蓮須的抗氧化效果及作用機制

摘要： 通過網絡藥理學和分子對接技術， 研究蓮須抗氧化的分子機制， 并通過實驗體外驗證蓮須清除自由基的能力. 結果表明： 蓮須的抗氧化作用主要依賴于MAPKs信號通路和PI3K/AKT信號通路等生物過程調節； 蓮須對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH瘙簚）和羥基自由基（瘙簚OH）有一定的清除能力， 當質量濃度為0.8 mg/L時， 對DPPH瘙簚和瘙簚OH的清除率分別為83.6%和53.43%；高效液相色譜（HPLC）檢測發現蓮須中包含山奈酚、 木犀草素和槲皮素等黃酮類化合物發揮抗氧化作用.

關鍵詞：蓮須； 抗氧化； 抑菌劑； 網絡藥理學； 分子對接； 高效液相色譜分析

中圖分類號： Q819文獻標志碼： A文章編號： 1671-5489（2025）02-0638-09

Antioxidant Effect and Mechanism of Action for Stamen Nelumbinis

ZHANG Lei， YANG Yue， PAN Mingyue， XU Meng， LI Xiaoyu， WU Yuqi， LI Jinxu

（School of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157011， Heilongjiang Province， China）

收稿日期： 2024-03-28.

第一作者簡介： 張 蕾（1984—）， 女， 漢族， 博士， 副教授， 從事微生物與生化藥學的研究， E-mail：swxzlz@126.com.

通信作者簡介： 李金旭（1991—）， 男， 漢族， 講師， 從事生物化學的研究， E-mail： swxljx@126.com.

基金項目：黑龍江省基本科研業務費項目（批準號： 1453PT004; 1453QN028）、 黑龍江省自然科學基金（批準號： LH2022C100）和牡丹江師范學院項目（批準號： MNUQN202301; kjcx2023-119mdjnu）.

Abstract： We studied themolecular mechanism of antioxidative activity of stamen nelumbinis by network pharmacology and molecular docking technology，andverified the free radical scavenging ability of stamen nelumbinisthroughin vitro experiments. The results showthat the antioxidant effects of stamen nelumbinis mainly relies on the regulation of biological processes such as MAPKs signaling pathway and PI3K/AKT signaling pathway. The stamen nelumbinishas a certain ability to clear 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH瘙簚） and hydroxyl radical （瘙簚OH），and the scavenging rates of DPPH瘙簚 and瘙簚OH are 83.6% and 53.43%，respectively when the mass concentration is 0.8 mg/L. The high performance liquid chromatography （HPLC） detection reveals that the stamen nelumbiniscontains flavonoids such as kaempferol，lignans，and quercetin， which exert antioxidant effects.

Keywords： stamen nelumbinis;antioxidant;bacteriostatic agent;network pharmacology;molecular docking;high performance liquid chromatography analysis

蓮須（stamen nelumbinis）為睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo）植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥雄蕊， 分布于我國南北各省^[1]. 具有固腎澀精的功效， 常用于治療尿頻、 帶下、 遺精和滑精等癥. 研究表明， 蓮須富含黃酮類化合物， 在臨床上具有美白、 抗血栓和抗乙肝病毒等作用^[2-4]. 基于此， 本文通過網絡藥理學和分子對接技術研究蓮須的抗氧化活性及其作用機制， 為后續研究提供數據支持和科學依據.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

蓮須購于牡丹江大藥房； 各類有機試劑購于北京化工廠， 均為分析純試劑； 槲皮素標準品、 木犀草素標準品和山奈酚標準品購于貴州迪大生物科技有限公司. 2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）和SP-756P型紫外可見光光度計（上海光譜儀器有限公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 獲取蓮須有效成分及作用靶點

通過TCMSP數據庫^[5]獲取蓮須的候選成分. 根據口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18為條件篩選得到蓮須的有效成分^[6]. 在PubChem數據庫^[7]中以蓮須有效成分“Molecule name”進行檢索獲取有效成分結構， 將獲取結果導入Swiss TargetPrediction數據庫中獲取有效成分靶點.

1.2.2 獲取抗氧化點及共有靶點

以“Antioxidant”為關鍵詞， 在GeneCards數據庫^[8]中檢索， 獲得抗氧化靶點. 通過Venny2.1.0平臺， 將蓮須有效成分與抗氧化靶點繪制Venn圖， 分別得到蓮須-抗氧化共同靶點.

1.2.3 蓮須與抗氧化PPI網絡構建

通過STRING數據庫建立蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡， 將構建結果導入Cytoscape3.9.1軟件， 根據拓度值（degree）進行分析排序， 獲取核心靶點^[9].

1.2.4 GO功能與KEGG基因通路富集分析

將獲取的共同靶點導入Metascape數據庫進行Gene Oncology（GO）基因生物過程分析. 在Kobas3.0數據庫^[10]中導入共同靶點， 進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析. 將獲得的富集通路從小到大排序， 根據P≤0.05篩選前20條KEGG富集通路， 導入微生信平臺進行可視化分析.

1.2.5 分子對接驗證

參考文獻[7]， 分別選取PPI網絡中前10個核心靶點作為受體， 槲皮素、 山奈酚和木犀草素作為配體， 利用PDB，PubChem，Open Babel GUI，PyMol和AutoDock TooL 1.5.6等網站和軟件進行分子對接.

1.2.6 蓮須清除自由基效果鑒定

采用超聲法提取蓮須的有效成分. 提取條件為：體積分數為90%的乙醇溶液， 料液比（m（料）∶V（液））=1∶80 g/mL， 超聲功率為240 W， 超聲時間為4 h.

1） 蓮須提取物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH瘙簚）效果測定. 參照文獻[11]， 在波長517 nm下分別對0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的蓮須相提取液進行DPPH瘙簚清除效果測定.

2） 蓮須提取物對清除羥基自由基（瘙簚OH）效果測定. 參照文獻[12]， 在波長510 nm下， 分別對02，04，0.8，1.0 mg/mL 的蓮須相提取液進行瘙簚OH清除效果測定.

1.2.7 HPLC驗證

采用超聲法提取的蓮須相提取液， 用0.45 μm微孔濾膜過濾， 將濾液作為供試品. 分別取質量濃度為4，12，4 μg/mL的槲皮素、 山奈酚和木犀草素作為對照品.

色譜條件： 色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為V（乙腈）∶V（φ（磷酸）=0.1%）=55∶45； 流速為1.0 mL/min； 檢測波長為360 nm； 柱溫為室溫（25 ℃）； 進樣量為10 μL.

2 結果與分析

2.1 蓮須有效成分及作用靶點

經TCMSP數據庫收集和篩選， 得到蓮須中的3個有效成分， 分別為槲皮素、 山奈酚和木犀草素（表1）. 這3種有效成分均屬于黃酮類化合物， 黃酮類化合物具有良好的抗氧化效果. 利用Venny2.1.0軟件進行分析， 獲得蓮須與抗氧化作用共有靶點188個， 結果如圖1所示.

2.2 蓮須抗氧化PPI網絡構建結果

利用Cytoscape3.9.1軟件進行拓撲屬性分析，結果如圖2所示， 其中圓形越大、顏色越深表示degree數值越大. 由圖2可見，根據degree數值由大到小篩選出10個核心靶點， 分別為JUN，MAPK3，ESR1，MYC，HIF1A，FOS，MAPK1，AKT1，IL4和IL1B.

2.3 GO功能與KEGG基因通路富集分析結果

通過Metascape數據庫， 根據P值篩選出前20個生物通路， 結果如圖3所示. 由圖3可見， 蓮須抗氧化反應對異生物刺激的反應、 細胞對氮化合物的反應以及細胞對有機環狀化合物的反應相對較高， 表明蓮須的抗氧化效果可能由這3個生物過程發揮作用所致. 將由Kobas3.0數據庫篩選的富集數據進行整理， 并用微生信平臺繪制KEGG富集氣泡圖， 結果如圖4所示. 由圖4可見， 蓮須抗氧化主要涉及癌癥通道、 乙型肝炎和前列腺癌等這物過程.

2.4 分子對接驗證結果

選取核心靶點JUN，MAPK3，ESR1，MYC，HIF1A，FOS，MAPK1，AKT1，IL4和IL1B作為受體， 槲皮素、 山奈酚和木犀草素作為配體進行分子對接， 蓮須的主要活性成分與蛋白質最低結合能列于表2，關鍵靶點與活性部位的分子對接如圖5所示. 結合能越小， 說明配體與受體結合能力越強^[13]. 由表2和圖5可見： 槲皮素和FOS的結合力能力最強， 結合能為-9.3 kJ/mol； 山奈酚和ESR1的結合能力最強， 結合能為-8.2 kJ/mol； 木犀草素和FOS的結合能力最強， 結合能為-8.6 kJ/mol.

2.5 抗氧化實驗

蓮須對DPPH瘙簚和瘙簚OH有一定的清除能力， 清除效果如圖6所示. 由圖6可見， 蓮須在0.8 mg/L時清除DPPH瘙簚和瘙簚OH的能力最強， 最高清除率分別為83.6%和53.43%.

2.6 HPLC法驗證結果

用HPLC法繪制各種標準品的標準曲線分別為： 山奈酚 y=66 924x+20 981， R²=0.999 9； 木犀草素 y=18 746 713.632x-75 531.630，R² = 1.000； 槲皮素 y=11 309x+36 215， R²=0.999 4. 通過高效液相色譜法發現蓮須有效成分中含有黃酮類化合物山奈酚、 木犀草素和槲皮素， 結果如圖7所示.由圖7可見， 山奈酚、 木犀草素和槲皮素的保留時間分別為4.989，3.972，3.841 min.

2.7 討 論

自由基是人體內氧化反應過程中的中間代謝產物， 具有兩面性， 低水平的自由基可維持機體正常功能所需. 若自由基水平超過一定量， 多余的自由基會導致細胞死亡或功能異常， 加速機體衰老^[14]. 抗氧化劑可有效清除自由基^[15]， 延緩機體衰老. 因此開發高效、 低毒、 價廉的天然抗氧化劑非常重要. 蓮須藥用價值高， 為中醫常用中藥之一^[3]. 目前， 對蓮須抗氧化活性的研究逐漸深入， 但關于其具體的活性成分和機制尚未見文獻報道. 為進一步探究蓮須抗氧化應激的作用機制， 本文采用網絡藥理學、 分子對接技術、 體外抗氧化實驗以及HPLC檢測對其進行研究.

由生物信息學結果可知， 蓮須具有槲皮素、 山奈酚和木犀草素等有效成分， 基于蓮須抗氧化PPI網絡的構建， 識別出MAPK3，MAPK1和AKT1等核心靶點. GO功能分析與KEGG富集分析表明， 蓮須抗氧化可通過人體內多種通路協調實現. 其中， MAPKs和PI3K/AKT信號通路是人體內重要的生存信號通路， 在蓮須的抗氧化過程中起關鍵作用. 分子對接實驗結果表明， 槲皮素、 山奈酚和木犀草素與MAPK1，MAPK3和AKT1核心靶點均具有良好的對接活性^[16].

活性氧（ROS）是指在生物體內與氧代謝有關、 含氧自由基和易形成自由基的過氧化物總稱. 當ROS過量時， 會導致氧化系統和抗氧化系統之間的平衡關系紊亂， 進而發生氧化應激^[17]. 核因子E2相關因子2（Nrf2）是細胞對抗氧化應激的重要調控因子之一， 在ROS誘導的抗氧化蛋白表達中具有重要作用^[18]. 文獻[19]研究表明， Nrf2是AKT的靶蛋白之一， AKT或其上游PI3K抑制劑均可抑制Nrf2活性， 同時抑制ROS可抑制AKT的活性， 因此ROS可通過PI3K/AKT信號通路激活Nrf2， 以應對氧化應激對細胞產生的損傷； 文獻[20]研究表明， ROS，MAPK1和MAPK3能誘導MAPK通路活化， MAPK通路活化可使Nrf2磷酸化， 并促進Nrf2的核轉位或增加Nrf2的表達， 從而促進Nrf2的下游基因轉錄表達， 以應對氧化應激對細胞產生的損傷； 文獻[21-22]研究表明， 黃酮類化合物槲皮素、 山奈酚和木犀草素均高于維生素C的清除自由基能力， 具有較好的抗氧化效果； 文獻[23]研究表明， 槲皮素能有效抵抗缺氧導致的H9C2細胞損傷， 提高細胞抗氧化能力， 清除缺氧過程中產生的有害物質， 激活MAPK信號途徑， 發揮抗缺氧化對H9C2細胞損傷的作用. 通過對活性氧水平和脂質過氧化的降低， 以及CCl4處理大鼠肝臟中谷胱甘肽含量增加證明山奈酚可改善不平衡的氧化狀態. 服用山奈酚還可增強核因子E2相關因子（Nrf2）和血紅素加氧酶1蛋白的活化， 以及MAPK的磷酸化^[24]. 由于紫外線（UV）輻射可誘導DNA損傷， 引發氧化應激， 并導致皮膚光老化及光致癌現象， 而木犀草素能通過干擾MAPK通路抑制紫外線誘導的皮膚紅斑和人體皮膚上環氧酶-2、 前列腺素E2產生的上調， 因此木犀草素是UV吸收、 DNA保護劑以及抗氧化劑的集合體^[25].

瘙簚和瘙簚OH的清除率分別為83.6%，53.43%. HPLC檢測發現了蓮須有效成分中具有抗氧化能力的黃酮類化合物山奈酚、 木犀草素和槲皮素. 因此蓮須抗氧化通過多靶點、 多通路和多成分協同起效， 為后續抗氧化的研究提供了參考依據.

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（責任編輯： 單 凝）