基于代謝組學研究柴胡皂苷C對急性肝損傷小鼠的保護作用

中圖分類號 R285.5；R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0552-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.08

摘要 目的 基于血清代謝組學研究柴胡皂苷C（SSC）對四氯化碳（CCl4）誘導的急性肝損傷（ALI）小鼠的保護作用及機制。方法 將40 只小鼠按隨機數字表法分為空白組（水）、模型組（水）、陽性對照藥組（聯苯雙酯滴丸，150 mg/kg）和SSC 低、高劑量組（2.5、10 mg/kg），每組8 只，每天灌胃水/藥物1 次，連續7 d。末次給藥1 h 后，除空白組外的其余各組小鼠均腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液以建立ALI模型。造模17 h 后，計算小鼠肝指數，檢測小鼠血清中天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-1β水平，觀察小鼠肝組織病理學變化，并采用液質聯用法對小鼠血清進行代謝組學分析。結果 與空白組比較，模型組小鼠肝指數和ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.01）；肝細胞出現水腫、空泡變性并有較多壞死，可見炎癥細胞大量浸潤。與模型組比較，SSC高劑量組小鼠肝指數和血清指標水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），且肝組織病理學損傷明顯改善。代謝組學研究結果顯示，與模型組比較，SSC高劑量組小鼠血清中上調的差異代謝物有63 個、下調的有256 個（包括前列腺素B2、20-羥基白三烯B4、5-羥色氨酸、7α-羥基膽固醇等代謝物），主要涉及花生四烯酸代謝、5-羥色胺突觸、初級膽汁酸生物合成等代謝途徑。結論 高劑量SSC可通過下調前列腺素B2、20-羥基白三烯B4等關鍵代謝物水平，減少花生四烯酸代謝、5-羥色胺突觸、初級膽汁酸生物合成等代謝途徑，進而對CCl4誘導的ALI小鼠發揮保護作用。

關鍵詞 柴胡皂苷C；急性肝損傷；代謝組學；差異代謝物；花生四烯酸代謝；5-羥色胺突觸；初級膽汁酸生物合成

肝臟作為人體最大的解毒器官，其健康與否與機體健康密切相關。數據統計發現，中國各類肝臟疾病患者達4 億多人，該類疾病已經成為危及人們健康最普遍的疾病之一[1]?；瘜W毒物、病毒、細菌、乙醇、自身免疫病等因素均可誘發肝臟疾病[2]。臨床上，常采用化學藥治療肝臟疾病，但其具有副作用大、易產生耐藥性等缺點。而中藥因具有高效、安全等優點，近年來在抗急性肝損傷（acute liver injury，ALI）方面頗受關注[3]。

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，是一種常用的傳統中藥，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效?，F代研究發現，柴胡主要含有皂苷、揮發油、黃酮和多糖等成分，其中柴胡皂苷具有顯著的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、保肝等作用[4]。有研究報道，柴胡皂苷C（saikosaponin C，SSC）具有顯著的抗炎作用，同時也可靶向作用于肝細胞核因子1α（hepatocyte nuclearfactor 1α，HNF1α）和HNF4α，抑制病毒前基因組RNA合成，發揮抗乙型肝炎病毒的作用[5―6]。然而，SSC 是否具有抗ALI 的作用及可能機制尚不清楚。代謝組學是一種對內源性小分子代謝物（相對分子質量小于1 000）進行系統分析的方法，已廣泛應用于疾病的發病機制和中藥對疾病的干預作用及可能機制的研究中[7]。鑒于此，本研究基于代謝組學探討了SSC抗ALI 的作用及其機制，旨在為其進一步的開發與應用奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Eclipse Ci-L型正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon 公司），SpectraMax i3x 型多功能酶標儀[ 美谷分子儀器（上海）有限公司]，UHPLCExploris480型液質聯用（LS-MS）系統、micro21R型高速低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），SCIVS型渦旋混勻器（美國Scilogex公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：SSC 對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號B20149，純度≥98%），聯苯雙酯滴丸（廣州白云山星群藥業股份有限公司，批號RF40009，規格1.5 mg/粒），腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（杭州聯科生物科技有限公司，批號分別為EK282、EK206、EK201B），丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號分別為C009-2-1、C010-2-1、A020-2-2），蘇木精-伊紅（HE）染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1101）；甲醇、乙腈、異丙醇、甲酸均為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，共40只，6 周齡，體重18?20 g，購于河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（豫）2020-0005。所有小鼠均飼養于溫度25 °C、晝12 h/夜12 h 交替、相對濕度50%～60% 的SPF 級環境中，適應性飼養7 d 后進行后續實驗，飼養期間自由飲水、進食。本動物實驗符合《實驗動物護理和使用指南》中相關要求，在鄭州大學實驗動物中心完成，且經該單位動物福利倫理委員會審查批準（批準號：ZZU-LAC20240906〔12〕）。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及造模

將40 只小鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性對照藥組（聯苯雙酯滴丸，150 mg/kg，成人臨床等效劑量）和SSC 低、高劑量組（分別簡寫為SSC-L、SSC-H 組，給藥劑量分別為2.5、10 mg/kg，結合文獻[8]與預實驗結果確定），每組8 只?？瞻捉M、模型組小鼠每天灌胃等體積水，各給藥組小鼠每天灌胃相應藥物，灌胃體積均為0.01 mL，每天給藥1 次，連續7 d。末次給藥1 h 后，空白組小鼠腹腔注射橄欖油，余下各組小鼠腹腔注射0.2% 四氯化碳（CCl4）橄欖油（10 mL/kg）以建立ALI模型[9]。

2.2 樣本取材及處理

CCl4造模17 h 后，稱定小鼠體重，腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉小鼠，眼球取血，將全血在4 ℃下以4 000 r/min 離心15 min，收集上層血清。取血完成后解剖小鼠，取全部肝組織，稱質量。將部分肝組織用4% 多聚甲醛固定，用于組織病理學觀察；余下肝組織及血清均保存于－80 ℃冰箱中，用于后續實驗。

2.3 肝指數計算和生化指標檢測

根據肝臟質量和小鼠體重，計算小鼠肝指數[肝指數（%）＝肝臟質量（g）/體重（g）×100%]。取小鼠血清樣品，根據相應試劑盒說明書方法操作，檢測血清中ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β水平。

2.4 肝組織病理學觀察

取“2.2”項下4% 多聚甲醛固定的肝組織，經脫水、石蠟包埋、切片后，進行HE染色，然后在光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理學形態變化。

2.5 血清代謝組學分析

2.5.1 樣品制備

根據血清指標和病理切片分析結果，取“2.2”項下凍存的空白組、模型組、SSC-H組小鼠血清，常規解凍后，分別吸取80 μL 置于2 mL離心管中，加入240 μL 提取液[V（甲醇）∶V（乙腈）＝1∶1]充分渦旋提取；使用預冷的離心機，在4 ℃下以13 000 r/min 離心10 min（下同），取上清液移至新的離心管中，以氮氣吹干；再加入100 μL復溶液[V（乙腈）∶V（水）＝1∶1]渦旋復溶，離心，每管吸取70 μL上清液至進樣小瓶，作為待測樣品溶液。同時分別吸取各樣品20 μL 至同一離心管中，渦旋混勻，離心，取上清液至進樣小瓶中作為質控（quality control，QC）樣本溶液，待上機檢測。

2.5.2 檢測條件

采用LC-MS 法進行測定。將各組樣品隨機排序，每6 個樣品插入1 個QC樣本進樣檢測。超高效液相色譜系統的檢測條件為：采用Waters ACQUITY UPLCHSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以95%水-5% 乙腈（含0.1% 甲酸）為流動相A、47.5% 乙腈-47.5% 異丙醇-5% 水（含0.1% 甲酸）為流動相B進行等度洗脫，進樣量為3 μL，柱溫為40 ℃。質譜系統的檢測條件為：采用熱噴霧離子源，在正、負離子掃描模式下檢測；離子源電壓為2 800 V；鞘氣壓力為50 Arb；輔助氣壓力為15 Arb；毛細管溫度為350 ℃ ；加熱溫度為400 ℃ ；分辨率為60 000；質譜掃描范圍為m/z 70～1 050。

2.5.3 數據分析

將LC-MS檢測的原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI進行數據處理，然后進行主成分分析（principalcomponent analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），并繪制火山圖。根據OPLS-DA模型得到的變量權重值（variable importance in the projection，VIP）值和P 值來確定差異代謝物，判斷標準為VIP＞1且P＜0.05[10]。將差異代謝物通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫進行代謝通路注釋，獲得相關代謝通路。

2.6 統計學方法

采用SPSS Statistics 25 軟件進行統計分析。滿足正態分布的計量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，方差不齊時組間兩兩比較則采用Tamhane’s T2 檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 SSC對ALI小鼠肝指數和肝功能的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝指數和血清中ALT、AST、LDH 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照藥組、SSC-H 組小鼠肝指數和血清中ALT、AST、LDH水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 SSC對ALI小鼠炎癥因子水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照藥組、SSC-H組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

3.3 SSC對ALI小鼠肝組織病理學的影響

空白組小鼠肝細胞排列緊密，無壞死和炎癥細胞浸潤。模型組小鼠可見較多肝細胞水腫、壞死及空泡變性，胞漿疏松淡染，胞核固縮深染或碎裂溶解，并存在炎癥細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織病理學形態均有不同程度緩解，肝細胞壞死和空泡減少，可見少量炎癥細胞浸潤。結果見圖1。

3.4 血清代謝組學研究結果

3.4.1 SSC對ALI小鼠血清代謝物的影響

PCA結果（圖2）顯示，空白組、模型組、SSC-H組樣品明顯分離，說明3 組血清樣本中的代謝物發生了變化[11]。OPLS-DA 結果（圖3）顯示，模型組與空白組的R2Y（表示模型的累積解釋率）和Q2（表示模型的預測能力）分別是0.993、0.898，SSC-H 組與模型組的R2Y 和Q2分別是0.997、0.761，表明所有OPLS-DA模型均有效；且200 次置換檢驗的截距均為負數（Q2 分別是－0.023 1、－0.011 4），表明模型沒有過擬合?；鹕綀D分析結果（圖4）顯示，模型組與空白組比較，共有627 個血清差異代謝物（上調122 個，下調505 個）；SSC-H組與模型組比較，共有319 個血清差異代謝物（上調63 個，下調256 個）。SSC-H組與模型組比較的VIP 值排前20 名的血清差異代謝物詳見表3。

3.4.2 SSC對ALI小鼠血清代謝通路的影響

差異代謝物的KEGG通路富集分析結果顯示，模型組主要涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，花生四烯酸代謝，鞘脂信號通路等代謝途徑；SSC-H組主要涉及花生四烯酸代謝（如關鍵差異代謝物前列腺素B2和20-羥基白三烯B4）、5-羥色胺突觸（如5-羥色氨酸）、初級膽汁酸生物合成（如7α-羥基膽固醇、3A，7A-二羥基-5B-膽甾烷、7α-羥基-3-氧代-4-膽甾烯酸酯）等代謝途徑。各組P 值排前15 名（按從小到大排序）的代謝途徑如圖5所示。

4 討論

研究發現，肝損傷的發生常伴隨著肝指數、ALT、AST、ALP、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的異常升高，以及肝組織的病理學損傷，如肝細胞腫脹與壞死、炎癥細胞浸潤等[12]。本研究結果顯示，經CCl4誘導后，模型組小鼠的肝指數及血清中ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著升高，肝組織出現肝細胞水腫、空泡變性并有較多壞死等病理損傷，表明ALI 小鼠的肝組織顯著受損。與模型組比較，高劑量SSC可顯著逆轉上述肝指數及血清指標變化，緩解肝組織病理損傷，提示其具有顯著的抗ALI作用。

代謝組學技術具有整體性、綜合性和動態性的特點，常用于研究中藥治療ALI 的作用機制。為進一步研究SSC對ALI 小鼠的保護作用及其機制，本研究采用血清代謝組學方法對空白組、模型組和SSC-H組小鼠的血清進行分析。結果顯示，與模型組比較，SSC-H組2，4-二羥基噻唑等63 個差異代謝物水平上調，前列腺素B2等256 個差異代謝物水平下調，這提示高劑量SSC 可通過調控上述代謝物發揮肝保護作用。

肝臟是體內花生四烯酸及其代謝物滅活和清除的主要器官。有研究發現，病理狀態下，花生四烯酸會代謝生成強促炎介質前列腺素、白三烯等物質，促進機體炎癥介質如TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放，進一步加重機體的炎癥反應[13]。本研究發現，與模型組比較，SSC-H組小鼠血清中前列腺素B2、20-羥基白三烯B4等代謝物水平降低，結合KEGG通路富集分析結果，提示高劑量SSC可通過抑制花生四烯酸代謝，抑制體內過度的炎癥反應，從而發揮對ALI 小鼠的保護作用。5-羥色氨酸是芳香族氨基酸L-色氨酸的衍生物，有研究發現，機體內血清5-羥色氨酸的含量與其炎癥和氧化應激水平呈正相關[14]。本研究發現，與模型組比較，SSC-H組小鼠血清中5-羥色氨酸水平顯著降低，結合KEGG通路富集分析結果，提示高劑量SSC 可抑制5-羥色胺突觸代謝發揮對ALI 小鼠的保護作用。肝臟是膽汁酸的主要合成器官，肝臟中的膽固醇在各種酶的催化下生成初級膽汁酸，而初級膽汁酸經腸-肝循環維持代謝穩態；若膽固醇及初級膽汁酸在肝臟中過度累積，可引發肝細胞損傷和炎癥反應。因此，初級膽汁酸代謝穩態與肝臟正常生理功能的發揮密切相關[15]。本研究發現，模型組小鼠血清中7α-羥基膽固醇、3A，7A-二羥基-5B-膽甾烷、7α-羥基-3-氧代-4-膽甾烯酸酯等膽固醇類代謝物水平均顯著升高，而高劑量SSC 可顯著降低模型小鼠血清中上述差異代謝物水平，再結合KEGG通路富集分析結果，提示高劑量SSC可恢復初級膽汁酸生物合成的穩態，從而發揮肝保護作用。

綜上，高劑量SSC 可能通過減少花生四烯酸代謝、5-羥色胺突觸、初級膽汁酸生物合成等代謝途徑發揮肝保護作用。后續，本課題組將設計體內外實驗進一步研究SSC抗ALI 的分子機制，進而為SSC在臨床治療中的應用提供依據。

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（收稿日期：2024-11-14 修回日期：2025-02-17）

（編輯：林靜）

基金項目河南省自然科學基金項目（No.242300420397）；河南省醫學科技攻關計劃聯合共建項目（No.LHGJ20240259）