異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷與玉米醇溶蛋白的結合特性和穩定性

摘要： 利用光譜分析和計算機模方法擬研究異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷兩種黃酮類化合物的成分、 與玉米醇溶蛋白（Zein）的結合行為以及兩種黃酮-Zein體系的穩定性，并揭示兩種黃酮與Zein的最佳結合模式、 結合位點及形成復合物體系的穩定性. 實驗結果表明， 兩種黃酮均通過氫鍵和范德華力與Zein結合， 導致蛋白固有熒光發生靜態猝滅， 從而改變蛋白二級結構.

關鍵詞：玉米醇溶蛋白； 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷； 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷； 多光譜分析； 計算機模擬

中圖分類號： O641.3文獻標志碼： A文章編號： 1671-5489（2025）02-0629-09

Binding Characteristics and Stability of Zein with Isorhamnetin- 3-O-glucoside and Isorhamnetin-3-O-rutinoside

LIAN Di， CUI Jingjing， LI Yuan， DU Yutong， WANG Suqing， WANG Meizi， LI Li

（College of Chemistry， Changchun Normal University， Changchun 130032， China）

收稿日期： 2024-03-22. 網絡首發日期：2024-11-21.

第一作者簡介： 廉 笛（2001—）， 女， 漢族， 碩士研究生，從事分析化學的研究，E-mail： 995016155@qq.com. 通信作者簡介：

李 麗（1969—）， 女， 漢族，博士， 教授， 從事分析化學的研究， E-mail： lilchem@163.com.

基金項目： 吉林省科技廳國際合作項目（批準號： 20210402049GH）和長春師范大學研究生創新項目（批準號：YJSCX2024026）.

網絡首發地址：https：//link.cnki.net/urlid/22.340.O.20241102.

Abstract：We studied the composition oftwo flavonoids，isorhamnetin-3-O-glucoside and isorhamnetin-3-O-rutinoside， their binding behavior with Zein， and the stability of twoflavonoid-Zein systems by using spectral analysis andcomputer simulation method， andrevealed the optimal binding mode， binding site and the stability of the complex system formed by two flavonoids and Zein.The experimental results show thattwo flavonoids bind to Zein through hydrogen bond and van der Waals forces， leading to static quenching of intrinsic fluorescence of Zein and altering its secondary structure of Zein.

Keywords： Zein;isorhamnetin-3-O-glucoside;isorhamnetin-3-O-rutinoside;multi-spectral analysis;computer simulation

0 引 言

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷是以異鼠李素為母核的黃酮類成分. 二者結構相似（圖1）， 且具有相似的生物活性， 如抗氧化和治療糖尿病等^[1-2]. 由于黃酮類成分難溶于水， 在胃腸道條件下不穩定， 因此其生物利用度較低^[3]. 文獻[4-5]研究表明， 玉米醇溶蛋白（Zein）可作為疏水性黃酮類成分的載體， 進而提高其水溶性及生物利用度. Zein的等電點為pH=6.2^[6]. 近年來， 隨著Zein在藥物載體上的廣泛應用， 對Zein與其包埋的小分子藥物的相互作用研究已引起人們廣泛關注. 多種光譜分析^[7]在研究藥物小分子與蛋白相互作用中應用廣泛， 可從各角度揭示小分子與蛋白結合前后的蛋白二級結構變化^[8]. 此外， 計算機模擬技術可更好地分析小分子與蛋白間的最佳結合模式、結合位點、 結合作用力及復合物體系的穩定性^[9].

本文通過多光譜分析法研究異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷兩種黃酮與Zein之間的結合特征， 利用計算機模擬技術分析兩種黃酮與Zein的最佳結合模式、 結合位點及形成復合物體系的穩定性.

圖1 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（A）和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（B）的結構

Fig.1 Structure of isorhamnetin-3-O-glucoside （A） and isorhamnetin-3-O-rutinoside（B）

1 實 驗

1.1 試 劑

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（HPLCgt;98%， CAS號： 5041-82-7）， 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（HPLCgt;98%， CAS號： 604-80-8）， Zein購于寶雞辰光生物科技有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 熒光光譜、 紫外光譜和紅外光譜

分別用兩種黃酮（0～25.01 μmol/L）滴定Zein的乙醇溶液（10 μmol/L）. 在溫度為298，304，310 K， 縫隙寬度為5 nm、 波長為290～420 nm、 激發波長為280 nm下用熒光光譜儀（F-7000型， 日本島津公司）測定熒光光譜. 在298 K， Δλ=15 nm條件下測定同步熒光光譜. 在298 K， 發射波長為280～380 nm、 激發波長為210～350 nm、 增量為2 nm條件下測定3D熒光光譜.

分別用兩種黃酮（0～25.01 μmol/L）滴定Zein的乙醇溶液（10 μmol/L）， 相應濃度黃酮為空白. 在溫度為298 K， 200～350 nm波長和1 nm間隙用紫外-可見分光光度計（Cary 300型， 美國安捷倫公司）檢測紫外光譜.

Zein濃度為10.0 μmol/L， 兩種黃酮和Zein的物質的量比為1∶2. 將樣品于-80 ℃冷凍干燥. 以KBr為檢測背景， 波數為4 000～500 cm^-1， 分辨率為4 cm^-1， 掃描32次， 用Fourier變換紅外光譜儀（Nicolet IS-50型， 美國Thermo公司）掃描得到樣品的Fourier變換紅外（FT-IR）光譜. 利用Peakfit V4.12計算二級結構變化.

1.2.2 計算機模擬

采用（https：//zhanggroup.org/I-TASSER/registration.html）同源建模， 并用Ramachandran和NMR/X-ray檢驗模型的合理性. 通過Pymol軟件消除Zein的結合配體和結晶水. 利用Chem 3D ultra 16.0優化黃酮分子結構， 通過增加氫原子和計算電荷與Zein半柔性對接. 對接盒子尺寸為60 nm×6.0 nm×6.0 nm，網格間距為0.037 5 nm. 通過AutoGrid獲得網格圖能量值， 通過Lamarck遺傳算法進行計算， 對接次數為100次. 模擬動力學（Gromacs 2020.6）以Amber99sb-Ildn和Gaff為Zein和黃酮通用力場， 建立TIP3P模型水箱， 并添加Na+平衡體系， 采用宏觀正則系綜（NVT）和等溫等壓（NPT）平衡系統. 在溫度為298 K， 100 ns條件下進行動力學模擬， 并計算均方根偏差（RMSD）和回旋半徑（Rg）.

1.3 數據處理

平行實驗3組， 用Excel-2016計算均值和偏差.

2 結果分析與討論

2.1 熒光猝滅機制分析

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的熒光光譜如圖2所示. 由圖2可見， Zein的最大熒光峰位于308 nm處. 隨著兩種黃酮的增加， Zein熒光強度呈下降趨勢， 表明兩種黃酮均能有效猝滅Zein的熒光. 當異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷濃度為25.01 μmol/L時， Zein的熒光強度分別下降了58.6%和42.4%. 此外， Zein的最大峰值略藍移， 表明與兩種黃酮結合后， Zein氨基酸微環境疏水性增強.

曲線a～g分別為c（Zein）=10 μmol/L， c（兩種黃酮）=0，4.18，8.35，12.52，16.69，20.85，25.01 μmol/L； 曲線h為c（兩種黃酮）=25.01 μmol/L.

圖2 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（A）和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（B）的熒光光譜

Fig.2 Flurescence spectra of isorhamnetin-3-O-glucoside （A） and isorhamnetin-3-O-rutinoside （B）

利用

Fcorr= Fobs×10^（Aex+Aem）/2（1）

對熒光數據進行校正， 利用

F0F=1+Ksvc=1+Kqτ0c（2）

計算Ksv和Kq，其中Fcorr為校正熒光強度， Fobs為測量熒光強度， Aex和Aem分別為黃酮樣品在激發和發射波長處的紫外吸收值， F0和F分別為Zein蛋白和Zein-黃酮熒光， Ksv和Kq分別為Stern-Volmer猝滅常數和猝滅速率常數， τ0=10^-8 s為熒光分子的平均壽命， c為黃酮濃度.

小分子藥物對蛋白的猝滅類型包括動態、 靜態或混合淬滅類型^[10].

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的Stern-Volmer曲線如圖3所示. 由圖3可見， 當溫度為

298 K時Stern-Volmer曲線為一條直線， 表明兩種黃酮對Zein的猝滅為單一類型. 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的熒光分析結果列于表1. 由表1和圖3可見，Ksv隨溫度升高逐漸降低， Kqgt;2×10¹⁰ L/（mol·s）， 表明Zein熒光被靜態猝滅.

利用

1F-F0=1F1-F0+1KbF1-F0cⁿ（3）

計算結合常數Kb^[11].

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的（F-F0）^-1-c^-1曲線如圖4所示. 由圖4可見，

c^-1和（F-F0）^-1之間線性關系良好.

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的（F-F0）^-1-c^-2曲線如圖5所示. 由圖5可見，

c^-2和（F-F0）^-1之間間具有非線性關系， 表明Zein-兩種黃酮的化學計量比為1∶1^[12]. Zein-黃酮的結合力隨溫度升高而顯著降低， 說明形成的復合物體系在較低溫度下穩定. Zein-異鼠李素-3-O-葡萄糖苷顯著高于Zein-異鼠李素-3-O-蕓香糖的結合力.

圖4 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（A）和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（B）的（F-F0）^-1-c^-1曲線

Fig.4 （F-F0）^-1-c^-1curves of isorhamnetin-3-O-glucoside （A） and isorhamnetin-3-O-rutinoside （B）

疏水力、 靜電力、 范德華力和氫鍵力均為小分子和大分子結合的主要作用力^[13]. 利用

ln Kb=-ΔH⁰RT+ΔS⁰R，（4）

ΔG⁰=ΔH⁰-TΔS⁰（5）

計算結合常數（Kb）反應的熵變（ΔS⁰）、 焓變（ΔH⁰）和Gibbs自由能變（ΔG⁰）， 進而推測Zein與兩種黃酮間的結合力， 計算結果列于表2.由ΔG⁰lt;0可確定Zein與兩種黃酮結合為自發的和放熱過程. 由ΔH⁰lt;0和ΔS⁰lt;0可確定兩種黃酮主要通過氫鍵和范德華力與Zein結合^[13].

2.2 兩種黃酮對Zein構象的影響

2.2.1 UV光譜分析

通過紫外（UV）光譜分析可研究蛋白質與配體結合前后的結構變化^[14]. 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的紫外光譜如圖6所示. 由圖6可見， 在215，278 nm處的紫外吸收峰分別表示Zein肽鏈和Tyr特征紫外峰^[14]. 隨著樣品的不斷增加， 位于215 nm處的峰強度出現明顯降低的趨勢， 并伴隨明顯紅移， 位于278 nm處的峰強度略減小， 位置無移動. 表明兩種黃酮結合導致Zein肽鏈的松動和折疊展開. 兩種黃酮與Zein結合后， Zein的紫外光譜發生明顯改變， 因此可推測Zein被兩種黃酮靜態猝滅^[15].

2.2.2 同步和三維光譜分析

通過同步熒光和三維熒光可檢測蛋白與小分子配體結合前后的微環境變化^[16]. 由于Zein中缺乏色氨酸殘基^[17]， 因此本文僅研究兩種黃酮對 Zein 中酪氨酸殘基周圍微環境的影響， 固定Δλ=15 nm. 利用

RSFQ=1-F/F0（6）

計算同步熒光猝滅比（RSFQ）值.

異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的同步熒光光譜和三維熒光光譜分別如圖7和圖8所示. 由圖7可見， 隨著兩種黃酮濃度的增加， 在Δλ=15 nm處的熒光強度有規律下降， 表明兩種黃酮通過與Tyr的結合與Zein發生作用. 在Δλ=15 nm處的峰略藍移， 表明兩種黃酮導致Tyr周圍的疏水性略增強^[16].

圖8中峰a、 峰1和峰2分別表示Rayleigh散射峰、 Tyr和多肽骨架的熒光特征^[18]. 由圖8可見： 兩種黃酮與Zein結合后， 峰1的熒光強度顯著下降， 并略藍移， 表明兩種黃酮結合可通過改變Zein的Tyr附近微環境疏水性而導致構象變化； 峰2的熒光強度降低并略藍移， 表明Zein的多肽骨架的構象發生了變化；

峰1和峰2強度降低， 表明兩種黃酮與Zein結合導致多肽鏈的解折疊和構象改變^[18].

2.2.3 FT-IR分析

Zein、 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的FT-IR譜如圖9所示.

由碳氧雙鍵延伸、 C—N延伸和N—H彎曲振動觸發的酰胺 Ⅰ， Ⅱ 和 Ⅲ 帶是用于研究蛋白質構象的3個最常見的FT-IR譜帶^[19]. 與酰胺 Ⅱ 和 Ⅲ 相比， 由于酰胺 Ⅰ 反映了Zein二級結構的重要特征^[19]， 因此其在研究蛋白質二級結構變化方面更重要. 利用酰胺 Ⅰ 帶擬合并計算Zein的二級結構變化， 結果列于表3. 由表3可見， 當Zein與異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的物質的量比為1∶2時， Zein的α-螺旋從20.7%增加到286%， β-折疊從295%減小到26.1%， β-轉角從17.7%增加到20.5%， β-反向平行和無規則卷曲分別從20.2%和119%減少到17.1%和7.6%. 當Zein與異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的物質的量比為1∶2時， Zein的α-螺旋從20.7%增加到32.7%， β-折疊從29.5%增加到32.2%， β-轉角從17.7%降低到13.5%， β-反向平行和無規卷曲分別從20.2%和11.9%減少到15.3%和6.3%. 因此， 黃酮與Zein結合導致α-螺旋發生改變.

2.3 計算機模擬分析

2.3.1 分子對接

Ramachandran分析結果如圖10所示. 由圖10可見， 60.1%的氨基酸殘基位于最優區域， 30.6%的殘基位于允許區域， 7.7%的殘基位于通常允許區域， 1.6%的殘基位于不允許區域， 表明同源模型可用于對接. 用NMR/X-ray評分可輔助檢查Zein的模型準確性（圖10（B））， 由Z評分為-3.28進一步表明， 通過同源性建模建立的Zein模型適用于對接. 通過分子對接可預測受體與配體的結合部位、 結合部位周圍的氨基酸殘基以及結合力^[20].

由圖11可見， 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和Zein的ΔGbinding（-25.83 kJ/mol）略高于298 K下通過熒光分析計算的ΔG值（-26.63 kJ/mol）， 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷和Zein的ΔGbinding（-20.86 kJ/mol）高于298 K下通過熒光分析計算的ΔG值（-24.14 kJ/mol）， 這可能是由于理論對接與實際實驗條件不同所致. 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷分別與GLN72（0.188 nm）， GLN119（0.191 nm）， SER94（0.196，0.221 nm）， ASN71 （0.219，0.229 nm） 和THR95（0.321 nm）形成7個氫鍵； 異鼠李素-3-O-蕓香糖苷分別與ASN126 （0165，0.196，0.208 nm），ASN77（0.212 nm），GLN127（0.223 nm）和LEU123 （0.194 nm）形成6個氫鍵. 由異鼠李素-3-O-葡萄糖苷|ΔE2|（39.67 kJ/mol）遠大于|ΔE3| （1.13 kJ/mol）和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷|ΔE2|（39.75 kJ/mol）遠大于|ΔE3|（1.09 kJ/mol）可確定兩種復合物主要通過氫鍵和范德華力形成^[20].

2.3.2 分子動力學模擬分析

圖12為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷-Zein和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-Zein的RMSD圖和Rg圖. RMSD是評價兩種黃酮-Zein復合物穩定性的重要依據^[21].由圖12（A）可見， 兩種黃酮-Zein復合物的RMSD值在20 ns前一直增加， 40 ns后趨于平穩， 復合物RMSD值比Zein的RMSD值更低， 表明兩種黃酮-Zein復合物體系更穩定. Rg用于確定蛋白結構緊湊程度^[21]. 由圖12（B）可見， 在20 ns后，兩種黃酮-Zein復合物低于Zein的Rg值， 表明Zein與兩種黃酮結合后的結構更緊密^[21].

綜上所述，兩種黃酮以異鼠李素為母核， 結構相似， 在與Zein結合過程中表現出相似的行為. 兩種黃酮通過氫鍵和范德華力與Zein蛋白結合形成復合物， 導致Zein的熒光被靜態猝滅， 其二級結構發生改變. 在相同溫度下， Zein-異鼠李素-3-O-葡萄糖苷大于與Zein-異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的結合力. 通過計算機模擬揭示了兩種黃酮與Zein的最佳結合模式、 結合位點及兩種黃酮-Zein復合物體系的穩定性. 本文研究結果為進一步探討疏水性黃酮與Zein的相互作用提供了實驗依據.

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（責任編輯： 單 凝）