造模與給藥

將45 只SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、模型組、ATP組（陽性對照，10 mg/kg，劑量根據臨床等效劑量換算）、菊花水提物高劑量組（1.08 g/kg，以生藥量計，劑量參考文獻[6―7]設置）和菊花水提物低劑量組（0.54g/kg，以生藥量計，劑量參考文獻[6―7]設置），每組9 只。采用大腦中動脈栓塞法復制缺血性腦卒中模型，造模過程如下[8]：對大鼠注射Zoletil 50（1 mL/kg）進行麻醉，然后將其仰臥固定于手術板上，在其頸部正中線，從喉結至胸骨處切開2.5～4 cm 的皮膚切口；通過其左側頸總動脈小心插入帶有圓形尖端的尼龍線（直徑0.26 mm），沿頸內動脈推進約18～20 mm，以阻塞大腦中動脈，誘導局灶性腦缺血；縫合創口后，在縫合處涂抹碘伏消毒，并注射慶大霉素和青霉素以防止感染。Sham 組大鼠僅暴露血管但不插入尼龍線。術后第1 天，各組大鼠灌胃相應藥物/生理鹽水，每日1 次，連續7 d。在整個過程中，使用激光散斑系統對大鼠梗死側的腦灌注情況進行監測，若造模大鼠出現明顯缺血現象且肢體狀態穩定，則表明造模成功。

2.3 大鼠體重和運動功能評價

術后第7 天，測定大鼠體重，并采用Longa 評分法評估大鼠的神經功能損傷：0 分，無神經功能缺損；1 分，不能完全伸展對側前肢；2 分，行走時向對側轉圈；3 分，行走時向對側傾倒；4 分，無法自主行走，意識喪失[8]。隨后，使用小動物跑步機（刺激電流強度為1.50 mA、跑道速度為10 m/min）評估5 min 內大鼠運動距離。待大鼠休息30 min 后，采用握力儀檢測其四肢握力（測試時，操作者以恒定速度將大鼠向后拉，使其抓緊握力儀的拉環，確保動物體位與儀器平行）。各組取5 只大鼠參加檢測，每只大鼠檢測3 次，取平均值。

2.4 大鼠骨骼肌電生理檢測

術后第1、3、5、7 天，將大鼠水平固定，使其后肢懸空，使用針狀電極刺入患側后肢骨骼肌組織內，施加刺激電流，獲得響應電信號振幅，測量波峰－波谷差值（即峰間值），以評估骨骼肌組織對電刺激的反應。各組取3只大鼠參加檢測，每只大鼠檢測3次，取平均值。

2.5 大鼠比目魚肌病理形態學觀察

末次行為學檢測后，麻醉大鼠，剝離其皮膚和肌肉組織，暴露并分離比目魚肌。取各組大鼠比目魚肌適量，固定于4% 多聚甲醛溶液中72 h，脫水后包埋在石蠟中，切成3 μm薄片，脫蠟后按HE 試劑盒說明書染色。封片后，于顯微鏡下觀察并拍照，采用病理切片掃描儀分析骨骼肌細胞橫截面積。

2.6 大鼠血清和比目魚肌中TNF-α 水平的檢測

對大鼠剝離比目魚肌后，再對其腹主動脈取血，待全血室溫靜置30 min 后，以3 500 r/min 離心15 min，收集血清，置于－80 ℃保存備用。取大鼠比目魚肌50mg，加入200 μL組織勻漿緩沖液，勻漿后以2 500 r/min離心20 min，收集上清液。按照試劑盒說明書方法測定大鼠血清和比目魚肌中TNF-α水平。各組分別取4 只大鼠的血清和比目魚肌進行檢測。

2.7 大鼠比目魚肌中TNF-α/JNK/MAPK 信號通路相關蛋白表達水平的檢測

各組分別取4 只大鼠的比目魚肌50 mg，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜，加入5% 牛血清白蛋白，室溫封閉2 h；加入TNF-α（稀釋度為1∶1 000）、JNK（稀釋度為1∶2 000）、p-JNK（稀釋度為1∶2 000）、MAPK（稀釋度為1∶1 000）、p-MAPK（稀釋度為1∶1 000）、MuRF-1（稀釋度為1∶5 000）、Atrogin-1（稀釋度為1∶2 000）、Vinculin（稀釋度為1∶3 000）一抗，4 ℃孵育過夜；以TBST洗膜5 次，每次30 min，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h；以TBST 洗膜后，使用ECL試劑盒顯影，再使用Image Lab 3.0 軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白Vinculin 的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平，然后以Sham 組為標準進行歸一化處理。

2.8 統計學分析

使用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的數據以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 或Tamhane’s T2 檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 菊花水提物對大鼠體重及運動功能的影響

與Sham 組比較，模型組大鼠體重、握力、運動距離均顯著減小/縮短（P＜0.01），Longa 評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，ATP組和菊花水提物各劑量組大鼠體重、握力、運動距離均顯著增大/增長（P＜0.05 或P＜0.01），Longa評分顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

3.2 菊花水提物對大鼠骨骼肌電生理的影響

與Sham組比較，模型組大鼠第1、3、5、7 天的骨骼肌電生理峰間值均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組比較，ATP 組（第1 天除外）和菊花水提物各劑量組大鼠第1、3、5、7 天的骨骼肌電生理峰間值均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

3.3 菊花水提物對大鼠比目魚肌病理形態學的影響

與Sham 組[ 骨骼肌細胞橫截面積為（2 361.71±158.35）μm2]比較，模型組大鼠比目魚肌的骨骼肌細胞明顯萎縮，橫截面積[（1 397.40±66.36）μm2]顯著減小（P＜0.01）。與模型組比較，ATP 組和菊花水提物高、低劑量組大鼠比目魚肌的骨骼肌細胞明顯增大，橫截面積[分別為（1 769.83±120.24）、（1 933.24±140.01）、（2 017.26±164.95）μm2]顯著增大（P＜0.01）。結果見圖1。

3.4 菊花水提物對大鼠血清和比目魚肌中TNF-α 水平的影響

與Sham 組比較，模型組大鼠血清和比目魚肌中TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，ATP組和菊花水提物各劑量組大鼠血清和比目魚肌中TNF-α水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

3.5 菊花水提物對大鼠比目魚肌中TNF-α/JNK/MAPK信號通路相關蛋白表達水平的影響

與Sham 組比較，模型組大鼠比目魚肌中TNF-α、p-JNK、p-MAPK、MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，ATP組大鼠比目魚肌中p-JNK、MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），菊花水提物各劑量組大鼠比目魚肌中TNF- α、p-JNK、p-MAPK、MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見圖2、表4。

4 討論

菊花在傳統中醫藥中被廣泛應用，具有清熱明目、疏散風熱等功效，常作為解表藥使用。《神農本草經》將菊花列為上品，記載菊花有“輕身耐老延年”的功效[9]，提示菊花對運動系統可能具有積極影響。現代藥理學研究表明，菊花水提物具有抗炎、抗氧化和神經保護等多種生物活性，且對腦卒中及其繼發癥具有潛在作用[10―11]。本研究結果顯示，經菊花水提物干預后，大鼠握力和運動距離均增大/增長，Longa 評分降低，提示菊花水提物對缺血性腦卒中后大鼠的運動功能具有改善作用。

腦卒中后，中樞神經系統受損引起血腦屏障破壞，從而誘發系統性炎癥并導致骨骼肌損傷[12]。TNF-α在腦卒中患者及動物模型中均顯著升高，其可通過循環系統促進外周炎癥，從而加速骨骼肌萎縮[13―14]。臨床上，營養支持[15]與抗炎治療[16―17]已被證實可改善腦卒中患者的肌力和日常活動能力，這也間接說明炎癥在骨骼肌萎縮過程中具有重要影響。本研究結果顯示，經菊花水提物干預后，大鼠血清和比目魚肌中TNF-α水平均降低；進一步實驗證實，比目魚肌中TNF-α蛋白表達水平也降低，這提示菊花水提物可能通過阻斷TNF-α表達，發揮改善缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的作用。

JNK/MAPK 信號通路是TNF-α誘發骨骼肌萎縮的關鍵環節[4]。JNK、MAPK的磷酸化會激活泛素-蛋白酶體途徑，使MuRF-1 和Atrogin-1 蛋白表達上調，加速肌肉蛋白降解，從而導致骨骼肌萎縮[5]。本研究結果顯示，經菊花水提物干預后，大鼠比目魚肌中p-JNK、p-MAPK、MuRF-1、Atrogin-1 蛋白表達水平均降低，這提示菊花水提物可能通過抑制TNF-α/JNK/MAPK 信號通路活性，發揮改善缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮的作用。

本研究參考侯氏黑散方及臨床報道中菊花生藥的常規用量，分別設置了高、低兩個劑量，其中高劑量約為臨床用量的4 倍，低劑量約為臨床用量的2 倍。在該劑量范圍內，菊花水提物對缺血性腦卒中后骨骼肌萎縮雖呈現一定的改善作用，但并未觀察到明確的劑量-效應關系，推測其原因可能與既定的劑量跨度有限有關，有待后續實驗進一步研究。

綜上所述，菊花水提物可改善大鼠缺血性腦卒中后的骨骼肌萎縮，其作用機制可能與抑制TNF- α/JNK/MAPK信號通路的激活有關。

參考文獻

[ 1 ] QI H，TIAN D，LUAN F，et al. Pathophysiologicalchanges of muscle after ischemic stroke：a secondary consequenceof stroke injury[J]. Neural Regen Res，2024，19（4）：737-746.

[ 2 ] 丁元慶，陳哲，唐賽雪. 《金匱要略》對中風研究的貢獻與影響[J]. 山東中醫藥大學學報，2020，44（5）：468-472.

DING Y Q，CHEN Z，TANG S X. Contribution and influenceof Synopsis of Golden Chamber to the study ofapoplexy[J]. J Shandong Univ Tradit Chin Med，2020，44（5）：468-472.

[ 3 ] 祁琥，田丹，張雄偉，等. 菊花提取物對大鼠缺血性腦卒中后肌肉萎縮的改善作用[J]. 中草藥，2024，55（20）：6973-6982.

QI H，TIAN D，ZHANG X W，et al. Improvement effectof Chrysanthemum morifolium extract on muscle atrophyafter ischemic stroke in rats[J]. Chin Tradit Herb Drugs，2024，55（20）：6973-6982.

[ 4 ] GIRVEN M，DUGDALE H F，OWENS D J，et al. Lglutamineimproves skeletal muscle cell differentiationand prevents myotube atrophy after cytokine （TNF- α）stress via reduced p38 MAPK signal transduction[J]. JCell Physiol，2016，231（12）：2720-2732.

[ 5 ] LI Y P，CHEN Y L，JOHN J，et al. TNF-alpha acts via p38MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligaseatrogin1/MAFbx in skeletal muscle[J]. FASEB J，2005，19（3）：362-370.

[ 6 ] 楊若聰，曾南，祁琥，等. 菊花提取物用于制備治療抗缺血性腦卒中后肢體萎縮藥物的應用：CN202310991235.0[P]. 2023-09-29.

YANG R C，ZENG N，QI H，et al. Application of Chrysanthemumextract for treating muscle atrophy after ischemicstroke：CN202310991235.0[P]. 2023-09-29.

[ 7 ] 韓艷秋. 侯氏黑散加減對缺血性腦卒中二級預防臨床觀察[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2018，20（3）：14-16.

HAN Y Q. Clinical observation of modified Houshiheisanon prevention of ischemic stroke[J]. J Liaoning Univ TraditChin Med，2018，20（3）：14-16.

[ 8 ] 李琬，劉炳周，鞠建明，等. 中風瘀熱方對缺血性腦卒中模型大鼠的干預作用及機制[J]. 中國藥房，2023，34（13）：1601-1605.

LI W，LIU B Z，JU J M，et al. Intervention effect andmechanism of Zhongfeng yure decoction on ischemic strokemodel rats[J]. China Pharm，2023，34（13）：1601-1605.

[ 9 ] 王德群. 《神農本草經》導讀[M]. 北京：中國中醫藥出版社，2017：153-154.

WANG D Q. Introduction to Shennong Bencao Jing[M].Beijing：China Traditional Chinese Medicine Press，2017：153-154.

[10] 蔣友寧，王志軒，曹倩倩，等. 藥用菊花多糖研究進展[J].中藥材，2024，47（2）：513-518.

JIANG Y N，WANG Z X，CAO Q Q，et al. Research progresson medicinal Chrysanthemum polysaccharides[J]. JChin Med Mater，2024，47（2）：513-518.

[11] 周衡樸，任敏霞，管家齊，等. 菊花化學成分、藥理作用的研究進展及質量標志物預測分析[J]. 中草藥，2019，50（19）：4785-4795.

ZHOU H P，REN M X，GUAN J Q，et al. Research progresson chemical constituents and pharmacologicaleffects of Chrysanthemum morifolium and predictiveanalysis on quality markers[J]. Chin Tradit Herb Drugs，2019，50（19）：4785-4795.

[12] CASTELLANOS-MOLINA A，BRETHEAU F，BOISVERTA，et al. Constitutive DAMPs in CNS injury：from preclinicalinsights to clinical perspectives[J]. Brain BehavImmun，2024，122：583-595.

[13] PAWLUK H，KO?ODZIEJSKA R，GRZE?K G，et al. Selectedmediators of inflammation in patients with acuteischemic stroke[J]. Int J Mol Sci，2022，23（18）：10614.

[14] QI H，GAO Y L，ZHANG Z Y，et al. Houshiheisanattenuates sarcopenia in middle cerebral artery occlusion（MCAO） rats[J]. J Ethnopharmacol，2025，337（Pt 3）：118917.

[15] WANG R，CAO L，HE Y Y，et al. Nutrition-associatedmarkers and outcomes among patients receiving enteralnutrition after ischemic stroke：a retrospective cohort study[J]. BMC Neurol，2024，24（1）：303.

[16] WANG C J，GU H Q，DONG Q，et al. Rationale and designof treatment of acute ischaemic stroke with edaravonedexborneol Ⅱ （TASTE-2）：a multicentre randomisedcontrolled trial[J]. Stroke Vasc Neurol，2024，9（6）：730-737.

[17] 李龍，王彬，曲政，等. 依達拉奉右莰醇與復方腦肽節苷脂治療急性缺血性腦卒中的療效、安全性和經濟性[J].中國藥房，2023，34（8）：978-982.

LI L，WANG B，QU Z，et al. Efficacy，safety and costeffectivenessof edaravone dexborneol and compound porcinecerebroside ganglioside in the treatment of acute ischemicstroke[J]. China Pharm，2023，34（8）：978-982.

（收稿日期：2024-10-30 修回日期：2025-02-19）

（編輯：唐曉蓮）

基金項目國家自然科學基金項目（No.82104732）