基于lncRNA MALAT1探討miR-30c/Runx2對冠心病血管鈣化的作用研究

摘要""目的：探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）轉移相關肺腺癌轉錄本1（MALAT1）通過miR-30c/矮子相關轉錄因子2（Runx2）通路對冠心病血管鈣化的作用。方法：在體外誘導人血管平滑肌細胞（VSMCs）形成血管鈣化模型。采用茜素紅S染色、鈣含量測定和蛋白研究檢測Runx2和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。通過敲低MALAT1和上調MALAT1、miR-30c和Runx2來確定其對VSMCs鈣化的影響。采用雙熒光素酶報告法確認MALAT1與miR-30c或miR-30c與Runx2之間的關系。此外，采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法檢測基因和蛋白的表達。結果：鈣化VSMCs中MALAT1升高，miR-30c降低，MALAT1基因敲低抑制VSMCs鈣化，MALAT1的上調促進了VSMCs的鈣化，MALAT1過表達對VSMCs鈣化的影響可通過上調miR-30c逆轉，而上調Runx2再次逆轉，雙熒光素酶報告實驗證實MALAT1與miR-30c之間存在直接相互作用，Runx2是miR-30c的直接靶點。結論：MALAT1過表達促進VSMC鈣化，部分是通過調節miR-30c/Runx2軸實現的。

關鍵詞""冠心病；血管鈣化；轉移相關肺腺癌轉錄本1；矮子相關轉錄因子2

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.05.007

Abstract Objective：To investigate the effect of long non-coding RNA（lncRNA） transmission-associated lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT1） on coronary artery disease（CHD） vascular calcification through miR-30c/Runx2 pathway.Methods：Human vascular smooth muscle cells（VSMCs） were induced to estabolish the vascular calcification model in vitro.Dwarf associated transcription factor 2（Runx2） and α-smooth muscle actin（α-SMA） were detected by alizarin red S staining，calcium content determination and protein study.The effect of MALAT1 knockdown and MALAT1，miR-30c and Runx2 up-regulation on VSMCs calcification was determined.Dual luciferase reporting was used to confirm the relationship between MALAT1 and miR-30c or miR-30c and Runx2.Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot were used to detect gene and protein expression.Results：In calcified VSMCs，MALAT1 increased，miR-30c decreased，and MALAT1 knock-down inhibited VSMCs calcification.Up-regulation of MALAT1 promoted calcification of VSMCs.The effect of MALAT1 overexpression on calcification "of "VSMCs "was reversed "by up-regulation of miR-30c，while "up-regulation of Runx2 again reversed.Dual luciferase assay confirmed the direct interaction between MALAT1 and miR-30c，and Runx2 was the direct target of miR-30c.Conclusion：MALAT1 overexpression promotes VSMC calcification，in part by modulating the miR-30c/Runx2 axis.

冠心病（coronary artery disease，CAD）是指冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，而血管鈣化（vascular calcification，VC）是動脈粥樣硬化的標志，血管鈣化是鈣、磷等礦物質在血管壁上異常沉積的一種活性的、高度復雜的生物過程［1］。根據礦物質沉積的位置，通常可以觀察到兩種類型的鈣化，即內膜鈣化和內側鈣化，由于血管內膜中脂質和膽固醇的積累，內膜鈣化與動脈粥樣硬化有關，這可能導致斑塊破裂和急性血管閉塞［2］。另一方面，內側鈣化發生于血管內側層平滑肌細胞，引起動脈硬化［3］。迄今為止，雖然已發現與CAD的血管鈣化相關的多種機制，如炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、自噬等，但其病理基礎尚未明確。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一組長度超過200個核苷酸的RNA分子，研究表明，lncRNA在血管鈣化中發揮關鍵作用［4］。研究顯示，在無機磷酸鹽誘導的人血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化模型中，有數百個lncRNA差異表達，其中Lrrc75a-as1負性調控血管鈣化，可能作為血管鈣化的治療靶點［5］。此外，研究顯示，抗分化非編碼RNA（anti-differentiation noncoding RNA，ANCR）通過激活自噬抑制VSMCs的成骨細胞分化，減輕小鼠動脈鈣化。轉移相關肺腺癌轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是哺乳動物中高度保守的核定位lncRNA［6］。研究發現，MALAT1在鈣化的主動脈瓣組織以及成骨細胞樣的人主動脈瓣間質細胞（valve stromal cells，VIC）中高度表達，MALAT1通過海綿化miR-204調節Smad表達，促進VIC成骨分化［7］。通過在lncRNADisease v2.0數據庫（http：//www.rnanut.net/lncrnadisease/index.php/home/search）中檢索MALAT1與lncRNA Symbol，發現MALAT1除與癌癥外，還與肝硬化（分數=0.993 3）、主動脈瓣鈣化（分數=0.982 0）、糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）（分數=0.963 0）、糖尿病（分數=0.905 3）等幾種血管鈣化相關疾病高度相關，本研究推測MALAT1可能在血管鈣化的發病機制中發揮重要作用。

microRNAs（miRNAs）是另一組被廣泛研究的參與血管鈣化進展的非編碼RNA，許多miRNA已被證明在促進（如miR-221，miR-222，miR-223，miR-712，miR-714，miR-762）或防止血管鈣化（如miR-30b，miR-30c，miR-125b和miR-133a）中起作用［8］。miR-30c是miR-30家族的成員之一，已被證明是MALAT1的靶標［9］。但MALAT1/miR-30c軸在血管鈣化中作用的報道較少。本研究主要探究lncRNA MALAT1通過調控miR-30c/RUNX2通路對冠心病血管鈣化的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人主動脈VSMCs（BNCC340087）購自Bnbio公司（北京，中國），在Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）（添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）或鈣化培養基（DMEM培養基添加2 mmol/L Na2HPO4），37 ℃，5%CO2溫箱中培養。

1.2 茜素紅S染色和細胞鈣含量定量

細胞培養10 d后進行茜素紅S染色和細胞鈣含量定量。茜素紅S染色：培養的VSMCs在室溫下用4%多聚甲醛溶液固定20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，用1%茜素紅S溶液（pH=4.2）在37 ℃下染色30 min，染色后用PBS洗滌，倒置顯微鏡下觀察。為了定量培養VSMCs的Ca2＋含量，在加入去離子水后進行超聲分解，離心后收集上清，后按照制造商的說明將商用鈣測定試劑盒（南京建成生物技術研究所，中國南京）的檢測試劑加入上清，使用二辛可酸（BCA）試劑盒（Wanleibio，中國沈陽）測定樣品的OD值（610 nm檢測）和蛋白質濃度來測定細胞鈣含量。

1.3 細胞轉染

探討MALAT1、hsa-miR-30c-5p（miR-30c）和Runx2在血管鈣化中的作用，使用Lipofectamine 2000試劑，按照制造商的說明書（Life Technologies Corporation，美國），將慢病毒短發夾RNA（lentiviral short hairpin RNA，shRNA）和MALAT1的表達質粒（Western Biomedical Technology Company，中國）、miR-30c模擬物（Invitrogen，美國）和Runx2過表達載體（GenePharma Company，中國）轉染到VSMC中，轉染后，細胞在鈣化培養基中再培養10 d，進行以下所有實驗。

1.4 雙熒光素酶報告試驗

為了確認MALAT1與miR-30c或miR-30c與Runx2之間的關系，由GenePharma（Shanghai，China）合成了MALAT1或Runx2的野生型和突變型報告質粒，當VSMC生長到70%～80%的合流度時，根據制造商的說明（Life Technologies Corporation，USA），用Lipofectamine 2000試劑將合成的報告質粒與miR-30c模擬物或陰性對照模擬物（NC模擬物）共轉染到細胞中，轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒（Beyotime，Shanghai，China）檢測熒光信號。

1.5 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

使用RNAiso Plus（Takara，Tokyo，Japan）提取VSMC的總RNA，并使用Hifair?II第一鏈cDNA合成試劑盒（Yeasen，Co，Ltd，Shanghai，China）或miRNA逆轉錄PCR試劑盒（RiboBio，China）反轉錄為cDNA。后使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen，Co，Ltd，Shanghai，China）在ABI Step One Plus?實時PCR系統（ABI Applied Biosystem，USA）上進行qRT-PCR，用2－ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.6 蛋白免疫印跡法

VSMCs蛋白采用冷RIPA緩沖液（Beyotime，Shanghai）提取，BCA試劑盒（Wanleibio，Shenyang）檢測，后用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白裂解物并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂乳阻斷后，用抗矮子相關轉錄因子2（Runx2）的一抗孵育膜（1∶1 000），α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），（1∶2 000）β-肌動蛋白（1∶2 000），在4 ℃下過夜，用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST液）緩沖液洗滌后，用酶標IgG二抗（1∶1 000）在室溫下放置1 h，使用增強化學發光法（ECL）蛋白印跡底物（Thermo）進行可視化，使用Image J軟件對波段進行量化。

1.7 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。定性資料以例數、百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MALAT1和miR-30c在VSMCs鈣化過程中差異表達

為了確定MALAT1和miR-30c是否與VSMC鈣化有關，首先用鈣化培養基處理VSMCs以誘導體外鈣化，茜素紅S染色結果表明，培養10 d后，鈣化介質（Cal-Medium）組比DMEM組觀察到更多的礦化結節，還發現Cal-Medium鈣含量高于DMEM組，蛋白免疫印跡結果顯示，與DMEM組相比，Cal-Medium組Runx2的蛋白表達增加，而α-SMA降低，為驗證MALAT1和miR-30c在VSMCs鈣化過程中的表達變化，采用qRT-PCR結果表明，與DMEM組相比，Cal-Medium組MALAT1的表達顯著增加，miR-30c顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1、圖2、表1。

2.2 MALAT1對VSMC鈣化的作用

為了探究MALAT1在VSMCs鈣化中的作用，構建了MALAT1的慢病毒shRNA，與陰性對照shRNA（NC shRNA）轉染，MALAT1敲低極大地抑制了VSMC的鈣化，如礦化結節較少，鈣含量較低、Runx2的較低表達和較高的α-SMA表達，相反，使用慢病毒載體（Lv-MALAT1）促進VSMC鈣化，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2、表3、圖3～圖6。

2.3 MALAT1直接海綿miR-30c對VSMC鈣化的作用

為了驗證MALAT1與miR-30c之間的關系，使用ENCORI平臺（https：//starbase.sysu.edu.cn）預測MALAT1與miR-30c的結合位點，qRT-PCR結果顯示，MALAT1敲低后miR-30c的表達強烈增加，而MALAT1上調后miR-30c的表達下降，表明MALAT1對miR-30c有抑制作用。雙熒光素酶報告實驗進一步證明，miR-30c模擬物對轉染MALAT1-MUT報告質粒的細胞沒有影響，但可以顯著降低轉染MALAT1-WT報告質粒的細胞的熒光素酶活性。結果表明MALAT1和miR-30c之間存在直接的相互作用。為了探索miR-30c在VSMCs鈣化中的作用，轉染了miRNA模擬物，與NC mimic轉染相比，miR-30c mimic轉染后miR-30c的表達明顯增加，茜素紅S染色和鈣含量測定顯示，上調miR-30c可顯著抑制VSMCs的鈣化。研究結果表明MALAT1可以直接海綿miR-30c，其上調可抑制VSMCs的鈣化。詳見表4～表6、圖7、圖8。

雙熒光素酶報告實驗（x±s）

對VSMC鈣化的作用（x±s）

2.4 Runx2是miR-30c的直接目標

2.5 MALAT1通過調節miR-30c/Runx2軸對VSMC鈣化的影響

為闡明MALAT1、miR-30c和Runx2之間的調控關系，采用DMEM培養基（NC組）、空載體（Lv-NC組）、Lv-MALAT1載體（Lv-MALAT1組）、Lv-MALAT1載體＋NC模擬物（Lv-MALAT1＋NC模擬組）、Lv-MALAT1載體＋miR-30c模擬物（Lv-MALAT1＋miR-30c組）或Lv-MALAT1載體＋miR-30c模擬物＋Runx2過表達載體（Lv-MALAT1＋miR-30c模擬物＋Runx2組）對鈣化VSMC進行處理，結果表明，Lv-MALAT1載體過表達MALAT1顯著促進了VSMCs鈣化，增加了Runx2，但降低了α-SMA表達，而miR-30c模擬物的miR-30c上調逆轉了這種效應，而Runx2與過表達載體，表明MALAT1對VSMC鈣化的影響至少部分是通過調節miR-30c/Runx2軸，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表9、圖11、圖12。

為了確認Runx2是否是miR-30c的直接靶標，使用ENCORI平臺獲取miR-30c和Runx2，qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示，與NC模擬轉染相比，miR-2c模擬轉染后Runx30的表達顯著降低，雙熒光素酶報告測定進一步表明，miR-30c模擬物可以顯著降低轉染Runx2-WT報告質粒的細胞的熒光素酶活性，在轉染Runx2-MUT報告質粒，結果表明，Runx2是miR-30c的直接靶標，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖9、圖10、表7、表8。

3 討論

動脈粥樣硬化斑塊主要由VSMC組成，影響VSMC表型的基因可以調節CAD風險，VSMC是血管介質中的主要細胞，常用于研究內側血管鈣化［10］。在本研究中，使用高磷酸鹽培養基在VSMCs中誘導體外血管鈣化模型，結果顯示鈣化VSMCs中MALAT1表達升高，miR-30c表達降低，從機制上講，MALAT1促進VSMCs鈣化，至少部分是通過調節miR-30c/Runx2軸作用。

MALAT1最初在非小細胞肺癌中被發現，但也有相關報道在包括但不限于膀胱癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、前列腺癌和腎細胞癌等多種癌癥中高表達，MALAT1還參與了幾種血管鈣化相關疾病的發病機制［11］。研究顯示，MALAT1在鈣化的主動脈瓣組織中高表達，并通過海綿化miR-204促進VIC的成骨分化［12］。另外研究顯示，MALAT1在CAD和糖尿病病人中顯著上調，此外，MALAT1在區分CAD病人和對照組方面具有最高的診斷能力，MALAT1參與了冠心病和糖尿病的發病機制，可作為冠心病的潛在診斷標志物［13］。研究顯示，MALAT1與糖尿病相關并發癥（包括腦缺血再灌注損傷、糖尿病視網膜病變、糖尿病性白內障、動脈粥樣硬化、糖尿病性白內障、糖尿病性心肌病、非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病性胃病、糖尿病性腎病和妊娠期糖尿病）的相關性，并強調MALAT1是這些疾病有前景的診斷和治療靶點［14］。另一項研究表明，MALAT1是一種高度敏感的lncRNA，在體外和體內調節高度依賴性VSMC的增殖和遷移［15］。本研究發現，MALAT1在鈣化的VSMCs中表達上調。shRNA敲低MALAT1抑制VSMCs鈣化相反，MALAT1過表達質粒上調可促進VSMCs鈣化。這些證據證實了MALAT1在血管鈣化中的重要作用，提示MALAT1可能作為血管鈣化相關疾病的治療靶點。

根據競爭內源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）假說，lncRNAs可以通過與miRNAs的競爭結合來調節下游基因的表達，MALAT1可能作為ceRNA參與血管鈣化的過程［16］。為了進一步闡明MALAT1調節血管鈣化的分子機制，本研究探討了miR-30c，因為miR-30c作為MALAT1的一個已知靶點，與血管鈣化的發病機制有關。研究發現，骨形態發生蛋白-2降低了人冠狀動脈VSMCs中miR-30b和miR-30c的表達，導致血管鈣化［17］。研究顯示，檸檬酸鐵在VSMC中的抗鈣化作用與miR-30c的升高有關［18］。在本研究中，miR-30c在鈣化的VSMCs中表達降低，用miRNA模擬物上調miR-30c抑制VSMCs鈣化。此外，本研究結果證實了VSMCs中MALAT1海綿miR-30c。本研究使用ENCORI平臺預測MALAT1含有miR-30c的結合位點，并使用雙熒光素酶報告法證實了其直接結合關系；發現在VSMCs中MALAT1與miR-30c呈負相關，通過上調miR-30c逆轉MALAT1過表達對VSMCs鈣化的影響。Runx2是miR-30c的一個已知靶點，對于成骨細胞分化和VSMCs鈣化至關重要［19］。在本研究中，發現Runx2在鈣化的VSMCs中上調，并且Runx2的上調可以逆轉miR-30c升高對VSMCs鈣化的影響。

綜上所述，本研究結果證實MALAT1海綿miR-30c上調Runx2的表達，從而促進VSMCs鈣化。MALAT1過表達促進VSMCs鈣化，至少部分是通過介導miR-30c/Runx2軸實現的。MALAT1可作為CAD的血管鈣化相關疾病的潛在治療靶點。

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基金項目"湖南省衛生健康委員會科研計劃項目（No.202210232278）

作者單位"長沙市第四醫院/湖南師范大學附屬長沙醫院（湖南長沙"410006）

通訊作者"吳丹，E-mail：498499599@qq.com

引用信息"李茜，吳丹，胡燦，等.基于lncRNA MALAT1探討miR-30c/Runx2對冠心病血管鈣化的作用研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2025，23（5）：690-696.

（收稿日期：2023-07-15）

（本文編輯"鄒麗）