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貫葉金絲桃質控方法提升及“辨色論質”研究

2025-04-01 00:00:00李喜碩蘇本正曲珍妮朱娟娟戴衍朋石典花
中國藥房 2025年6期

中圖分類號 R932;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2025)06-0661-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.06.04

摘要 目的 為貫葉金絲桃的質量控制提供參考。方法 采用高效液相色譜法建立20 批貫葉金絲桃的指紋圖譜并測定其主要成分綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素的含量;采用SPSS 26.0 軟件進行聚類分析。采用電子眼測定貫葉金絲桃粉末的明度值(L*)、紅綠值(a*)和黃藍值(b*),采用機器學習算法建立基于外觀色度值的貫葉金絲桃上述7 種成分含量的預測模型,并采用均方根誤差(RMSE)評價預測模型的預測性能。結果 20 批貫葉金絲桃指紋圖譜共標定16 個共有峰,指認出9個色譜峰,分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、貫葉金絲桃素和金絲桃素,20 批樣品與對照圖譜的相似度為0.889~0.987;綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素含量分別為0.025%~0.166%、0.048%~0.339%、0.082%~0.419%、0.017%~0.209%、0.011%~0.134%、0.020%~0.135%、0.041%~0.235%;聚類分析結果顯示,當歐氏距離為1.4 時,18 批合格貫葉金絲桃可聚為3 類。20 批貫葉金絲桃的L*為62.814~75.668,a*為1.409~3.490,b*為25.249~30.759;XGBoost、LightGBM、AdaBoost 3 種預測模型的RMSE為0.008~0.070,擬合效果良好。除蘆丁外,XGBoost模型預測其余6 種成分的含量均具有較高的預測精度。結論 所建指紋圖譜及含量測定方法準確、重復性好、結果可靠;結合機器學習算法構建的基于外觀色度值的含量預測模型可用于貫葉金絲桃的質量控制。

關鍵詞 貫葉金絲桃;指紋圖譜;聚類分析;含量測定;色度值;質量評價;機器學習;預測模型

貫葉金絲桃為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericumperforatum L. 的干燥地上部分,味辛,性寒,歸肝經,具有疏肝解郁、清熱利濕、消腫通乳的功效[1],主要分布在我國湖北、四川、陜西、甘肅、湖南、新疆等地[2]。貫葉金絲桃具有抗抑郁、抗炎、抗菌、抗氧化及保護神經細胞等藥理作用[3],其化學成分主要有黃酮類、間苯三酚類、萘駢二蒽酮類及多種揮發油類[4],其中黃酮類化合物金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、萹蓄苷等,間苯三酚類化合物貫葉金絲桃素,萘駢二蒽酮類化合物金絲桃素,酚酸類化合物綠原酸是其主要活性成分[5―6]。2020年版《中國藥典》(一部)貫葉金絲桃標準項下僅收載了蘆丁、金絲桃苷的薄層鑒別和金絲桃苷的含量測定方法,尚不能全面、準確地評價其內在質量。

中藥指紋圖譜可全面反映中藥的內在化學成分信息,且多成分含量測定已逐漸成為中藥常用的質量評價模式[7]。性狀是中藥質量評價的重要指標,與中藥內在質量密切相關,因此可通過中藥性狀判斷其質量優劣[8―9]。電子眼可將物體顏色進行客觀數據化,在中藥采收、基原鑒定、質量評價、真偽判斷等方面均有應用[10]。機器學習是基于數據的計算模型,從數據中學習和提取有用的模式,可用于預測、分類、決策等領域,具有預測精度高、特征信息提取及非線性問題處理能力強等優勢[11]。本研究通過建立貫葉金絲桃的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜測定了其中7 種成分(綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素)的含量,并通過機器學習構建了基于其外觀色度值的成分含量的預測模型,旨在為貫葉金絲桃的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Waters 2695 型HPLC 儀(美國Waters 公司),IRIS VA400 型電子眼系統(法國Alpha Mos公司),XS-205DU型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司),BJ-150 型高速多功能粉碎機(上海頂帥電器有限公司),KQ5200-DE型超聲儀(昆山舒美超聲儀器有限公司),DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 藥品與試劑

15 批(編號S1~S15)貫葉金絲桃飲片和5 批(編號S16~S20)貫葉金絲桃藥材,經山東省中醫藥研究院林慧彬研究員鑒定均為真品(見表1)。綠原酸(批號BP0345,純度≥98%)、金絲桃苷(批號BP0753,純度≥98%)、異槲皮苷(批號BP0793,純度≥98%)、槲皮素(批號BP1187,純度≥98%)、貫葉金絲桃素(批號BP0751,純度≥98%)對照品均購自成都普瑞法科技開發有限公司;金絲桃素對照品(批號BP0752,純度≥98.0%)購自成都普思生物科技股份有限公司;蘆丁(批號100080-202012,純度≥91.6%)、槲皮苷對照品(批號111538-202007,純度≥93.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院;萹蓄苷對照品(批號BBP00890,純度≥98.0%)購自云南西力生物技術股份有限公司;乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以Zafex JX-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;以磷酸氫二鈉緩沖液(6 mmol/L,pH 6.5)-0.02%磷酸溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫(見表2);檢測波長為354 nm(0~58 min,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素)、290 nm(58~60 min,貫葉金絲桃素)、590 nm(60~65 min,金絲桃素);流速為1mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為5 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取貫葉金絲桃粉末(過三號篩)約2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇50 mL,稱重,加熱回流1 h,放冷,再次稱重,用60%乙醇補足減失的質量,搖勻,經0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備

取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、貫葉金絲桃素對照品各適量,精密稱定,分別置于5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,即得各單一對照品儲備液。取金絲桃素對照品適量,精密稱定,置于5mL 容量瓶中,加二甲基亞砜(DMSO)1 mL 溶解,再加50%甲醇至刻度,即得金絲桃素對照品儲備液。精密量取上述各單一對照品儲備液,置于5 mL容量瓶中,加甲醇定容,即得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、貫葉金絲桃素、金絲桃素質量濃度分別為37.08、41.92、47.28、51.66、46.16、49.80、39.84、24.40、39.60 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗

取“2.1.2”項下供試品溶液(編號S11),按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次,以金絲桃苷為參照峰,得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.10%(n=6),相對峰面積的RSD 均小于2.96%(n=6),表明儀器的精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗

取“2.1.2”項下供試品溶液(編號S11),分別在制備后于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,以金絲桃苷為參照峰,得各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.09%(n=6),相對峰面積的RSD均小于2.63%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗

取樣品(編號S11),共6 份,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,以金絲桃苷為參照峰,得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.10%(n=6),相對峰面積的RSD均小于2.13%(n=6),表明方法的重復性良好。

2.1.7 指紋圖譜建立與相似度評價

取20 批樣品,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。將所得數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 版)》,以S11樣品為參照圖譜(各峰信號強、分離度好),設置時間窗為0.1 min,以平均數法生成對照圖譜,經多點校正和Marker 峰匹配后,得到樣品的疊加指紋圖譜、對照指紋圖譜(R)及混合對照品圖譜(圖1)。最終確定16 個共有峰,共指認出9 個峰,分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素、貫葉金絲桃素和金絲桃素。對20 批樣品與對照圖譜進行相似度評價,結果顯示,各批樣品與對照圖譜的相似度為0.889~0.987,均大于0.850,表明貫葉金絲桃中各色譜峰組成相似,所建指紋圖譜可用于初步控制貫葉金絲桃的整體質量。

2.2 多成分含量測定

2.2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取“2.1.3”項下綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素對照品儲備液適量,置于5 mL容量瓶中,加甲醇定容,即得上述各成分質量濃度分別為29.90、86.52、132.30、30.82、19.60、20.14、67.52 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液,分別取1、2、4、8、10、12、14 μL,按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,以各成分進樣量為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。結果見表3。

2.2.3 精密度試驗

取“2.1.2”項下供試品溶液(編號S11),按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次,記錄峰面積。結果顯示,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD 分別為0.39%、0.50%、0.41%、0.52%、0.53%、0.71%、0.94%(n=6),表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗

取“2.1.2”項下供試品溶液(編號S11),分別于制備后室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結果顯示,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、扁蓄苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD 分別為0.75% 、1.35% 、0.89% 、1.00% 、0.93% 、1.07%、1.27%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗

取樣品(編號S11),共6 份,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并根據外標法計算各成分的含量。結果顯示,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素含量的RSD 分別為1.39%、1.77%、0.64%、0.55%、1.32% 、0.93% 、1.41%(n=6),表明該方法的重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的貫葉金絲桃粉末(編號S11),共6 份,每份1 g,按各成分含量質量比約1∶1 加入適量的各單一對照品溶液,精密加入60%乙醇至50 mL,然后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為93.85% 、95.85%、94.53%、95.68%、93.86%、100.29%、96.48%,RSD 分別為2.81% 、2.68% 、2.71% 、2.74% 、2.31% 、2.57%、2.50%(n=6),表明方法的準確度良好。

2.2.7 樣品含量測定

取20 批樣品粉末各2 g,精密稱定,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,按外標法計算樣品含量,每批樣品平行測定2 次。結果顯示,20 批樣品中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素的含量分別為0.025%~0.166%、0.048%~0.339%、0.082%~0.419%、0.017%~0.209%、0.011%~0.134%、0.020%~0.135%、0.041%~0.235%。表明不同批次貫葉金絲桃中各成分含量存在較大差異。進一步分析發現,S7 和S10 樣品中金絲桃苷含量低于《中國藥典》規定不得少于0.10%標準,故為不合格品,其余18 批樣品為合格品。結果見表4。

2.2.8 貫葉金絲桃中7種成分含量結果的聚類分析

以18 批合格貫葉金絲桃中綠原酸等7 種成分的含量為變量,采用SPSS 26.0 軟件進行聚類分析(圖2)。結果顯示,當歐氏距離為1.4 時,18 批樣品聚為3 類:S2、S4、S6、S15、S19 聚為第1 類,S1、S9、S14、S18、S20 聚為第2 類,S3、S5、S8、S11~S13、S16、S17 聚為第3 類。當歐氏距離為2.0 時,第2 類和第3 類可聚為一類。結合含量測定結果發現,第1 類樣品中所含的7 種成分的總含量明顯高于第2 類和第3 類樣品,而大部分第2 類樣品中所含的7 種成分的總含量高于第3 類樣品,但存在S3 和S11 樣品按總含量應歸第2 類,實際卻歸為第3 類的特殊情況。對此結果進一步分析發現,原因可能與S3 樣品中槲皮苷和槲皮素含量、S11 樣品中蘆丁和槲皮苷含量均低于第2 類樣品,與第3 類樣品類似有關。綜上,基于聚類分析結合含量測定結果,可將18 批樣品中的第1 類劃為優品,第2 類劃為良品,第3 類劃為合格品。

2.3 貫葉金絲桃的顏色測定

顏色空間基于人眼對顏色的感知,能夠精確捕捉和量化中藥顏色的細微變化,從而真實反映其顏色特性。明度值(L*)范圍為0~100,表示顏色從黑到白的變化;紅綠值(a*)表示顏色從紅到綠的變化,其中正值代表紅色,負值代表綠色;黃藍值(b*)表示顏色從黃到藍的變化,正值代表黃色,負值代表藍色[12]。

取20 批樣品,粉碎,過三號篩,均勻放置于表面皿中,使用電子眼系統采集圖像,平行采集3 次后取平均值。結果顯示,20 批貫葉金絲桃的L* 為62.814~75.668,a*為1.409~3.490,b*為25.249~30.759,表明貫葉金絲桃粉末整體偏白、偏紅、偏黃。結果見表5。

2.4 貫葉金絲桃外觀色度預測含量研究

為探尋貫葉金絲桃外觀色澤和內在質量的相關性,探索建立“辨色論質”的方法,本研究利用機器學習方法構建了基于外觀色度預測貫葉金絲桃主要成分含量的模型(見圖3)。

2.4.1 機器學習模型的建立

以20 批貫葉金絲桃中綠原酸等7 種成分含量、L*、a*、b*值為樣本特征,采用Min-Max 歸一化方法進行標準化或歸一化處理;再通過Python 繪制核密度估計圖(kernel density estimation,KDE)以識別異常值并進行填充;使用Python 中的“train_test_split”命令將數據集按8∶2 的比例隨機劃分為訓練集和測試集。為減少過擬合風險,本研究結合網格搜索和三折交叉驗證提升模型精度,結果見圖4。由圖4 可見,訓練集與測試集中各成分分布基本一致,表明模型能很好地應用于測試集。

2.4.2 預測模型的篩選

以XGBoost、LightGBM、AdaBoost 等機器學習算法作為預測模型,使用均方根誤差(root-mean-squareerror,RMSE)評價機器學習模型效果,

模型評估結果見表6。由表6 可知,XGBoost、LightGBM、AdaBoost 3 種機器學習算法預測模型的RMSE為0.008~0.070,均較小,未見明顯差異。但是鑒于XGBoost 模型能以正則化方法規避過擬風險,保持模型穩定性,精準評估特征和篩選關鍵項,可實現含量的精準預測,因此,本研究選擇XGBoost 模型用于預測貫葉金絲桃中綠原酸等7種成分的含量。

2.4.3 外觀色度值預測的貫葉金絲桃中7 種成分含量與實測結果分析

將樣本的L*、a*、b*特征值導入XGBoost 模型作為輸入項,貫葉金絲桃中7 種成分的含量結果作為輸出項,再將7 種基于色度值預測的成分含量與實測結果進行比較,結果見圖5。由圖5 可知,蘆丁成分的預測含量與實測結果偏差較大;其余6 種成分的24 組預測結果中,有21 組的預測值與實際值基本一致,僅3 組(綠原酸中的A組,異槲皮苷和萹蓄苷中的D組)的預測值與實際值存在一定偏差;模型對金絲桃苷成分含量預測的準確率為100%。可見,建立的模型基本能夠實現根據外觀顏色預測貫葉金絲桃內在成分的含量。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

貫葉金絲桃中的間苯三酚類(貫葉金絲桃素)、萘駢二蒽酮類(金絲桃素)、黃酮類(金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素等)及有機酸類(綠原酸)等為其主要活性成分,這些成分復雜多樣,其中黃酮類成分和有機酸類成分在354 nm波長處響應值較高,貫葉金絲桃素和金絲桃素的最大吸收波長分別為290、590 nm。為最大化獲取指紋圖譜信息,實現多種成分含量的同時測定,本研究在綜合考察峰形、峰數、基線、吸收差異等多項干擾因素后,最終選取290、354、590 nm作為檢測波長。此外,本研究對提取溶劑(不同比例甲醇溶液和乙醇溶液)和提取方式(超聲提取、加熱回流提取)進行了篩選,結果發現,以60%乙醇為提取溶劑,加熱回流提取1 h 時,各成分提取效果最佳,含量最高。

3.2 20批貫葉金絲桃的含量測定結果分析

本研究結果顯示,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素含量分別為0.025% ~0.166%、0.048%~0.339%、0.082%~0.419%、0.017%~0.209%、0.011%~0.134%、0.020%~0.135%、0.041%~0.235%。聚類分析結果顯示,18 批合格的樣品聚為3類,其中第1 類樣品中7 種成分的總含量均相對較高,為優品;第2 類樣品為良品;第3 類樣品的總含量相對較低,為合格品。這提示不同產地貫葉金絲桃的成分含量存在差異,可能與生長環境不同有關;同一產地不同批次貫葉金絲桃的成分含量也存在差異,可能與藥材的采收時間、農戶種植水平等因素有關。

3.3 基于機器學習的貫葉金絲桃的含量預測研究

顏色是中藥外觀質量評價的重要指標,其與內在有效成分具有一定相關性[14]。張一凡等[12]基于機器學習算法將顏色特征值與測得的姜炭的5 種成分含量進行相關性分析,成功建立了顏色-成分的定量預測模型,為姜炭炮制程度控制和質量評價提供了參考依據。本研究采用機器學習中的XGBoost、LightGBM和AdaBoost 算法,利用L*、a*、b*特征值與有效成分含量測定結果建立了貫葉金絲桃主要成分的含量預測模型。結果發現,綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素6 種成分的含量預測模型均具有較高的預測精度。其中,2020年版《中國藥典》(一部)規定的指標成分金絲桃苷含量的預測準確率達到100%。上述結果提示可通過測定外觀色度值來辨識貫葉金絲桃的質量。綜上所述,所建指紋圖譜及含量測定方法準確、重復性好、結果可靠;結合機器學習算法構建的基于外觀色度值的含量預測模型可用于貫葉金絲桃的質量控制。

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(收稿日期:2024-09-04 修回日期:2025-02-21)

(編輯:李勁)

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