利用寡核苷酸探針鑒定西瓜染色體易位系及染色體易位系的應用

摘" " "要：易位是一種常見的染色體變異類型，為了進一步研究西瓜染色體易位，方便染色體易位系的鑒定，基于G42西瓜基因組開發出了一套共計20 350個寡核苷酸探針，在11條染色體上每kb區間的平均密度為0.42～2.86個oligos。以西瓜染色體易位自交系G59為試驗材料，利用該套探針鑒定出G59 的Chr 6和Chr10染色體部分片段發生交換易位。通過觀察花粉及調查單瓜種子數量，發現G59花粉形態正常，不育花粉占比4.28%，單瓜種子數量212.33粒，與普通西瓜自交系G33、G37、G42無顯著差異。而G59 與G33、G37、G42配制的易位雜交組合圣嘉1號、蘇夢15、蘇夢17不育或畸形花粉占比分別為54.17%、46.52%、43.66%，極顯著高于雙親，單瓜種子數量65～81粒，極顯著少于雙親和蘇夢5號等正常雜交種。本研究開發的寡核苷酸探針可用于西瓜染色體易位系的鑒定，創制的染色體易位自交系G59為西瓜染色體易位系的利用及易位少籽西瓜品種的選育奠定了基礎。

關鍵詞：西瓜；染色體易位；寡核苷酸探針；易位少籽雜交組合

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）03-037-08

Identification of watermelon chromosome translocation lines using oligonucleotide probes and their application

XU Binghua1， ZHAO Qinzheng2， GU Yan1， HUANG Dayue1， CHENG Rui1， LIU Xin1， ZHANG Chaoyang1， XU Wenzhao1， SUN Yudong1

（1. Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu， Huai’an 223001， Jiangsu， China; 2. College of Horticulture， Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： In order to further study the chromosomal translocation lines of watermelon， and facilitate the identification. G59 which was a watermelon chromosome translocation line obtained by using independent selection was used as the test material in this study. A total of 20 350 oligonucleotide probes were developed based on the G42 watermelon genome， with an average density of 0.42-2.86 oligos/kb on 11 chromosomes. This set of probes were used to identify the chromosome translocation of G59. The non-denaturing in situ hybridization （ND-FISH）results showed that there was an exchange translocation of chromosomes 6 and 10. The pollen morphology by Alexander's staining solution under microscope was observed and the number of seeds in single watermelon was investigated. The pollen of G59 was normal morphology， and the percentage of sterile pollen was about 4.28%， and the number of seeds in single watermelon was about 212.33. There was no significant difference between G59 and common self-inbreeding lines G33， G37 and G42. The percentage of sterile or deformed pollen in the hybrid combinations Shengjia No. 1， Sumeng No. 15， Sumeng No. 17 were 54.17%， 46.52%， and 43.66%， respectively， which were extremely significantly higher than both parents. The number of single fruit seeds of Shengjia No. 1， Sumeng No. 15， Sumeng No. 17 was about 65-80， extremely significantly less than that of both parents and normal hybrid generation varieties such as Sumeng 5. The oligonucleotide probe developed in this study can be used for the identification of chromosomal translocation lines in watermelon， and the chromosomal translocation inbred line G59 can be used for the breeding of translocated watermelon varieties with few seeds.

Key words： Watermelon; Chromosome translocation line; Oligonucleotide probe; Translocation hybridization cultivar

西瓜（Citrullus lanatus）屬葫蘆科西瓜屬一年生蔓生藤本植物，是夏季水果之王，風味獨特，營養豐富，深受消費者喜愛。隨著人們生活水平的提高，消費者對西瓜的關注不僅是品質、外觀等，對果實內種子的多少也逐漸關注，尤其上海、廣州等地區喜歡吃無籽或少籽西瓜，少籽或無籽逐漸成為優質西瓜的一個重要指標[1]。

目前市場上多為植物生長調節劑產生的少籽或三倍體無籽西瓜，然而植物生長調節劑少籽（無籽）西瓜存在食品安全爭議，三倍體無籽西瓜生產中因種子發芽率低、成苗率低及坐果率低等“三低”問題[2-3]，生產成本高，大面積推廣種植具有一定的局限性。前人研究表明，利用染色體易位系配制的二倍體雜種一代種子少，且少籽性狀穩定[4]，栽培管理同普通二倍體西瓜，不存在種子發芽率低、成苗率低、種子生產成本高等問題[5]，可實現大面積的推廣應用。朝井小太郎等[6]利用Co60γ射線輻照干種子，通過觀察花粉育性及染色體鑒定篩選出系列染色體易位系。王鳴等[7]利用 Co60γ 射線對旭大和干種子多次照射，育出了一批雜合易位少籽西瓜品系，其種子較普通二倍體減少50%～80%，種子數量最少的單瓜中僅含十余粒種子。

筆者利用自主選育的骨干自交系G38與易位少籽品種津花4號雜交，轉育獲得了純合的染色體易位自交系G59。鑒于G59的染色體易位發生方式尚未解析，筆者首次開發了一套寡核苷酸探針，利用該探針準確鑒定G59染色體易位發生的數量及位置，為西瓜染色體易位系的鑒定和易位少籽西瓜育種提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

利用江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所設施蔬菜創新團隊前期從天津市蔬菜研究所引進的易位少籽品種津花4號，與自有西瓜骨干自交系G38雜交，觀察F1代花粉為半敗育，后代自交選育7代，獲得了純合易位自交系G59。2022年以G59為父本，與江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所選育的常規育種自交系G33、G42、G37雜交，配制易位雜交組合圣嘉1號（G42×G59）、蘇夢15（G33×G59）、蘇夢17（G37×G59）。以自交系G33、G42、G37 及常規雜交品種蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號作為對照，觀察花粉及果實性狀等。各試驗材料特征特性及來源詳見表1。

試驗材料G59、G33、G42、G37、圣嘉1號、蘇夢15、蘇夢17、蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號于2024年3－6月種植在江蘇省淮安市清江浦區淮安市農科院科研創新基地，2024年3月1日播種，72孔穴盤育苗，4月7日定植，株行距40 cm×100 cm，每小區定植20株，3次重復，完全隨機區組排列，單蔓整枝，第2～3雌花人工授粉，留1果。

1.2 方法

1.2.1 基于西瓜基因組的寡核苷酸探針的開發 2023年6月參考Bi等[8]開發Oligo-painting 探針，首先利用RepeatMasker 軟件屏蔽西瓜基因組G42版本中的重復序列，利用 Chorus2 軟件以長度 47 nt和步移10 nt為參數進行oligo的篩選，將每個oligo再比對到基因組參考序列，去除相似性gt;75%及錨定多個位置的重復oligos，最終獲得單拷貝特異的oligos池。為驗證易位染色體，在每個西瓜染色體長臂和短臂的近端粒區域篩選oligos，共計選擇了20 350個寡核苷酸。為區分染色體特異的oligo池，在每個oligo兩翼添加染色體特異的擴增引物序列W1～W22，總文庫由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

Oligo探針合成參考Bi等[8]和Zhao等[9]的方法，以總文庫為模板，使用TAMRA或FAM修飾的W1～W22引物進行常規PCR擴增，50 μL PCR混合液為：25 μL HiFi HotStart ReadyMix（KAPA， Kit Code， KK2601）、1 μL TAMRA或FAM標記的W正向引物、1 μL TAMRA或FAM標記的W反向引物、0.4 ng文庫模板、補足 ddH2O。PCR程序與Bi等[8]的描述一致。PCR產物經GeneJET PCR Purification Kit（Thermo Scientific， Kit Code， K0702）純化后，可得到每條染色體特異的ds-oligos探針。

1.2.2 根尖有絲分裂中期染色體制片 參照Lou[10]的方法，2023年9月進行根尖有絲分裂中期染色體制片。將G59種子在50 ℃溫水中浸泡20 min后置于墊有濕潤濾紙的培養皿中，28～30 ℃恒溫培養箱中催芽，待根尖長至1～2 cm時取根，將根尖置于2 mmol·L-1 的 8-羥基喹啉中，15～20 ℃暗處理90 min，然后用蒸餾水清洗3次，再靜置5 min，使染色體分散，使用改良版卡諾固定液（甲醇、冰醋酸體積比= 3∶1）在4 ℃固定24 h待用。切取根尖前部分生區，用蒸餾水洗滌3～4次除去固定液，然后置于1.5 mL離心管中，加入酶混合液，將其放入金屬浴中37 ℃酶解40～60 min，其間注意觀察酶解狀態，避免酶解不足或過分酶解，酶解結束后倒掉酶解液并加入蒸餾水，使其細胞漲破釋放染色體，5～10 min后加入固定液保存待用，使用火焰干燥法進行染色體制片，利用顯微鏡觀察并篩選染色體分裂相良好的片子，保存備用。

1.2.3 根尖有絲分裂中期的ND-FISH鑒定 原位雜交程序參照趙勤政[11]描述的方法：DFA 10 μL、2×SSC 2 μL、oligo探針2 μL、10%硫酸葡聚糖4 μL，混合均勻后置于金屬浴90 ℃變性6 min，然后置于4 ℃冷卻；將預備好的載玻片用70%去離子甲酰胺覆蓋，并于80 ℃雜交儀中變性90 s，依次放入70%、90%、100%乙醇中梯度脫水各5 min，晾干后的載玻片滴加雜交混合液，蓋上蓋玻片，在37 ℃雜交儀中過夜處理。第2天取出載玻片，在蒸餾水中浸泡直至蓋玻片脫落；在黑暗條件下放入2×SSC洗脫液中，搖晃脫色洗滌5 min，轉入42～44 ℃的2×SSC 洗脫液中繼續搖晃洗滌10 min，再轉入常溫2×SSC洗脫液中搖晃洗滌5 min，最后用蒸餾水清洗3 min，置于70%、90%、100%乙醇中進行梯度脫水各5 min，晾干后滴加15 μL的DAPI 溶液復染封片，通過 Olympus BX51 熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 花粉活力觀察 在開花期，于上午09：00左右采集G59、G33、G42、G37、圣嘉1號、蘇夢15、蘇夢17當天開放的雄花，利用Alexander染色法檢測花粉育性，用小毛筆分別掃下每份材料的花粉于載玻片上，滴1滴Alexander染色液，混合均勻，蓋上載玻片，染色5～10 min，吸去多余液體，在顯微鏡（徠卡DM500）下觀察并拍照，可育花粉為紅色，不育花粉為綠色，統計每個視野可育及不育花粉數量，每朵花統計3個視野，計算不育花粉粒的百分比，每個小區調查3朵花。不育花粉占比/%=不育花粉數量/總花粉數量×100。

1.2.5 性狀及種子數量調查 2024年6月20日采收成熟的西瓜，調查易位系G59，常規自交系G33、G42、G37，易位雜交組合圣嘉1號、蘇夢15、蘇夢17，常規雜交種蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號的單果質量、中心可溶性固形物含量、單瓜種子數量。采用手持糖度計（日本ATAGO，MASTER-20M）測量中心可溶性固形物含量，采用電子秤（中國 凱豐）稱取單瓜質量，取出瓜中種子，計算平均單瓜種子數，每個小區調查3個商品瓜。

1.3 數據分析

采用Excel 2007 進行數據統計與分析，采用Duncan’s法檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 西瓜寡核苷酸探針的開發及G59的oligo-FISH

為驗證G59的核型變異，使用G42參考基因組開發了oligo-FISH探針池，從每條染色體的短臂和長臂近端粒區域篩選了2個各包含925個oligos的區域，總計有11條染色體獲得了20 350個oligos，平均密度為0.42～2.86個·kb-1（表2）。

分別利用TAMRA（紅色）或FAM（綠色）熒光基團標記11條西瓜染色體探針。首先，將Chr1-Chr2組合的探針池雜交到G59中期染色體上，如圖1-a，每個探針都產生明亮FISH信號，且位于每條染色體的短臂和長臂末端。因此，將Chr3-Chr4、Chr5-Chr6、Chr7-Chr8、Chr9-Chr10、Chr11探針池分別雜交到對應的染色體上，每個探針池都產生非常明亮的信號，表明核型染色體數目均為2 n=22，利用該套探針池可以快速鑒定單個的西瓜染色體。在圖1-c和1-e中，觀察到Chr6和Chr10的4個信號中有2個定位在其他染色體末端，表明chr6和chr10染色體部分片段發生了易位。因此，進一步將Chr6探針標記為紅色，Chr10探針標記為綠色，將Chr6（紅色）與Chr 10（綠色）探針雜交到同一細胞染色體上，圖1-g中觀察到Chr6和Chr10的探針信號定位在同一條染色體上的短臂和長臂區域，表明這條重排的染色體由Chr6和Chr10染色體相互易位形成。

2.2 花粉活力測定結果

純合易位自交系G59（圖2-a）不育花粉粒/總花粉粒為4.28%，普通西瓜自交系G33（圖2-b）、G37（圖2-c）、G42（圖2-d）不育花粉粒/總花粉粒分別為5.41%、2.71%、5.61%（表3），易位純合自交系G59與普通自交系不育花粉占比差異不顯著；而易位雜交組合蘇夢15（圖3-a）、圣嘉1號（圖3-b）、蘇夢17（圖3-c）的不育花粉粒/總花粉粒分別為46.52%、54.17%、43.66%，均極顯著大于雙親（表3）。

2.3 果實性狀及單瓜種子數量

如表4所示，G59平均單瓜種子數量為212.33粒，與常規自交系G33（192.33粒）、G42（190.33粒）、G37（186.00粒）無顯著差異。常規雜交品種蘇夢5號平均單瓜種子數量為187.33粒，蘇夢6號為163.67粒，蘇夢7號為173.00粒，與易位自交系G59和常規自交系G33、G37、G42單瓜種子數量也無顯著差異。而易位雜交組合蘇夢15平均單瓜種子數量為72.33粒，是母本G33單瓜種子數量的37.61%，是父本G59單瓜種子數量的34.06%，是對照蘇夢5號單瓜種子數量的38.61%；圣嘉1號平均單瓜種子數量為65.67粒，是母本G42單瓜種子數量的34.50%，是父本G59的30.93%，是對照蘇夢6號的40.12%；蘇夢17平均單瓜種子數量為80.33粒，是母本G37的43.19%，是父本G59的37.83%，是對照蘇夢7號的46.43%，均極顯著低于其親本與對照。

3個易位雜交組合圣嘉1號、蘇夢15、蘇夢17的中心可溶性固形物含量均在12%以上，與其他試驗材料均無顯著差異。其中蘇夢15的中心可溶性固形物含量為13.20%，較G33和G59分別提高0.69和0.37百分點，較其對照蘇夢5號提高0.33百分點；圣嘉1號的中心可溶性固形物含量為12.91，較G42和G59分別提高0.16和0.08百分點，較對照蘇夢6號降低0.54百分點；蘇夢17的中心可溶性固形物含量較G37和G59分別降低0.07和0.21百分點，比對照蘇夢7號降低0.14百分點。蘇夢15、圣嘉1號、蘇夢17平均單果質量分別為2.47、2.27、2.45 kg，分別與對照蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號等西瓜品種差異不顯著。

3 討論與結論

3.1 熒光原位雜交技術用于西瓜易位系輔助育種選擇

Oligo-FISH是以人工合成攜帶熒光基團的單鏈DNA或RNA序列為探針的熒光原位雜交技術，是染色體可視化的重要技術之一[12]。基于Oligo-FISH的寡核苷酸序列探針進行物理定位，可以揭示染色質在細胞核、細胞質乃至組織結構中的位置信息[13]。

在小麥、花生等作物中，Oligo-FISH已成為鑒定染色體結構變異材料的主要手段。Ma等[14]利用zebularine誘變和Oligo-FISH檢測，獲得了大量小麥-黑麥易位、缺失等染色體變異材料。楊漫宇等[15]利用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對川麥62及其高代品系16EW381和16EW458進行熒光原位雜交分析，發現川麥62含5BS·7BS和5BL· 7BL易位染色體，16EW458是含6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL的三重易位系，16EW381是含6VS·6AL、5BS·7BS、5BL·7BL、3BL·5AS和3BL·5AL的五重易位系。付留洋[16]利用Oligo-FISH新核型分析，精準鑒定了花生19個四粒紅易位系、缺失系。杜培[17]分別開發了小麥、白薩草和花生寡核苷酸探針，用于分析不同小麥和花生品種染色體多樣性，并鑒定出了系列染色體易位系。

前人對西瓜易位系鑒定多采用觀察花粉育性、減數分裂染色體行為等方式，朝井小次郎等[18]、張濤等[19]通過花粉育性初步篩選出易位雜合體，以花粉55%以下的可育率作為易位雜合體的初評指標。Tian等[20]、葛杰[21]通過對減數分裂各個時期染色體行為進行觀察，發現易位雜合體2018-z-4在減數分裂雙線期出現四體環形結構，但這些方法均無法明確鑒定出發生易位的染色體。

寡核苷酸熒光原位雜交（Oligo-FISH）是近年來發展的一種經濟高效的染色體鑒定方法，是基于基因組測序序列進行設計的探針[11]。筆者利用G42西瓜基因組設計了一套寡核苷酸探針，用于西瓜染色體易位系的鑒定。筆者選育的染色體易位系G59，通過寡核苷酸探針鑒定為Chr6和Chr10發生了交換易位，且為純合易位。寡核苷酸探針可準確鑒定出西瓜染色體的易位行為，為西瓜染色體易位等變異行為的鑒定提供了新的途徑。

3.2 西瓜染色體易位的育種應用

對染色體易位系G59的花粉進行觀察，發現其花粉不育率為4.28%，與常規自交系差異不顯著，與前人的研究結果一致，純合的易位自交系不存在花粉半敗育的性狀[19]，其單瓜種子數量表現正常，約212.33粒，與常規自交系一樣可作為親本正常繁種或用于雜交組合的配制。

利用西瓜染色體易位系進行雜交，獲得的雜交一代單瓜種子數量少至十幾粒，能夠克服三倍體無籽西瓜種子發芽率低、成苗率低、制種成本高、種子價格昂貴和育種技術較復雜的缺點。張濤等[19]研究表明，易位系雜交 1 與雜交 2 無論單瓜質量、含糖量、種子數均優于對照，同時保留了對照的優勢性狀。吳進義等[22]通過調查多個易位雜交組合也發現易位系雜交1代組合多數保留了對照組合（非易位系親本雜交組合）的雜種優勢和優良特征特性，單瓜籽粒數明顯減少，且果實可溶性固形物含量有不同程度的增加，提高了其品質和商品價值。劉莉等[23]研究表明，2 對染色體相互易位使西瓜花粉敗育率達49%，單瓜種子數較雙親平均值減少 51%，單瓜質量增加5.7%，中心糖含量提高1.4百分點；而4對染色體相互易位的雜合體花粉敗育率超過60%，單瓜種子數減少75%以上，中心糖和邊糖含量分別提高了0.8和1.3百分點。在本研究中，對蘇夢15、圣嘉1號、蘇夢17等3個易位雜交組合的花粉進行觀察，其不育花粉占比為43%～55%，單瓜種子數量為65～81粒，較雙親和對照品種顯著減少，蘇夢15、圣嘉1號的中心可溶性固形物含量也較雙親和對照品種蘇夢5號、蘇夢7號有所提高，因此配制的3個易位少籽組合蘇夢15、圣嘉1號、蘇夢17可作為優異的少籽西瓜品種進一步推廣應用。

綜上所述，筆者基于G42西瓜基因組開發出了一套寡核苷酸探針，通過ND-FISH即可準確鑒定染色體易位行為，為后續西瓜染色體易位系的創制與鑒定提供高效準確的鑒定方法。筆者利用創制的易位自交系G59配制了多個易位少籽雜交組合，單瓜種子數量顯著減少，且性狀優異，為西瓜少籽品種的選育奠定了基礎。

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