阿霉素調(diào)控MRP1/Nrf2通路誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞自噬

摘要：目的 探究阿霉素（Adriamycin，ADM）調(diào)控MRP1/Nrf2通路誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）細(xì)胞自噬機(jī)制。方法 MTT法檢測(cè)ADM和自噬抑制劑氯喹（Chloroquine，CQ）對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞增殖抑制的影響；Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)收集ADM敏感株K562和耐藥株K562/ADR的基因集各三組并進(jìn)行mRNA表達(dá)水平分析和差異基因KEGG富集分析；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM的平均熒光強(qiáng)度（Mean fluorescence intensity，MFI）；丹酰戊二胺法檢測(cè)胞質(zhì)酸化程度；Western blotting檢測(cè)耐藥和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 ADM對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制且量效和時(shí)效遞增趨勢(shì)較為一致；GEO數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示K562和K562/ADR細(xì)胞含有較高的LC3-Ⅱ，P62，Nrf2和MRP1 mRNA表達(dá)水平；分子對(duì)接顯示ADM與P62，Nrf2和MRP1呈現(xiàn)較高的結(jié)合活性（結(jié)合能lt;-7.0 kcal·mol^-1）；ADM抑制MRP1和Nrf2的蛋白表達(dá)水平和促進(jìn)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值上升和抑制P62的表達(dá)；CQ拮抗自噬后，ADM對(duì)耐藥株K562/ADR細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)MFI增強(qiáng)。結(jié)論 ADM抑制Nrf2和MRP1的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，自噬抑制提高K562和K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，促進(jìn)了ADM的攝取和減輕細(xì)胞耐藥性。

關(guān)鍵詞：阿霉素；慢性髓細(xì)胞白血病；MRP1；Nrf2；自噬；耐藥；攝取

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R733.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2024.22.038

文章編號(hào)：1007-7383（2025）01-0029-08

Adriamycin induced autophagy in chronic myeloid leukemia cells via MRP1/Nrf2 pathway

CHEN" Peng1，MA" Yuxian1，CHANG" Xiao1，ZHOU" Zongyuan2，ZHANG" Bo^1，2*

（1 School of Pharmacy/Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000， China;

2" Ministry of Education School of Pharmacy Chengdu University/Sichuan Antimicrobial Industry Research Institute， Chengdu， Sichuan 610000， China）

Abstract：" Objective To investigate the mechanism of autophagy induction in chronic myeloid leukemia （CML） cells by Adriamycin （ADM） regulating MRP1/Nrf2 pathway. Methods MTT assay was used to detect the effects of ADM and autophagy inhibitor Chloroquine （CQ） on the inhibition of cell proliferation in K562 and K562/ADR cells; Gene Expression Omnibus （GEO） database was used to collect three sets of genes each of ADM-sensitive and ADM-resistant strains of K562 and K562/ADR cells， and the mRNA expression levels were analysed and differential gene KEGG-enriched genes were analysed. Three sets of gene sets of ADM sensitive strain K562 and resistant strain K562/ADR were collected from the GEO database and analysed for mRNA expression level and KEGG enrichment of differential genes; Mean fluorescence intensity （MFI） of ADM in cells was detected by flow cytometry; the degree of cytoplasmic acidification was detected by the MDC assay; and the expression level of drug-resistant and autophagy-related proteins was detected by Western blotting. Results ADM inhibited the growth of both K562 and K562/ADR cells with a consistent trend of increasing quantitative and temporal effects; GEO database showed that K562 and K562/ADR cells contained high levels of LC3-II， P62， Nrf2 and MRP1 mRNA; molecular docking showed high binding activity （binding energy lt; -7%） between ADM and P62， Nrf2 and MRP1; ADM inhibited the protein expression levels of MRP1 and Nrf2 and promoted the increase of LC3-II/LC3-Ⅰ ratio and inhibited the expression of P62; after CQ antagonism of autophagy， the inhibitory effect of ADM on K562/ADR cells was significantly strengthened， and intracellular MFI was enhanced. Conclusion ADM inhibited the expression of Nrf2 and MRP1 and induced cellular autophagy， and autophagy inhibition increased the sensitivity of K562 and K562/ADR cells to ADM， which promoted ADM uptake and attenuated cellular drug resistance.

Key words： Adriamycin;chronic myeloid leukaemia;MRP1;Nrf2;autophagy;drug resistance;uptake

0 引言

慢性髓細(xì)胞白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一種由染色體異常而引發(fā)的造血功能異常、骨髓異常增生性血液系統(tǒng)疾病^［1］。根據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，白血病患病率已排在第九位，我國(guó)CML占成人白血病病例的15％，年發(fā)病率為每百萬中3.6人^［2-3］。CML的化療治療周期較長(zhǎng)，在使用藥物治療的過程中，部分患者會(huì)對(duì)伊馬替尼，尼羅替尼等酪氨酸酶抑制劑（首選一線治療藥物）產(chǎn)生耐藥性以及不良反應(yīng)，這對(duì)后續(xù)藥物的選擇增添較大難度。近年來研究發(fā)現(xiàn)CML耐藥伴隨有自噬的產(chǎn)生^［4］，但因?qū)嶓w瘤細(xì)胞自噬對(duì)化療的抵抗作用與血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞自噬對(duì)化療的增敏作用之間存在爭(zhēng)議，尚不明確CML上細(xì)胞自噬對(duì)耐藥性的影響。

Nrf2的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致不良預(yù)后和化療耐藥^［5］。有報(bào)道顯示CML和PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路之間存在密切的聯(lián)系，即通過抑制PI3K/Akt/Nrf2途徑顯著降低細(xì)胞活力并抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）介導(dǎo)的細(xì)胞耐藥^［6］。因此，Nrf2被認(rèn)為是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，在耐藥機(jī)制中起著重要的研究?jī)r(jià)值。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過化療藥物聯(lián)用自噬抑制劑羥基氯喹或氯喹以提高療效，其中報(bào)道P62等基因調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞分化等生物過程，且在自噬誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和耐藥中起重要作用^［7］。已有研究說明P62參與Nrf2通路和自噬通路，自噬的失調(diào)與P62依賴的Nrf2激活相關(guān)^［8］。

蒽環(huán)類化療藥代表藥物阿霉素（Adriamycin，ADM）對(duì)CML具有較好的療效，細(xì)胞毒性殺傷以誘導(dǎo)凋亡為主，且在一些細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)其還能誘導(dǎo)自噬^［9］。K562/ADR 細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平和耐藥蛋白MRP1表達(dá)較K562細(xì)胞高^［10］。因此，本文選擇CML代表株K562和K562/ADR細(xì)胞，探究化療藥物阿霉素調(diào)控MRP1/Nrf2通路誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病自噬以及自噬水平對(duì)耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（C3010-0500，上海達(dá)特希爾生物科技有限公司），青-鏈霉素混合液100×（P1400，北京索萊寶科技公司）。阿霉素（25316-40-9，MCE公司），氯喹（54-05-7，MCE公司），二甲基亞砜（D8370，北京索萊寶科技公司）。RAPI細(xì)胞高效裂解液（R0010，北京索萊寶科技公司），磷酸激酶抑制劑（PR20015，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），蛋白激酶抑制劑（P0100-01，北京索萊寶科技公司）。丹酰戊二胺（Monodansylcadaverine， MDC）自噬試劑盒（G0170，北京索萊寶科技公司）。Beta-actin抗體（1∶1 000，GB11001，武漢賽維爾生物科技有限公司），MRP1抗體（1∶5 000，67228-1，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），Nrf2抗體（1∶2 000，16396-1，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），p62抗體（1∶1 000，88588S，Cell Signaling Technology），LC3 Ⅰ/Ⅱ抗體（1∶1 000，12741T，Cell Signaling Technology）。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ZB-2301）和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠（ZB-2305），均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)公司。

1.2 儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；超低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），多功能酶標(biāo)儀（3001，美國(guó)Thermo公司），Q-5000（美國(guó)Quawell公司），蔡斯正置熒光顯微鏡（Axio Imager A2，德國(guó)Zeiss公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（天能5200，中國(guó)天能公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

K562和K562/ADR細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。K562細(xì)胞使用含9%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基，K562/ADR使用含9%胎牛血清和1 μg·mL^-1 ADM的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均含1%的青-鏈霉素混合液。K562和K562/ADR細(xì)胞在37℃、5% CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)K562和K562/ADR的基因集和差異分析

以“K562”和“Drug resistance”作為檢索詞在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索，獲取數(shù)據(jù)集為GSE93942，篩取阿霉素敏感的K562細(xì)胞和耐藥的K562/ADR細(xì)胞的基因集^［11］。其中基因集GSM2465472，GSM2465473和GSM2465474為ADM敏感組，GSM2465466，GSM2465467和GSM2465468為ADM耐藥組。以校正后Plt;0.05且log2FC＞1為篩選條件得到差異基因并進(jìn)行差異基因分析（http：//www.bioinformatics.com.cn/）。

1.5 分子對(duì)接

分子對(duì)接評(píng)估藥物和關(guān)鍵靶標(biāo)結(jié)合活性。PubChem中檢索阿霉素結(jié)構(gòu)，并保存3D結(jié)構(gòu)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載目標(biāo)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)（https：//www.rcsb.org/structure/）^［12］。AutodockTools（版本號(hào)：1.5.7）對(duì)所下載的蛋白與小分子進(jìn)行對(duì)接，采取盲性對(duì)接的方式，設(shè)置對(duì)接次數(shù)為50次，根據(jù)對(duì)接的結(jié)果選擇結(jié)合位點(diǎn)最好的位置作為小分子與蛋白的結(jié)合能，再利用PyMOL軟件對(duì)所對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6 阿霉素對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞的增殖抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/ADR細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，K562細(xì)胞和K562/ADR細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度（0、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L^-1）的阿霉素，對(duì)照組不加藥，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，按照培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)24 h和48 h，每孔加入5 g·L^-1的MTT或者CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，MTT法使用2 400 r·min^-1離心5 min棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm或者450 nm處的吸光度（OD）值。按照細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率公式以及細(xì)胞耐藥指數(shù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和耐藥倍數(shù)。計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=1-（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100% ，耐藥系數(shù)=耐藥株IC50/敏感株IC50。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ADM熒光的定量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥。48 h后收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，PBS洗滌細(xì)胞，2 400 rpm離心3 min，棄上清。每管加入3 μmol·L^-1阿霉素重懸細(xì)胞，37℃孵育0.5 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀（Ex=488 nm，Em=580 nm）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度（MFI）。

1.8 MDC染色法分析細(xì)胞酸化水平

按照1.6的方法收集細(xì)胞，吸取90 μL細(xì)胞懸液加入10 μL MDC染液，37℃孵育0.5 h，PBS洗滌細(xì)胞1次，然后吸取20 μL細(xì)胞滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞酸化水平（Ex=512 nm）。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)耐藥和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥并收集細(xì)胞。每管加入300 μL細(xì)胞裂解液（RAPI細(xì)胞高效裂解液：磷酸酶抑制劑：PMSF=100∶1∶1）提取蛋白質(zhì)，Q5000檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，補(bǔ)充電泳液和上樣緩沖液進(jìn)行濃度調(diào)平，并水浴煮沸7 min。蛋白樣品經(jīng)9%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，300 mA恒流電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉+TBST封閉1.5 h，TBST洗滌4次，按抗體稀釋比例進(jìn)行一抗孵育過夜，TBST再洗滌4次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行拍照并分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8.0.2.263統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，各組間比較采用2-way ANOVA分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ADM對(duì)K562細(xì)胞及K562/ADR細(xì)胞的增殖抑制作用

ADM對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞的抑制率隨給藥濃度和作用時(shí)間呈現(xiàn)一定的時(shí)效和量效關(guān)系（圖1A，圖1B）。

給藥48 h后細(xì)胞形態(tài)變小，在K562細(xì)胞中24 h和48 h的IC50分別為4.721 μmol·L^-1和0.1284 μmol·L^-1。與K562相比，ADM對(duì)K562/ADR細(xì)胞的抑制作用較小，24 h和48 h的 IC50分別為12.03 μmol·L^-1和4.798 μmol·L^-1，24 h和48 h的耐藥系數(shù)分別達(dá)到2.548倍和37.37倍內(nèi)容詳見表1。

2.2 ADM抑制耐藥相關(guān)蛋白Nrf2和MRP1的表達(dá)

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到對(duì)ADM敏感和耐藥的細(xì)胞株基因集GSE93942，其中ADM敏感株（K562細(xì)胞）和ADM耐藥株（K562/ADR細(xì)胞）共有496個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因221個(gè)，下調(diào)基因275個(gè)（圖2A）?；蚣蠯562/ADR細(xì)胞株中MRP1和Nrf2的mRNA表達(dá)較K562高（圖2B）。通過檢測(cè)ADM對(duì)兩株細(xì)胞的耐藥蛋白的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ADM濃度與蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，1 μmol·L^-1 ADM能很好的抑制K562細(xì)胞中MRP1和Nrf2的表達(dá)（圖2C）。而在K562/ADR細(xì)胞中，8 μmol·L^-1 ADM對(duì)MRP1和Nrf2顯著抑制（圖2D）。

2.3 ADM誘導(dǎo)K562和K562/ADR細(xì)胞自噬

K562和K562/ADR具有較高的基礎(chǔ)自噬水平。通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中基因集GSE93942進(jìn)行差異基因KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在腫瘤（MicroRNAs in cancer），自噬（Autophagy-other）等信號(hào)通路（圖3A）。進(jìn)一步挖掘基因集中自噬相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞中MAP1LC3B（LC3-Ⅱ）的mRNA表達(dá)較高，但與K562/ADR細(xì)胞相比沒有顯著性（圖3B）。K562/ADR細(xì)胞中SQSTM1（P62）mRNA表達(dá)水平與K562細(xì)胞相比增加，且有顯著性（圖3B）。通過檢測(cè)ADM對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白P62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白P62表達(dá)被抑制，自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅰ表達(dá)明顯下降，低濃度ADM中LC3-Ⅱ的增加不明顯，1 μmol·L^-1 ADM增加K562細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，8 μmol·L^-1 ADM增加K562/ADR細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ整體比值隨ADM濃度遞增而增加（圖3C，圖3D）。

A：基因集GSE93942差異基因KEGG通路分析；B：基因集GSE93942中K562細(xì)胞和K562/ADR細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)；**Plt;0.01，K562/ADR細(xì)胞 vs. K562細(xì)胞 C：K562細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；D：K562/ADR細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；*Plt;0.05，**Plt;0.01，ADM組 vs. 對(duì)照組，（±SD，n=3）。圖3 ADM誘導(dǎo)K562和K562/ADR細(xì)胞自噬

2.4 ADM與MRP1/Nrf2/P62分子對(duì)接結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證ADM對(duì)MRP1，Nrf2和P62的結(jié)合活性。本研究將ADM與MRP1（PBD ID：2cbz），Nrf2（PBD ID：7k2j）和P62（PBD ID：6 khz）進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)，通過結(jié)合能來判斷活性成分與靶點(diǎn)的匹配度，一般結(jié)合能值lt;-7.0 kcal·mol^-1 則說明具有"" 強(qiáng)烈的結(jié)合活性。由表2和圖4可知，ADM與上述3種蛋白均呈現(xiàn)較好的結(jié)合活性。

2.5 自噬抑制對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞的ADM攝取影響

較高的自噬水平對(duì)ADM的攝取不利，為了確定自噬對(duì)ADM的攝取影響。本研究使用20 μmol·L^-1 CQ分別預(yù)處理K562細(xì)胞和K562/ADR細(xì)胞1 h，分別加入1 μmol·L^-1 ADM和8 μmol·L^-1 ADM處理48 h。

發(fā)現(xiàn)在K562細(xì)胞中，ADM+CQ組（C_A組）抑制率達(dá)到75.2%，是ADM單獨(dú)給藥的1.2倍，而在K562/ADR細(xì)胞中，C_A組組抑制率63.8%，是ADM單獨(dú)給藥的1.8倍（圖5A）。

與ADM相比，C_A組的抑制效果較好且具有顯著差異（Plt;0.01）?；贙562和K562/ADR細(xì)胞本身具有較高的自噬水平，MDC作為酸性探針指示了自噬溶酶體的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組有小部分細(xì)胞有明顯亮斑，而CQ組的MDC熒光強(qiáng)度較弱且均一，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)無明顯亮斑，提示K562和K562/ADR細(xì)胞自噬水平被抑制（48 h）。與CQ組相比，C_A組的MDC熒光強(qiáng)度較弱，溶酶體的數(shù)量較低（圖 5B）。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM的含量，在K562細(xì)胞中，CQ組比空白組MFI低，C_A組MFI是空白組的1.2倍（Plt;0.01），比ADM單獨(dú)給藥組高，但是沒有顯著性。而在K562/ADR細(xì)胞中，CQ組比Control組MFI高（Plt;0.01），C_A組MFI是空白組的1.5倍（Plt;0.01），比ADR單獨(dú)給藥組高，但沒有顯著性（圖5C）。ADM在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中較少，可能與細(xì)胞耐藥程度相關(guān)，當(dāng)自噬被抑制后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，ADM在細(xì)胞內(nèi)積累增加。

3 討論

白血病化療藥物和骨髓移植為主，阿霉素（ADM）是治療白血病的傳統(tǒng)抗腫瘤藥物之一^［13］。目前已有多種癌癥治療方法被證明能誘導(dǎo)自噬，多數(shù)觀點(diǎn)支持自噬的產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活并導(dǎo)致耐藥性的假說，但對(duì)于自噬抑制是否有益于臨床化療仍存在爭(zhēng)議^［4］。本文中ADM對(duì)CML細(xì)胞也有較好的抑制增殖作用，且K562/ADR對(duì)ADM的敏感性低于K562細(xì)胞。已有研究報(bào)道ADM可抑制K562和K562/ADM細(xì)胞增殖同時(shí)誘導(dǎo)自噬（12 h和24 h）^［14］。基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，K562和K562/ADR細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ的mRNA表達(dá)水平較高，兩者表現(xiàn)為較高的基礎(chǔ)自噬水平。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)0.25和0.5 μmol·L^-1 ADM可以使K562細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加，2和4 μmol·L^-1 ADM也可以使K562/ADR細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加（48 h）。但是LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加是以LC3-Ⅰ的減少而體現(xiàn)的。1 μmol·L^-1 ADM增加K562細(xì)胞和8 μmol·L^-1 ADM增加K562/ADR細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加是以LC3-Ⅱ的積累實(shí)現(xiàn)的。此外，本文MDC結(jié)果也顯示，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞具有亮斑，顯示出較高的自噬水平。有報(bào)道稱LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加不足以說明誘導(dǎo)自噬，使用LC3-Ⅱ/β-actin上調(diào)更為妥當(dāng)^［15］。因此較高濃度的ADM誘導(dǎo)K562和K562/ADR細(xì)胞自噬是必要條件。

多藥耐藥性是導(dǎo)致癌癥化療失敗的主要因素之一，能量依賴性藥物外排泵的過度表達(dá)是多藥耐藥性的主要原因之一。多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）是三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，它可以結(jié)合并水解ATP，并以谷胱甘肽（GSH）結(jié)合物的形式流出多種抗癌藥物（如阿霉素和甲氨蝶呤），而MRP1受Nrf2/ARE途徑調(diào)控^［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)K562/ADR細(xì)胞較K562細(xì)胞自噬基礎(chǔ)水平和耐藥蛋白MRP1表達(dá)高，3-甲基腺嘌呤抑制自噬后MRP1的表達(dá)降低^［10］。本文發(fā)現(xiàn)K562/ADR比K562株含有更高的Nrf2和MRP1 mRNA表達(dá)水平，1 μmol·L^-1 ADM和8 μmol·L^-1 ADM可以顯著抑制K562和K562/ADR細(xì)胞MRP1和Nrf2的表達(dá)，并呈現(xiàn)較高的親和活性。P62對(duì)連接自噬和耐藥起著重要作用，本文發(fā)現(xiàn)ADM能夠顯著降低P62的表達(dá)水平。

自噬在腫瘤發(fā)生過程中的調(diào)節(jié)是雙面的，一方面實(shí)體瘤在血管新生完成前因細(xì)胞缺少能量可以“犧牲”部分自噬細(xì)胞來間接提供有限的能量供給周圍細(xì)胞生存^［16］。另一方面，血液系統(tǒng)腫瘤并不存在著上述營(yíng)養(yǎng)缺乏的必要條件與病理生理意義，這提示白血病細(xì)胞的自噬可能有其它生物學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)伊馬替尼治療后激活的細(xì)胞發(fā)生自噬，可能是其產(chǎn)生耐藥性的原因^［17］。在慢性髓細(xì)胞白血病體系中，發(fā)現(xiàn)抑制自噬可以促進(jìn)K562耐藥細(xì)胞和原代CML干細(xì)胞的死亡^［18］。本文也發(fā)現(xiàn)在K562/ADR細(xì)胞中，ADM的IC50較K562細(xì)胞高，可能源于K562/ADR較高的基礎(chǔ)自噬水平和細(xì)胞的固有耐藥性。研究也顯示抑制Hedgehog途徑可以誘導(dǎo)自噬，與單獨(dú)的Hedgehog抑制劑和自噬抑制劑相比，兩者聯(lián)合增加CML細(xì)胞死亡并顯著誘導(dǎo)凋亡^［19］。雖然本文觀察的自噬現(xiàn)象不顯著，結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫(kù)K562和K562/ADR細(xì)胞內(nèi)P62的mRNA的高表達(dá)，以及ADM對(duì)P62的抑制作用，說明1 μmol·L^-1 ADM和8 μmol·L^-1 ADM還是會(huì)分別誘導(dǎo)K562和K562/ADR細(xì)胞自噬。因此，本文使用氯喹（CQ）抑制細(xì)胞自噬，再聯(lián)合ADM給藥發(fā)現(xiàn)K562/ADR和K562細(xì)胞的增殖被明顯抑制，且細(xì)胞內(nèi)ADM的MFI值增加。這說明自噬抑制可增加K562/ADR和K562細(xì)胞對(duì)ADM的敏感程度，從而增加了對(duì)ADM的攝取。提示自噬可能與耐藥的產(chǎn)生相關(guān)，自噬抑制劑能夠增加細(xì)胞內(nèi)ADM的積累。

本文研究了阿霉素通過MRP1/Nrf2通路誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞自噬以及自噬在耐藥中的作用。1 μmol·L^-1 ADM和8 μmol·L^-1 阿霉素顯著抑制K562和K562/ADR細(xì)胞MRP1/Nrf2/P62的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制自噬后，增加K562/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取和降低細(xì)胞耐藥性，從實(shí)驗(yàn)角度解釋了MRP1/Nrf2通路與慢性髓細(xì)胞白血病耐藥相關(guān)性和與自噬抑制劑聯(lián)用對(duì)抗慢性髓細(xì)胞白血病耐藥的治療方法。

參考文獻(xiàn)（References）

［1］ MINCIACCHI V R， KUMAR R， KRAUSE D S. Chronic myeloid leukemia： a model disease of the past， present and future［J］. Cells， 2021， 10（1）：27-32.

［2］ 中國(guó)慢性粒細(xì)胞白血病診斷和治療指南 （2020版）］［J］. 中華血液學(xué)雜志， 2020， 41（5）： 353-364.

The guidelines for diagnosis and treatment of chronic myelogenous leukemia in China （2020 edition）［J］. Chinese Journal of Hematology， 2020， 41（5）： 353-364.

［3］ 歐澤金， 余丹峰， 梁源浩， 等. 基于全球疾病負(fù)擔(dān)研究數(shù)據(jù)分析1990至2017年白血病死亡和傷殘調(diào)整生命年的變化趨勢(shì)［J］. 癌癥， 2021， 40（2）： 69-81.

OU Z J， YU D F， LIANG Y H， et al. Trends in leukaemia death and disability-adjusted life years from 1990 to 2017 based on data from the Global Burden of Disease Study［J］. Cancer， 2021， 40（2）： 69-81.

［4］ SMITH A G， MACLEOD K F. Autophagy， cancer stem cells and drug resistance［J］. J Pathol， 2019， 247（5）： 708-718.

［5］ ZHU J， WANG H， CHEN F， et al. An overview of chemical inhibitors of the Nrf2-ARE signaling pathway and their potential applications in cancer therapy［J］. Free Radic Biol Med， 2016， 99：544-556.

［6］ YAO J， WEI X， LU Y. Chaetominine reduces MRP1-mediated drug resistance via inhibiting PI3K/Akt/Nrf2 signaling pathway in K562/Adr human leukemia cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2016， 473（4）： 867-873.

［7］ USMAN R M， RAZZAQ F， AKBAR A， et al. Role and mechanism of autophagy-regulating factors in tumorigenesis and drug resistance［J］. Asia Pac J Clin Oncol， 2021， 17（3）： 193-208.

［8］ JIANG T， HARDER B， ROJODE L M， et al. p62 links autophagy and Nrf2 signaling［J］. Free Radic Biol Med， 2015， 88（Pt B）： 199-204.

［9］ 張德毓， 王懷云， 付西. 阿霉素聯(lián)合化療方案在CML中的運(yùn)用［J］. 臨床血液學(xué)雜志， 1996（4）： 175.

ZHANG D Y， WANG H Y， FU X. Adriamycin combination chemotherapy in CML［J］. Journal of Clinical Haematology， 1996（4）： 175.

［10］ 李彩麗， 高靜， 黃雙盛， 等. 自噬水平與白血病K562/ADM細(xì)胞耐藥的關(guān)系研究［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2021， 37（3）： 343-348.

LI C L， GAO J， HUANG S S， et al. Study on the relationship between autophagy level and drug resistance of leukaemia K562/ADM cells［J］. Chinese Bulletin of Pharmacology， 2021， 37（3）： 343-348.

［11］ BARRETT T， WILHITE S E， LEDOUX P， et al. NCBI GEO： archive for functional genomics data sets--update［J］. Nucleic Acids Res， 2013， 41（Database issue）： 991-995.

［12］ BURLEY S K， BERMAN H M， CHRISTIE C， et al. RCSB protein data bank： Sustaining a living digital data resource that enables breakthroughs in scientific research and biomedical education［J］. Protein Sci， 2018， 27（1）： 316-330.

［13］ 劉威， 劉克辛. 白血病細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)方法的研究進(jìn)展［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究， 2018， 41（6）： 937-944.

LIU W， LIU K X. Research progress of multidrug resistance reversal methods in leukaemia cells［J］. Drug Evaluation Research， 2018， 41（6）： 937-944.

［14］ WANG F， CHEN J， ZHANG Z， et al. Differences of basic and induced autophagic activity between K562 and K562/ADM cells［J］. Intractable Rare Dis Res， 2017， 6（4）： 281-290.

［15］ YOSHII S R， MIZUSHIMA N. Monitoring and measuring autophagy［J］. Int J Mol Sci， 2017， 18（9）：1865.

［16］ LIU L L， LONG Z J， WANG L X， et al. Inhibition of mTOR pathway sensitizes acute myeloid leukemia cells to aurora inhibitors by suppression of glycolytic metabolism［J］. Mol Cancer Res， 2013， 11（11）： 1326-1336.

［17］ 朱玲燕， 葛衛(wèi)紅， 葛宇清，等. 自噬調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞功能的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)中藥雜志， 2017， 42（23）： 4542-4547.

ZHU L Y， GE W H， GE Y Q， et al. Progress of autophagy regulation of stem cell function in chronic granulocytic leukaemia［J］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine， 2017， 42（23）： 4542-4547.

［18］ BELLODI C， LIDONNICI M R， HAMILTON A， et al. Targeting autophagy potentiates tyrosine kinase inhibitor-induced cell death in Philadelphia chromosome-positive cells， including primary CML stem cells［J］. J Clin Invest， 2009， 119（5）： 1109-1123.

［19］ ZENG X， ZHAO H， LI Y， et al. Targeting hedgehog signaling pathway and autophagy overcomes drug resistance of BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia［J］. Autophagy， 2015， 11（2）： 355-372.

（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1603122）；四川省天府峨眉創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（1811）

作者簡(jiǎn)介：陳鵬（1996—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。

*通信作者：中文通信作者張波（1978—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事系統(tǒng)藥理學(xué)與中藥藥理學(xué)研究，e-mail：bozhang_lzu@126.com。