CD19-CAR慢病毒生產(chǎn)方法的比較分析與優(yōu)化

［摘 要］ 為優(yōu)化CD19-CAR慢病毒的生產(chǎn)方法，以獲得更優(yōu)的生產(chǎn)條件，采用慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)（pLVX，psPAX2，pMD2.G），并利用轉(zhuǎn)染試劑（lipo8000TM，Lipofectamine 3000，PEIpro）進(jìn)行慢病毒的包裝，通過(guò)超速離心和超濾技術(shù)對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮。并利用流式細(xì)胞儀測(cè)定慢病毒滴度。研究發(fā)現(xiàn)，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑包裝的慢病毒原液滴度最高；在pLVX、psPAX2與pMD2.G質(zhì)量比為4∶3∶1，質(zhì)?？偭繛? μg，質(zhì)?？偭浚╩/μg）與轉(zhuǎn)染試劑體積比（V/μL）為1∶5時(shí)，慢病毒的滴度達(dá)到最高。此外，使用超濾方法濃縮的慢病毒滴度高于超速離心法。盡管使用Lipofectamine 3000包裝慢病毒原液滴度最高，但考慮到擴(kuò)大生產(chǎn)的成本，選擇性?xún)r(jià)比更高的PEIpro更為適宜。因此，本研究得出的最佳慢病毒生產(chǎn)方法是：使用轉(zhuǎn)染試劑PEIpro包裝慢病毒，在pLVX、psPAX2與pMD2質(zhì)量比為4∶3∶1，質(zhì)粒總量為5 μg，質(zhì)粒總量（m/μg）與轉(zhuǎn)染試劑體積比（V/μL）為1∶5，收集48 h和72 h的病毒上清液，并通過(guò)超濾方法對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮。

［關(guān)鍵詞］ 慢病毒； 病毒包裝； 病毒濃縮； 滴度

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R153 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）是一種通過(guò)基因工程技術(shù)改造的T細(xì)胞，使其能夠表達(dá)嵌合抗原受體，從而靶向并殺傷具有特定抗原的腫瘤細(xì)胞[1]。CAR-T細(xì)胞因其在臨床中顯示出的有效和持久反應(yīng)而備受關(guān)注，[2]。特別是針對(duì)B淋巴細(xì)胞CD19抗原的CAR-T細(xì)胞，在臨床試驗(yàn)中已證明對(duì)多種血液瘤具有顯著療效，這些血液瘤包括急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）[3]。值得注意的是，諾華公司的Kymriah和凱特制藥公司的Yescarta這兩種靶向CD19的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，已被美國(guó) FDA 批準(zhǔn)用于治療 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 （DLBCL）[4]。然而，在CAR-T細(xì)胞療法中，將嵌合抗原受體（CAR）穩(wěn)定整合到T細(xì)胞中是關(guān)鍵步驟，通常需要使用慢病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。

慢病毒載體因其廣泛的宿主范圍和對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞的感染能力而受到青睞，尤其對(duì)于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，慢病毒載體能顯著提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，增加目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的概率[5]。隨著慢病毒載體技術(shù)的發(fā)展，第二代慢病毒系統(tǒng)具有安全性好、重組概率低等優(yōu)點(diǎn)，成為制備CAR-T細(xì)胞的最佳選擇[6]。

盡管已有眾多科研機(jī)構(gòu)和公司研究針對(duì)不同腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞療法，但CAR-T細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用上的成功案例仍然有限，部分原因在于制備高效、穩(wěn)定的CAR-T細(xì)胞存在一定難度且成本較高。首先，T細(xì)胞需要在體外激活以增強(qiáng)存活能力，但過(guò)度激活可能導(dǎo)致T細(xì)胞激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）。其次，激活后的T細(xì)胞還需能耐受慢病毒的感染，而T細(xì)胞作為懸浮細(xì)胞，很難被慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，必須對(duì)慢病毒的生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。所以，為了制備高效、穩(wěn)定的CAR-T細(xì)胞以供研究和臨床應(yīng)用，高滴度的慢病毒是必不可少的前提。

本研究旨在優(yōu)化CD19-CAR慢病毒的制備工藝，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的CAR-T細(xì)胞的制備及功能研究提供基礎(chǔ)。為了制備高滴度的慢病毒，本研究從轉(zhuǎn)染體系、轉(zhuǎn)染試劑選擇、慢病毒濃縮時(shí)間和方法等方面進(jìn)行比較，以確定最佳的慢病毒生產(chǎn)條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚胎腎細(xì)胞系293T， 本實(shí)驗(yàn)室保存； 慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-EF1α-PuroR-CAR-IRES-EGFP（pLVX-PuroR-EGFP）、 psPAX2、 pMD2.G， 本實(shí)驗(yàn)室保存； 慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1（pLVX-ZsGreen1）， 購(gòu)自?xún)?yōu)寶生物； DME/F-12培養(yǎng)基， 購(gòu)自Hyclone公司； 胎牛血清， 購(gòu)自四季青公司； 重組人白介素-2， 購(gòu)自Peprotech公司； 人源T淋巴細(xì)胞分離磁珠， 購(gòu)自BD公司； 人源CD3/CD28激活磁珠， 購(gòu)自Gibco公司； PE-CD19蛋白， 購(gòu)自Acrosystem公司 ；lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑， 購(gòu)自碧云天公司； Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑， 購(gòu)自ThermoFisher公司； PEIpro，購(gòu)自Polyplus公司。 高速冷凍離心機(jī)， ThermoFisher， Multifuge X1R； 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀， ThermoFisher， Countess Ⅱ； 超速離心機(jī)，Beckman， Optima XE;流式細(xì)胞儀，BD，Accuri-C6。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 不同轉(zhuǎn)染試劑的比較

將293T細(xì)胞以6×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS-DME/F-12培養(yǎng)基，并使用lipo8000TM、Lipofectamine 3000和PEIpro三種不同的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行慢病毒的制備，具體操作步驟詳見(jiàn)各試劑的說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染后48和72 h收取上清，通過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，測(cè)定病毒滴度。

2.2 不同轉(zhuǎn)染體系的比較

將293T細(xì)胞以6×105個(gè)/孔的密度接種在六孔板中。次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS-DME/F-12培養(yǎng)基，并采用不同的轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染制備慢病毒。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置m（pLVX） ∶m（psPAX2）∶m（pMD2.G）=4 ∶3 ∶1和m（pLVX）∶m（psPAX2）∶m（pMD2.G）=4 ∶2 ∶1兩種條件；質(zhì)?？偭糠謩e為2.5 μg和5 μg；轉(zhuǎn)染試劑體積和質(zhì)?？偭勘葹?∶1、3∶1和5∶1。轉(zhuǎn)染后48 和72 h收取上清，通過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，測(cè)定病毒滴度。

2.3 不同離心時(shí)間的比較

將293T細(xì)胞以4×106個(gè)/皿的密度接種在10 cm培養(yǎng)皿中。次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS-DME/F-12培養(yǎng)基并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48和72 h收取上清，通過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，將慢病毒上清液加入超速離心管中并配平（誤差控制在±0.01 g以?xún)?nèi)），在4℃的條件下，以72000×g分別離心0.5、1、1.5和2 h。離心完成后，棄去上清液，用等量的PBS重懸病毒顆粒，并測(cè)定病毒滴度。

2.4 不同慢病毒主質(zhì)粒的比較

將293T細(xì)胞以4×106個(gè)/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中。次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS-DME/F-12培養(yǎng)基并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別用使用pLVX-PuroR-EGFP和pLVX-ZsGreen1作為主質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒的包裝。轉(zhuǎn)染后48和72 h收取上清，通過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，采用超速離心的方法濃縮慢病毒，并測(cè)定病毒滴度。

2.5 不同濃縮方法的比較

將293T細(xì)胞以4×106個(gè)/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS-DME/F-12培養(yǎng)基并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48和72 h收取上清，通過(guò)0.45 μm濾頭過(guò)濾后，分別采用超速離心和超濾的方法對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮，并測(cè)定病毒滴度。超速離心的方法同前文，超濾濃縮的方法就是將慢病毒上清液加入100 kg/mol的超濾管中，配平（誤差控制在±0.01 g以?xún)?nèi)），然后用4000×g的轉(zhuǎn)速在4℃條件下進(jìn)行40 min的高速冷凍離心后收集濾膜上方的液體。

2.6 慢病毒滴度測(cè)定

將293T細(xì)胞以4×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板中。次日，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換添加了polybrene（終濃度為7 μg/mL）的含10% FBS-DME/F-12培養(yǎng)基，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置20 min。用梯度稀釋法以10的梯度依次稀釋慢病毒后，以10 μ/孔的量加入到靜置后的96孔板中。72 h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞，再用PBS洗滌兩遍后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的陽(yáng)性率來(lái)計(jì)算滴度：

式中：T為慢病毒滴度，TU/mL；A為接種慢病毒時(shí)的HEK-293T細(xì)胞數(shù)（個(gè)）；B為一定稀釋倍數(shù)下GFP（綠色熒光蛋白）表達(dá)率，%；N為稀釋倍數(shù)；C為病毒體積，mL。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同轉(zhuǎn)染試劑的比較

比較了三種不同轉(zhuǎn)染試劑lipo8000、Lipofectamine 3000和PEIpro在制備慢病毒時(shí)的效果。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了293T細(xì)胞感染慢病毒后的GFP陽(yáng)性率，結(jié)果如圖1所示。具體而言，使用lipo8000、Lipofectamine 3000和PEIpro轉(zhuǎn)染后得到的GFP陽(yáng)性率分別為8.7%（A）、20.2%（B）和14.5%（C）。根據(jù)滴度計(jì)算公式，得出使用這三種轉(zhuǎn)染試劑收集的慢病毒滴度分別為1.01×105 、2.35×105和1.59×105 TU/mL，如圖1中E的柱狀統(tǒng)計(jì)圖所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染后獲得的慢病毒滴度最高，但是從性?xún)r(jià)比的角度來(lái)看，PEIpro轉(zhuǎn)染試劑的性?xún)r(jià)比更高一些。

3.2 不同轉(zhuǎn)染體系的比較

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，不同轉(zhuǎn)染體系獲得的慢病毒感染293T細(xì)胞后GFP陽(yáng)性率（圖2）。在相同轉(zhuǎn)染條件下，V（pLVX）∶V（psPAX2）∶V（pMD2.G）=4∶3 ∶1時(shí)，慢病毒感染293T細(xì)胞后的GFP陽(yáng)性率要高于，V（pLVX）∶V（psPAX2）∶V（pMD2.G）=4∶2∶1時(shí)；質(zhì)粒總量5 μg時(shí)慢病毒感染293T細(xì)胞后的GFP陽(yáng)性率要高于質(zhì)?？偭?.5 μg時(shí)；轉(zhuǎn)染試劑體積和質(zhì)粒總量比為5∶1時(shí)慢病毒感染293T細(xì)胞后的GFP陽(yáng)性率要高于1∶1和3∶1時(shí)。因此，當(dāng)V（pLVX）∶V（psPAX2）∶V（pMD2.G）=4∶3 ∶1，

質(zhì)?？偭繛?μg，質(zhì)?？偭浚╩/μg）與轉(zhuǎn)染試劑體積比（V/μL）為1∶5時(shí)，慢病毒滴度最高。

3.3 不同離心時(shí)間的比較

如圖3所示，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，慢病毒經(jīng)超速離心機(jī)離心0.5、1、1.5和2 h后，稀釋10倍感染293T細(xì)胞的GFP陽(yáng)性率分別為：22.3%（B）、25.8%（C）、42.8%（D）和59.9%（E）。如圖3中G所示，通過(guò)滴度計(jì)算公式得出，離心0.5、1、1.5和2 h后，慢病毒滴度分別為2.14×106 、2.48×106、4.11×106和5.75×106TU/mL。結(jié)果表明，離心2 h得到的慢病毒滴度最高。

3.4 不同慢病毒主質(zhì)粒的比較

如圖4的A、B所示，用pLVX-PuroR-EGFP做為主質(zhì)粒制備的慢病毒和用pLVX-ZsGreen1做為主質(zhì)粒制備的慢病毒，感染293T細(xì)胞的GFP陽(yáng)性率分別為：15.7%和47.8%。圖4的D所示，通過(guò)滴度計(jì)算式（1）得出用pLVX-PuroR-EGFP作為主質(zhì)粒和用pLVX-ZsGreen1作為主質(zhì)粒制備的慢病毒滴度分別為：5.83×105 和1.78×106 TU/mL。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論用pLVX-EF1α -CAR-IRES-ZsGreen1作為主質(zhì)粒制備慢病毒遠(yuǎn)優(yōu)于pLVX-EF1α- PuroR-CAR-IRES-EGFP。

3.5 不同濃縮方法的比較

如圖5A、B所示，用超速離心和超濾濃縮的慢病毒稀釋100倍后，感染293T細(xì)胞的GFP陽(yáng)性率分別為：2.51%和6.26%。如圖5的D所示，通過(guò)滴度計(jì)算公式得出用超速離心和超濾濃縮的慢病毒滴度分別為：2.11×107 和5.26×107 TU/mL。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論用超濾濃縮慢病毒獲得慢病毒滴度更高。

4 結(jié)果與討論

隨著慢病毒載體臨床應(yīng)用的增加，對(duì)慢病毒滴度的要求提高，尤其是插入片段增加時(shí)，因此優(yōu)化慢病毒生產(chǎn)變得格外重要。本文從主質(zhì)粒選擇、轉(zhuǎn)染試劑選擇以及轉(zhuǎn)染體系三個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)比較了濃縮病毒時(shí)超速離心的時(shí)間，以及超速離心和超濾濃縮兩種濃縮方法的慢病毒滴度。結(jié)果顯示，Lipofectamine 3000生產(chǎn)的慢病毒滴度最高，但PEIpro性?xún)r(jià)比以及擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)的成本更優(yōu)。 使用pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒分別包裝的慢病毒滴度要高于pLVX-EF1α-CAR-IRES-EGFP。且前者相較于后者少了一個(gè)PuroR抗性基因，并且含有更短的熒光標(biāo)記基因ZsGreen1，結(jié)構(gòu)上更加簡(jiǎn)單。和預(yù)期的結(jié)果一樣，用pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1包裝的慢病毒滴度為1.78×106 TU/mL，而用pLVX-PuroR-EGFP包裝的慢病毒滴度只有5.83×105 TU/mL。轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化上，當(dāng)m（pLVX）∶m（psPAX2）∶m（pMD2.G）=4∶3∶1，質(zhì)?？偭繛? μg，質(zhì)粒總量（m/μg）與轉(zhuǎn)染試劑體積比（V/μL）為5∶1時(shí)，慢病毒的滴度最高。當(dāng)然實(shí)際操作中，需要參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)以及根據(jù)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)皿大小進(jìn)行調(diào)整。在濃縮方法的比較上，超濾濃縮后的慢病毒滴度達(dá)到了5.26×107 TU/mL，遠(yuǎn)高于超速離心濃縮后的慢病毒滴度2.11×107 TU/mL，這一結(jié)果也與Nicholas P.Anagnou所報(bào)告的結(jié)果相一致[7]。后續(xù)需評(píng)估濃縮后的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及細(xì)胞毒性。

［ 參 考 文 獻(xiàn) ］

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Comparative Analysis and Optimization of Cd19 CarLentiviral Production Methods

ZHAN Sijian1， ZHANG Fan1， DUAN Haixiao1， WANG Yang1， HU Han1， LIU Binlei1， 2

（1 Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;2 Wuhan Binhui Biotechnology Co.， Ltd， Wuhan 436030，China）

Abstract：" The production method of CD19 CAR lentivirus was optimized to obtain better production conditions. Lentiviruses were packaged using a lentiviral three-plasmid packaging system （pLVX， psPAX2， pMD2.G） with transfection reagents （lipo8000 TM， Lipofectamine 3000， PEIpro）， and concentrated by ultracentrifugation and ultrafiltration. The lentivirus titer was determined by flow cytometry. The highest titer of lentivirus was obtained by packaging lentivirus with Lipofectamine 3000. When pLVX： psPAX2： pMD2.G = 4∶3∶1， the total amount of plasmid was 5 μg. The ratio of transfection reagent volume and total plasmid was 5∶1; the titer of lentivirus was the highest. The titer of lentivirus concentrated by ultrafiltration was higher than that by ultracentrifugation. The original titer of lentivirus packaged with Lipofectamine 3000 was the highest， but considering the cost of expanding production， PEIpro with higher cost performance was more suitable. Therefore， the best method for lentivirus production in this study is to use the transfection reagent PEIpro to package the lentivirus. The virus supernatant was collected at 48 h and 72 h under the conditions of pLVX∶psPAX2∶pMD2.G = 4∶3∶1， the total amount of plasmid was 5 μg， and the ratio of transfection reagent volume to the total amount of plasmid was 5∶1.

Keywords： lentivirus; virus packaging; virus concentration; titer

［責(zé)任編校： 張 眾］

［收稿日期］ 2022-12-21

［第一作者］ 詹思建（1999-），男，湖北麻城人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樯锱c醫(yī)藥。

［通信作者］ 劉濱磊（1962-），男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向?yàn)樯镏扑帯?/p>