復(fù)方芩柏顆粒通過調(diào)控Claudin-1表達(dá)及JAK2/STAT3 信號(hào)通路緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎

〔摘要〕 目的 探討復(fù)方芩柏顆粒在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）治療中的作用機(jī)制，研究其對(duì)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腸道黏膜屏障功能及Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路的調(diào)控作用。方法 采用2，4，6三硝基苯磺酸/乙醇灌腸法構(gòu)建C57B/L小鼠UC模型，隨機(jī)分為UC模型組、抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組；正常對(duì)照組小鼠灌腸等體積生理鹽水，每組6只。通過HE染色法觀察結(jié)腸組織病理?yè)p傷情況，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)密封蛋白-1（Claudin-1）蛋白表達(dá)水平，ELISA法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）等氧化應(yīng)激相關(guān)因子以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-6、IL-10、IL-12、IL-4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等炎癥因子水平，RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)Claudin-1、JAK2、STAT3 mRNA與蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，UC模型組CMDI、DAI值，MDA、TNF-α、IL-6、IL-12含量，JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量均升高（Plt;0.05）；SOD活性，CAT、GSH、IL-10、TGF-β、IL-4含量，Claudin-1表達(dá)水平均降低（Plt;0.05）。與UC模型組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組CMDI、DAI值，MDA、TNF-α、IL-6、IL-12含量，JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量均降低（Plt;0.05）；SOD活性，CAT、GSH、IL-10、TGF-β、IL-4含量，Claudin-1表達(dá)水平均升高（Plt;0.05）。結(jié)論 復(fù)方芩柏顆粒通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和腸道屏障功能，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，從而治療UC。

〔關(guān)鍵詞〕 潰瘍性結(jié)腸炎；JAK2/STAT3信號(hào)通路；氧化應(yīng)激；炎癥；腸道黏膜屏障功能

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.004

Compound Qinbai Granule relieving ulcerative colitis in mice by regulating Claudin-1 expression and JAK2/STAT3 signaling pathway

WANG Xiaoyan， XIAO Chao， WANG Zhenquan， XIAO You*

The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of action of Compound Qinbai Granule （CQBG） in treating ulcerative colitis （UC） and to study its regulatory effects on inflammatory response， oxidative stress， intestinal mucosal barrier function， and Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway. Methods The UC model of C57B/L mice was established by 2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid/ethanol enema method and the mice were randomly divided into normal control， UC model， inhibitor， olsalazine， and CQBG groups. Mice in the normal control group received an enema of saline of equal volume. Each group consisted of six mice. The pathological damage of colon tissue was observed by HE staining， the protein expression level of Claudin-1 was determined by immunohistochemical staining， and the levels of oxidative stress-related factors such as superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， and malondialdehyde （MDA）， as well as inflammatory factors including tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6， IL-10， IL-12， and transforming growth factor-β （TGF-β）， were measured by ELISA. The mRNA and protein expression of Claudin-1， JAK2， and STAT3 were determined by RT-qPCR and Western blot， respectively. Results Compared with the normal control group， the CMDI and DAI scores， the levels of MDA， TNF-α， IL-6， and IL-12， the relative expression levels of JAK2 and STAT3 mRNA， and the protein expression levels of p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 in the UC model group increased （Plt;0.05）， while the SOD activity， the levels of CAT， GSH， IL-10， TGF-β， and IL-4， the protein and mRNA expression levels of Claudin-1， and the protein expression level of Claudin-1 in the UC model group decreased （Plt;0.05）. Compared with the UC model group， the CMDI and DAI scores， the levels of MDA， TNF-α， IL-6， and IL-12， the relative expressions of JAK2 and STAT3 mRNA， and the protein expressions of p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 in the inhibitor， olsalazine， and CQBG groups decreased （Plt;0.05）， while the SOD activity， the levels of CAT， GSH， IL-10， TGF-β， and IL-4， and the protein and mRNA expression levels of Claudin-1 increased （Plt;0.05）. Conclusion CQBG can treat UC by regulating oxidative stress， inflammatory response and intestinal barrier function， and inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ulcerative colitis; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway; oxidative stress; inflammation; intestinal mucosal barrier function

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）是一種頑固且易復(fù)發(fā)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為局部潰瘍和結(jié)腸慢性炎癥[1]，治療以促進(jìn)黏膜愈合、改善患者生活質(zhì)量、預(yù)防并發(fā)癥為主[2]。目前，治療方法包括5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等[3]。然而，這些藥物存在臨床療效有限、毒副作用顯著和耐藥性等問題。因此，具有較少毒副作用且能調(diào)節(jié)腸道平衡的中藥逐漸引起關(guān)注[4]。

從中醫(yī)學(xué)角度分析，UC的病機(jī)特點(diǎn)為濕熱、氣滯、血瘀，這些病機(jī)在西醫(yī)中分別對(duì)應(yīng)腸道炎癥反應(yīng)、腸動(dòng)力異常及局部血液循環(huán)障礙的病理過程[5]。現(xiàn)代研究表明，濕熱病機(jī)對(duì)應(yīng)于炎癥反應(yīng)的過度激活，包括免疫失衡和氧化應(yīng)激增強(qiáng)等病理過程；氣滯病機(jī)與腸神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常及腸動(dòng)力障礙有關(guān)；血瘀病機(jī)則反映了腸道局部缺血缺氧狀態(tài)及微循環(huán)功能紊亂[6]。上述病理機(jī)制最終可導(dǎo)致腸道屏障功能受損、腸道上皮組織通透性增加，并加重腸道細(xì)菌移位及炎癥損傷。

復(fù)方芩柏顆粒由《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》中“止痛如神湯”化裁而來，由黃芩、黃柏、延胡索、檳榔、當(dāng)歸、桃仁、生地黃、防風(fēng)、秦艽、澤瀉、大黃11味中藥組成。方中黃芩、黃柏味苦，性寒，入大腸經(jīng)，功擅清熱燥濕、瀉火解毒，為君藥；延胡索、檳榔行氣活血止痛，當(dāng)歸、桃仁活血祛瘀，體現(xiàn)了“調(diào)氣則后重自除，行血?jiǎng)t便膿自愈”之義，配以生地黃涼血止血，防風(fēng)、秦艽勝濕止痛，澤瀉利水滲濕，合為臣藥；大黃瀉火解毒，導(dǎo)熱外出，歸大腸經(jīng)，并可涼血祛瘀，為佐使藥。諸藥合用，共奏清熱燥濕、行氣活血、止血鎮(zhèn)痛之功，故下痢可愈。復(fù)方芩柏顆粒及其制備工藝已于2000年獲得中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)專利（專利號(hào)ZL941131149）[7]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芩柏顆粒具有抗炎、解毒、抗氧化作用[8]，且臨床療效顯著[9-11]。然而，該藥物的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明，尤其是其與腸道屏障修復(fù)的相互作用仍不明確。本研究聚焦于復(fù)方芩柏顆粒在Janus激酶2（janus kinase 2， JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）通路調(diào)控中的作用，探索其在多機(jī)制協(xié)同改善UC方面的潛力，為開發(fā)更安全、高效的治療方案提供新視角。

1 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只SPF級(jí)C57B/L小鼠購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，年齡為6～8周齡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：CXK（鄂）2020-0018。本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由課題組自行繁殖并鑒定后飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度控制在（22±2） ℃，相對(duì)濕度50%，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水，晝夜12 h交替光照。研究方案已獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：LL2022110818）。

1.2" 主要藥物與試劑

復(fù)方芩柏顆粒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制備，按傳統(tǒng)中藥配方加工而成。其組方包括黃芩10 g，黃柏10 g，秦艽6 g，桃仁6 g，防風(fēng)6 g，澤瀉10 g，當(dāng)歸8 g，大黃6 g，延胡索10 g，生地黃12 g，檳榔6 g。

AG490（上海雅吉生物科技有限公司，規(guī)格：60 g/4 g，批號(hào)：H20100253）；奧沙拉嗪（MCE中國(guó)，規(guī)格：1 mg，批號(hào)：62106431）；小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、小鼠丙二醛（malondialdehyde， MDA）、過氧化氫酶（catalase， CAT）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）ELISA試劑盒、小鼠炎癥因子檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20231203、20231102、20231201、20240103、20231214）；SynScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（含gDNA去除劑）（北京擎科生物科技股份有限公司，批號(hào)：TSP413）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HE染色試劑盒（上海碧云天生物公司，批號(hào)：092221220307、232221220307）。抗密封蛋白-1（anti-claudin-1）抗體（批號(hào)：3436016-2），p-JAK2抗體（批號(hào)：3313371-2），JAK2抗體（批號(hào)：113430-1），p-STAT3抗體（批號(hào)：1265430-2），STAT3抗體（批號(hào)：26741571-1）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3" 主要儀器

MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀（上海Thermo Fisher Scientific公司）；EnVision型全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司）；QuantStudioTM 5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（上海Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4" 模型構(gòu)建及分組

將30只小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分為正常對(duì)照組、UC模型組、抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組。抑制劑組在造模前0.5 h腹腔注射AG490（5 mg/kg，2次/d）。

參考MORRIS等[12]的方法，除正常對(duì)照組外，其他組的小鼠按100 mg/kg劑量灌腸給予2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid， TNBS）/乙醇混合液（5～30 mg TNBS溶于0.25 mL 50%乙醇），正常對(duì)照組小鼠灌腸等體積生理鹽水。灌腸后提起小鼠尾部倒置10 min，以確保造模劑充分滲透腸腔。隨后將小鼠仰臥放回籠中，在保溫?zé)粝抡丈渲撂K醒，自由進(jìn)食。造模劑量根據(jù)動(dòng)物與人等效劑量換算后確定[12]。實(shí)驗(yàn)開始前，隨機(jī)抽取2只造模小鼠，頸椎脫位處死，取其結(jié)腸組織進(jìn)行病理檢查。觀察到充血、水腫及潰瘍等典型UC病理變化，則視為造模成功[13]。造模成功后，正常對(duì)照組和UC模型組小鼠繼續(xù)灌腸給予生理鹽水。根據(jù)動(dòng)物與臨床用藥劑量的轉(zhuǎn)換系數(shù)[14]，抑制劑組、復(fù)方芩柏顆粒組[4.8 g/（kg·d）]和奧沙拉嗪組[0.4 g/（kg·d）]小鼠按相應(yīng)劑量給藥，2次/d，持續(xù)干預(yù)3周。

1.5" 一般行為學(xué)觀察

每日監(jiān)測(cè)小鼠的體色、活動(dòng)狀態(tài)、糞便形態(tài)及體質(zhì)量變化。觀察疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），根據(jù)體質(zhì)量變化、糞便外觀、血便程度由輕至重分別賦0、1、2、3分[15]。DAI值為上述3項(xiàng)評(píng)分總和。

1.6" 結(jié)腸黏膜病理學(xué)評(píng)估

將小鼠處死后，迅速打開腹腔，取出結(jié)腸，生理鹽水沖洗，去除腸腔內(nèi)容物。沿腸系膜一側(cè)縱向剪開結(jié)腸，平鋪于干凈的操作臺(tái)上，肉眼觀察并記錄結(jié)腸黏膜的外觀變化。結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa

damage index， CMDI）按照結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍、結(jié)腸損傷程度由輕至重分別賦0、1、2、3分[15]，CMDI為上述各項(xiàng)評(píng)分總和。

1.7" HE染色

從距肛門約3 cm處獲取小鼠結(jié)腸組織樣本，并固定于4%多聚甲醛溶液中以維持組織結(jié)構(gòu)。樣本經(jīng)過乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水處理。脫水后，將組織包埋并切成5 μm厚的切片，使用HE染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。具體步驟：蘇木精染色，隨后以伊紅染色50 s；切片經(jīng)95%和100%乙醇梯度脫水后，用二甲苯透明化；最后進(jìn)行封片。染色完成后，切片在顯微鏡下觀察并采集圖像，用于進(jìn)一步的組織學(xué)分析。

1.8" 免疫組織化學(xué)染色

制備的組織切片先在二甲苯中脫蠟，隨后經(jīng)梯度乙醇系列重新水化。水化后的切片經(jīng)高溫抗原修復(fù)，冷卻后用3% H2O2溶液孵育以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。切片在室溫下用5% BSA封閉40 min，以減少非特異性結(jié)合。將切片置于Claudin-1一抗溶液中（稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃過夜孵育。一抗孵育后，切片經(jīng)PBS沖洗，隨后在室溫下用二抗孵育1 h。切片顯色完成后，采用盲法半定量分析免疫組織化學(xué)結(jié)果，并記錄其表達(dá)水平。

1.9" ELISA法

將結(jié)腸組織按1∶100比例制備勻漿，4 ℃以12 000 r/min離心20 min，收集上清液。依據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定上清液中炎癥因子[腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-4、IL-12、IL-10]及氧化應(yīng)激相關(guān)因子（SOD、CAT、GSH、MDA）的濃度。結(jié)果以每組樣本的平均值表示，用于后續(xù)分析。

1.10" RT-qPCR檢測(cè)

按照說明書，從結(jié)腸組織樣本中提取總RNA，使用RNA提取試劑盒完成操作。提取的RNA經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)后，使用FastQuant RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，采用SYBR Green染料的RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平。引物序列詳見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量分析。

1.11" Western blot檢測(cè)

使用總蛋白提取試劑盒從樣品中提取總蛋白，并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量分析。將25 μg蛋白樣品通過10% SDS-PAGE電泳分離。電泳完成后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在轉(zhuǎn)膜后，使用5%脫脂奶粉溶液在TBST緩沖液中，于37 ℃封閉1.5 h以阻斷非特異性結(jié)合。將膜置于Clau？鄄din-1抗體、p-JAK2抗體、JAK2抗體、p-STAT3抗體、STAT3抗體（1∶200）溶液中，于4 ℃孵育過夜。使用HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1.5 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影檢測(cè)蛋白條帶，并記錄結(jié)果。

1.12" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和制圖采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 6.0軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“ｘ±s”表示。對(duì)于連續(xù)測(cè)量數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行總體比較。對(duì)于多組間的差異分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD和Dunnett T3檢驗(yàn)；而偏態(tài)分布數(shù)據(jù)通過Krus？鄄kal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對(duì)于兩組間數(shù)據(jù)的比較，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，而偏態(tài)分布數(shù)據(jù)則使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組小鼠一般情況比較

正常對(duì)照組的小鼠毛發(fā)光滑、精神狀態(tài)良好、反應(yīng)敏捷、飲食正常、糞便呈球狀或長(zhǎng)條狀、體質(zhì)量逐漸增加。UC模型組小鼠從造模第3天開始出現(xiàn)稀薄糞便，并在隱血試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，部分小鼠伴有肉眼可見的血便、精神萎靡和體質(zhì)量下降。抑制劑組小鼠在灌腸給藥12 d后，精神狀態(tài)有所改善，糞便由稀薄轉(zhuǎn)為糊狀，但體質(zhì)量無增加。奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組小鼠給藥5 d后，糞便逐漸從稀薄變?yōu)楹隣睿駹顩r明顯改善，體質(zhì)量有所增加，其中復(fù)方芩柏顆粒組的改善效果尤為顯著。

2.2" 各組小鼠結(jié)腸黏膜大體情況比較

正常對(duì)照組小鼠的結(jié)腸黏膜表面光滑，呈淡紅色，無充血、水腫或糜爛潰瘍的現(xiàn)象。UC模型組小鼠的結(jié)腸黏膜出現(xiàn)明顯充血和水腫，并伴有潰瘍形成，潰瘍大小不一，主要集中于黏膜層和黏膜下層。抑制劑組小鼠的結(jié)腸黏膜表現(xiàn)為充血、水腫，中度糜爛。奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組小鼠的結(jié)腸黏膜未見明顯充血、水腫和糜爛，表現(xiàn)接近正常狀態(tài)。詳見圖1。

與正常對(duì)照組相比，UC模型組的CMDI和DAI評(píng)分升高（Plt;0.05）；與UC模型組相比，抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組的CMDI和DAI評(píng)分均降低（Plt;0.05）；與抑制劑組、奧沙拉嗪組比較，復(fù)方芩柏顆粒組DAI評(píng)分均降低（Plt;0.05）。詳見表2。

2.3" 各組小鼠結(jié)腸黏膜病理情況比較

正常對(duì)照組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層上皮保持完好，腸腺豐富且排列緊密，無明顯的炎癥反應(yīng)或結(jié)構(gòu)破壞。UC模型組小鼠的結(jié)腸組織中可見大面積潰瘍，表現(xiàn)為黏膜上皮細(xì)胞的大量丟失、腸腺結(jié)構(gòu)消失、杯狀細(xì)胞顯著減少，并伴有結(jié)締組織增生及少量血管充血，組織損傷深度達(dá)黏膜下層，并在黏膜層及黏膜下層觀察到大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。抑制劑組小鼠的結(jié)腸組織中雖然黏膜層受損，局部腸腺結(jié)構(gòu)丟失且伴有結(jié)締組織增生，但炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，且組織損傷未侵及黏膜下層。奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組的小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層上皮保持完好，腸腺豐富且排列緊密，細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯的炎癥反應(yīng)或結(jié)構(gòu)破壞。詳見圖2。

2.4" 各組小鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)因子比較

與正常對(duì)照組相比，UC模型組的SOD活性、CAT和GSH含量降低（Plt;0.05），而MDA含量升高（Plt;0.05）。與UC模型組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組的SOD活性、CAT和GSH含量升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。與抑制劑組相比，復(fù)方芩柏顆粒組SOD活性、CAT和GSH含量升高（Plt;0.05），MDA含量降低（Plt;0.05）。詳見表3。

2.5" 各組小鼠炎癥因子水平比較

與正常對(duì)照組相比，UC模型組TNF-α、IL-6、IL-12含量升高（Plt;0.05），IL-10、TGF-β、IL-4含量降低（Plt;0.05）；與UC模型組相比，抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組TNF-α、IL-6、IL-12含量降低（Plt;0.05），IL-10、TGF-β、IL-4含量升高（Plt;0.05）；與抑制劑組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組TNF-α、IL-6、IL-12含量降低（Plt;0.05），IL-10、TGF-β、IL-4含量升高（Plt;0.05）；與奧沙拉嗪組相比，復(fù)方芩柏顆粒組TNF-α、IL-6、IL-12含量降低（Plt;0.05），IL-10、TGF-β、IL-4含量升高（Plt;0.05）。詳見表4。

2.6" 各組小鼠Claudin-1表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組相比，UC模型組Claudin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與UC模型組相比，抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（Plt;0.05）；與抑制劑組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1的蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05），復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1 mRNA表達(dá)水平升高（Plt;0.05）。詳見圖3、表5。

2.7" 各組小鼠JAK2/STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組相比，UC模型組JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與UC模型組相比，抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與抑制劑組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組JAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），復(fù)方芩柏顆粒組STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與奧沙拉嗪組相比，復(fù)方芩柏顆粒組JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。詳見表6。

2.8" 各組小鼠Claudin-1、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組相比，UC模型組Claudin-1蛋白表達(dá)量降低（Plt;0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量升高（Plt;0.05）；與UC模型組相比，抑制劑組、奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1蛋白表達(dá)量升高（Plt;0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量降低（Plt;0.05）；與抑制劑組相比，奧沙拉嗪組和復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1蛋白表達(dá)量升高（Plt;0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量降低（Plt;0.05）；與奧沙拉嗪組相比，復(fù)方芩柏顆粒組Claudin-1蛋白表達(dá)量升高（Plt;0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)量降低（Plt;0.05）。詳見圖4、表7。

3 討論

復(fù)方芩柏顆粒具有清熱燥濕、行氣活血、止血鎮(zhèn)痛之效，臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其可有效緩解UC癥狀[9-11]。在本研究中，復(fù)方芩柏顆粒組在改善UC模型小鼠的臨床癥狀、結(jié)腸黏膜完整性以及病理?yè)p傷方面具有良好療效，且優(yōu)于奧沙拉嗪組和抑制劑組。BERG等[16]發(fā)現(xiàn)黏液層的喪失使微生物群更容易附著在上皮細(xì)胞上，從而加速細(xì)菌移位。復(fù)方芩柏顆粒中的黃芩苷可有效抑制腸道細(xì)菌侵入及其向腸系膜淋巴結(jié)和脾臟的移位[17]，其可能通過減少細(xì)菌侵入和移位，從而顯著改善腸道屏障功能。

從中醫(yī)學(xué)角度分析，UC的發(fā)病本質(zhì)體現(xiàn)了正虛邪實(shí)并存的特點(diǎn)，濕熱之邪損傷腸道黏膜，導(dǎo)致腑氣不通、腑氣失司，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的協(xié)同作用機(jī)制相對(duì)應(yīng)[18-19]。UC發(fā)病過程中，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的正反饋環(huán)路，加重了UC病程進(jìn)展[20-21]。此外，炎癥因子通過破壞緊密連接蛋白（如Claudin-1、Occludin）的表達(dá)，增加腸道通透性，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位[22]。本研究中，復(fù)方芩柏顆粒抑制了UC模型小鼠中促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-12）的水平，上調(diào)抗炎因子（IL-10、TGF-β、IL-4）的表達(dá)。此外，復(fù)方芩柏顆粒還有效緩解了小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并調(diào)控了腸道組織中Claudin-1的表達(dá)。這與復(fù)方芩柏顆粒清熱燥濕、行氣活血、止血鎮(zhèn)痛的的中醫(yī)理論相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了其通過多機(jī)制協(xié)同作用在緩解UC中的重要潛力。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是調(diào)控炎癥的重要途徑，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、募集及激活[21]。巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)與該通路密切相關(guān)，JAK2/STAT3通過信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，調(diào)節(jié)M1型和M2型巨噬細(xì)胞的分化[22-23]。作為該通路的核心調(diào)控因子，過度激活的STAT3不僅促進(jìn)促炎因子的表達(dá)，還通過誘導(dǎo)IL-6的過量分泌形成正反饋循環(huán)，加劇慢性炎癥狀態(tài)[24]。在UC中，這一反饋機(jī)制可能進(jìn)一步增強(qiáng)JAK2/STAT3信號(hào)強(qiáng)度，導(dǎo)致炎癥失控[25]。阻斷JAK2/STAT3通路能夠有效調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并減輕腸道慢性炎癥[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芩柏顆粒能夠通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路緩解UC引起的腸道損傷。賀荔枝等[27]研究表明，復(fù)方芩柏顆粒可通過上調(diào)結(jié)腸組織中水通道蛋白4和水通道蛋白8的表達(dá)，減輕腸道屏障受損。此外，復(fù)方芩柏顆粒還能夠調(diào)控絲裂原激活蛋白激酶等信號(hào)通路，從而緩解腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[28]。同時(shí)，其能夠降低UC大鼠血清中的IL-2R表達(dá)及IgG含量，改善免疫反應(yīng)[29]。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了復(fù)方芩柏顆粒在UC治療中的多靶點(diǎn)、多機(jī)制作用特點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

近年來，JAK抑制劑（如托法替布和烏帕替布）作為UC治療的靶向藥，顯示出抗炎效果，但其單一靶點(diǎn)機(jī)制導(dǎo)致了較高的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，如感染、血脂異常和血栓形成[30]。本研究中，復(fù)方芩柏顆粒展現(xiàn)了多機(jī)制協(xié)同作用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，既抑制了JAK2/STAT3通路，又通過抗氧化和腸道屏障修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)了更全面的治療效果。與JAK抑制劑相比，復(fù)方芩柏顆粒的另一個(gè)重要特點(diǎn)是其較低的毒副作用風(fēng)險(xiǎn)。本研究和既往研究均未發(fā)現(xiàn)復(fù)方芩柏顆粒引起的不良反應(yīng)（如感染或代謝紊亂）。其通過多組學(xué)、多靶點(diǎn)特性整體調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，減少特定靶點(diǎn)抑制劑可能導(dǎo)致的系統(tǒng)性不良反應(yīng)[31]。盡管JAK抑制劑在中重度UC患者中表現(xiàn)出較好的療效，但復(fù)方芩柏顆粒通過多靶點(diǎn)、多機(jī)制的協(xié)同作用，可能成為JAK抑制劑的有益補(bǔ)充，尤其是對(duì)于無法耐受JAK抑制劑治療的患者或需要聯(lián)合治療的復(fù)雜病例。

本研究表明，復(fù)方芩柏顆粒通過多機(jī)制緩解UC相關(guān)的腸道損傷。具體而言，其通過調(diào)節(jié)Claudin-1表達(dá)增強(qiáng)腸道屏障功能，并抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，降低炎癥因子和氧化應(yīng)激水平，從而改善UC小鼠的病理表現(xiàn)。故復(fù)方芩柏顆粒的多層次調(diào)控機(jī)制為開發(fā)更有效的UC治療方案提供了新思路和依據(jù)。

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