金絲桃苷調控肝臟脂質合成改善小鼠非酒精性脂肪性肝病的機制研究

中圖分類號 R965；R575 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）06-0668-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.06.05

摘要 目的 研究金絲桃苷（HYP）對非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的改善作用機制。方法 將雄性C57BL/6 小鼠隨機分為正常（NFD）組、模型（HFD）組、HYP組，每組8 只。除NFD組外，其余組小鼠喂養HF60 高脂飼料誘導NAFLD模型，同時HYP組小鼠每日灌胃100 mg/kg 的HYP，持續16 周。末次給藥16 h 后，記錄各組小鼠體重、肝臟質量，觀察肝臟病理形態學變化及脂質堆積情況，檢測肝臟中甘油三酯（TAG）含量和血清中TAG、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）含量；采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法檢測小鼠肝臟的脂質變化，進行脂質組學分析，并檢測脂質合成相關蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）蛋白的表達情況。將人源肝癌細胞株HepG2 分為正常對照組、模型組、HYP低濃度（50 μmol/L）組、HYP高濃度（100 μmol/L）組、HYP低濃度+GW6471（PPARα抑制劑）組和HYP高濃度+GW6471 組，除正常對照組外，其余細胞采用油酸、棕櫚酸誘導構建高脂細胞模型，觀察各組細胞脂滴蓄積情況，檢測其中的TAG含量。結果 與HFD組比較，HYP組小鼠肝臟脂肪空泡、脂質堆積、肝臟質量和TAG含量，以及血清中ALT、AST、TAG含量均明顯減少，肝組織中PPARα蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；NAFLD病理形態學變化均有所緩解。脂質組學分析發現HYP能降低肝臟中TAG、二酰甘油等脂質代謝物的相對水平。與模型組比較，HYP低、高濃度組細胞中脂滴蓄積和TAG含量均明顯減少，GW6471 能顯著逆轉HYP對上述指標的改善作用（P＜0.05）。結論 HYP可有效改善高脂飼料誘導的小鼠NAFLD，其機制可能與激活PPARα從而調控肝臟脂質合成有關。

關鍵詞 金絲桃苷；非酒精性脂肪性肝病；脂質合成；脂質組學；PPARα

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球最常見的慢性肝病，其特征是肝臟中甘油三酯（triglyceride，TAG）沉積過多，常與代謝綜合征、2 型糖尿病、肥胖及心血管疾病密切相關[1]。由于肥胖癥的急劇增加，NAFLD 已成為全球最普遍的肝病[2]。NAFLD的發病機制復雜，且存在多種致病因素，而TAG的肝臟蓄積是NAFLD發生發展的第一步[3]。目前，臨床治療NAFLD的藥物主要是瑞司美替羅（resmetirom），但該藥物尚未在國內上市，且價格高昂，許多患者家庭很難承受。中醫藥在治療肝臟相關疾病方面有著悠久的歷史，由于其具有療效好、副作用少、安全性高、經濟性好等優點，有望成為NAFLD的有效治療藥物來源[4]。

金絲桃苷（hyperoside，HYP），又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種黃酮糖醇苷類化合物，具有良好的抗炎和抗氧化作用[5]。脂質組學是一種檢查內源性脂質代謝變化的有效工具，其可通過先進的實驗技術和多變量統計分析策略，全面表征脂質的種類、結構、豐度及其在生物過程中的動態變化，研究生物系統中生物活性脂質的復雜代謝情況。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）是脂質代謝中承上啟下的關鍵靶點。基于此，本研究利用脂質組學技術，探究了HYP基于PPARα途徑對NAFLD改善作用的機制，旨在為HYP及NAFLD治療藥物的開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有KF-PRO-020 型數字病理切片掃描儀（寧波江豐生物信息技術有限公司）、Tanon5200 型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能生命科學生物有限公司）、QuantStudio 6 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Triple QuadTM 5500 型液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）系統（美國AB Sciex 公司）、全自動倒置熒光顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）、800TS-SN型酶標儀（安捷倫科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

HYP對照品（純度≥98%，批號CHB201123）購自成都克洛瑪生物技術有限公司；SPF 級HF60 高脂飼料（批號為20231010）購自戴茨生物科技（無錫）有限公司；實驗用高脂細胞添加劑（含棕櫚酸6 mmol/L、油酸12mmol/L，批號20240510-2）購自西安鯤創科技發展有限公司；逆轉錄預混液試劑（去基因組）（批號A4A1228）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；熒光定量試劑盒（含校正液）（批號A5A4013）購自杭州博日科技股份有限公司；鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號62u0922）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔源PPARα 多克隆抗體（批號159429）購自英國Abcam 公司；PPARα 抑制劑GW6471（批號159429）購自美國TargetMol Chemicals Inc 公司；丙氨酸轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉氨酶（aspartatetransaminase，AST）試劑盒、TAG 試劑盒（批號分別為20240416、20240417、20240612）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；超敏型細胞增強檢測試劑（批號AE1313）購自亞科因（武漢）生物技術有限公司；改良油紅O染色試劑盒（批號Z907240905）購自上海碧云天生物技術股份有限公司；甲醇和乙腈（批號分別為11176407147、JB127130）均購自美國Supelco 公司；異丙醇（批號C14591033）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；引物序列購自睿博興科生物技術有限公司。

1.3 實驗細胞與動物

人源肝癌細胞株HepG2 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

SPF級7 周齡C57BL/6 小鼠，24 只，雄性，體重（20±2）g，購于珠海百試通生物科技有限公司，生產許可證號為SCXK（粵）2022-0051。所有小鼠飼養于深圳華騰生物醫藥科技有限公司，使用許可證號為SYXK（粵）2023-0327。飼養環境為SPF 屏障環境，溫度為（22±1）℃，12h 光照與12 h 黑暗交替循環。飼養過程中，小鼠自由攝入食物和水。本研究實驗方案獲得了深圳華騰生物醫藥有限公司實驗動物倫理委員會批準（批準編號為B202404-4）。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與造模

將小鼠隨機分為3 組，每組8 只：正常（NFD）組小鼠給予SPF級常規維持飼料飼養；模型（HFD）組和HYP組小鼠給予SPF 級HF60 高脂飼料飼養16 周以復制NAFLD 模型。其中，HYP 組小鼠從造模第1 天開始每天早上灌胃100 mg/kg HYP（溶劑為0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液）[6]，NFD組和HFD組小鼠灌胃等體積溶劑，連續16周；所有小鼠自由飲食。

2.2 樣本收集與處理

末次給藥后，小鼠禁食不禁水16 h，然后記錄體重，麻醉并摘眼球取血，于4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取血清，用于后續檢測。小鼠取血后通過頸椎脫臼處死，分離肝臟，稱定肝臟質量，并用于后續檢測。

2.3 小鼠肝臟病理形態學及脂質堆積觀察

取各組小鼠肝臟，經脫水、石蠟包埋后切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察其病理形態學變化；經OCT包埋劑包埋后冷凍切片，進行油紅O染色，觀察其脂質堆積情況。

2.4 小鼠生化指標檢測

取各組小鼠肝組織適量，按相應試劑盒說明書方法檢測其中TAG的含量。取各組小鼠血清適量，按相應試劑盒說明書方法檢測血清中AST、ALT、TAG的含量。

2.5 小鼠肝臟脂質組學分析

每組隨機選取6 只小鼠的肝臟進行脂質組學分析。精確稱取肝臟20 mg，置于1.5 mL EP管中，充分勻漿，加入800 μL 甲基叔丁基醚-甲醇溶液（3∶1，V/V），渦旋30s；于－20 ℃靜置1 h 后，加入水200 μL，渦旋30 s；于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上層脂質提取液，真空濃縮，加入異丙醇100 μL復溶，渦旋30 s；于4 ℃、12 000r/min 離心15 min，取上清液進樣。每個樣品提取5 μL混合成質控樣品[7]。每隔6 個樣品插入1 個質控樣品進行分析，使用LC-MS/MS 系統進樣檢測，組間差異利用正交偏最小二乘判別法分析。以|Fold Change 值|≥2，P＜0.1 為篩選條件，分析各組之間的差異脂質代謝物。以|變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值|＞1 為篩選條件，評估脂質代謝物不同組別的貢獻程度，取排名前15 位的脂質代謝物進行分析。

2.6 小鼠肝組織中PPARα 蛋白表達檢測

取各組小鼠肝組織適量，加入研磨珠和裂解液充分勻漿后，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，進行BCA蛋白定量、變性；選取蛋白樣本進行電泳、轉膜，常溫下封閉1.5 h，加入PPARα、GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶1 000）孵育過夜；加入二抗（稀釋比例為1∶8 000），于室溫孵育1 h 后，用TBST 洗膜3 次，滴加顯色液后應用化學發光圖像分析系統顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平，結果以NFD組為參照進行歸一化處理。

2.7 金絲桃苷介導PPARα調控脂質合成的機制驗證

2.7.1 細胞培養

將HepG2 細胞接種于含10% 胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2的條件下培養。

2.7.2 HYP干預濃度篩選

采用CCK-8 法檢測細胞活力。取HepG2 細胞，以5 000 個/孔接種到96 孔板中，用0、10、100、1 000 μmol/L的HYP干預，并設置含細胞、不含藥物的陰性對照組，不含細胞和藥物的空白對照組。處理24 h 后，每孔加入不含血清的DMEM培養基180 μL 和CCK-8 試劑20 μL，于37 ℃下避光孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長下檢測每孔的吸光度（A）值，并按下式計算細胞活力：細胞活力＝（不同濃度HYP組的A值－空白對照組的A值）/（陰性對照組的A 值－空白對照組的A 值）×100%，根據結果篩選后續細胞實驗HYP的干預濃度。

2.7.3 細胞脂滴蓄積情況和TAG含量檢測

將HepG2 細胞分為正常對照組、模型組、HYP低濃度（50 μmol/L）組[8]、HYP高濃度（100 μmol/L）組[8]、HYP低濃度+GW6471 組、HYP高濃度+GW6471 組，每組3 個復孔。除正常對照組外，其他各組細胞均采用400mmol/L 的油酸和200 mmol/L 的棕櫚酸誘導24 h 模擬肝脂質沉積；此外，HYP 低、高濃度組細胞分別用50、100μmol/L 的HYP 干預24 h；HYP 低濃度+GW6471 組和HYP 高濃度+GW6471 組細胞在使用50、100 μmol/L 的HYP 干預前先用10 mmol/L 的GW6471 干預24 h[9]。隨后，按相應試劑盒說明書方法進行操作：經油紅O染色后使用顯微鏡觀察細胞內的脂滴蓄積情況，用Image J軟件分析單位面積內的脂滴，并計算相對脂滴面積占比；檢測細胞內TAG含量。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 8 軟件進行統計學分析和圖表繪制。符合正態分布的計量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，方差不齊時組間兩兩比較則采用Tamhane’sT2檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 各組小鼠體重和肝臟質量測定結果

與NFD 組比較，HFD 組小鼠的體重和肝臟質量均顯著升高（P＜0.05）；與HFD組比較，HYP組小鼠的體重差異無統計學意義，肝臟質量顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 各組小鼠肝組織病理形態學及脂質堆積觀察結果

HE 染色結果顯示，與NFD 組比較，HFD 組小鼠肝臟可見較多的脂肪空泡和炎癥細胞浸潤，肝索不清晰，肝小葉結構模糊；與HFD組比較，HYP組小鼠的病理形態學變化均有所緩解，脂肪空泡數量明顯減少。油紅O染色結果顯示，與NFD組比較，HFD組小鼠肝臟中的脂質堆積明顯增加；與HFD組比較，HYP組小鼠肝臟中的脂質堆積明顯減少。結果見圖1。

3.3 各組小鼠生化指標檢測結果

與NFD組比較，HFD組小鼠血清中AST、ALT、TAG含量和肝組織中TAG 含量均顯著升高（P＜0.05）；與HFD組比較，HYP組小鼠血清中AST、ALT、TAG含量和肝組織中TAG 含量均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.4 各組小鼠脂質代謝差異分析結果

正交偏最小二乘判別分析結果顯示，NFD組與HFD組、HFD組與HYP組組間區分明顯，說明各組間肝臟脂質組成存在差異，結果見圖2。

分析各組之間的差異脂質代謝物發現，NFD 組和HFD組共有139 個差異脂質代謝物，其中73 個脂質代謝物上調，66 個脂質代謝物下調；HFD 組和HYP 組共有199 個差異脂質代謝物，其中13 個脂質代謝物上調，186個脂質代謝物下調。評估脂質代謝物不同組別的貢獻程度發現，HFD 組上調的脂質類型涉及TAG、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）等；HYP組下調的脂質代謝物類型主要涉及TAG、DAG等。結果見圖3。

對NFD組、HFD組和HYP組差異脂質代謝物的交集進行分析發現，HFD組主要上調了TAG、DAG等脂質代謝物的相對水平；而HYP組能夠降低TAG、DAG等脂質代謝物的相對水平，從而改善肝臟脂質堆積。

3.5 各組小鼠肝組織中PPARα蛋白表達檢測結果

與NFD 組比較，HFD 組小鼠肝組織中PPARα蛋白表達水平顯著降低（1.00 vs. 0.59±0.07，P＜0.05）；與HFD 組比較，HYP 組小鼠肝組織中PPARα蛋白表達水平顯著升高（0.59±0.07 vs. 1.11±0.04，P＜0.05）。結果見圖4。

3.6 HYP介導PPARα 調控脂質合成的機制驗證結果

3.6.1 HYP干預濃度篩選結果

HepG2 細胞用0、10、100、1 000 μmol/L HYP干預后其細胞活力分別為（1.00±0.11）% 、（1.02±0.48）%（1.00±0.07）%、（0.95±0.38）%，各組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），表明0、10、100、1 000 μmol/L 濃度范圍內的HYP對細胞活力沒有不利影響。結合相關文獻[8]，本研究選擇50、100 μmol/L 作為后續細胞實驗HYP的低、高濃度。

3.6.2 HYP通過調控PPARα影響脂滴蓄積

與正常對照組比較，模型組細胞中脂滴蓄積顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，HYP 低、高濃度組細胞中脂滴蓄積均顯著減少（P＜0.05）；與HYP低濃度組比較，HYP低濃度+GW6471 組細胞中脂滴蓄積顯著增加（P＜0.05）；與HYP 高濃度組比較，HYP 高濃度+GW6471 組細胞中脂滴蓄積顯著增加（P＜0.05）。結果見圖5和表3。

3.6.3 HYP通過調控PPARα影響TAG含量

與正常對照組比較，模型組細胞中TAG含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，HYP 低、高濃度組細胞中TAG含量均顯著降低（P＜0.05）；與HYP低濃度組比較，HYP 低濃度+GW6471 組細胞中TAG 含量顯著升高（P＜0.05）；與HYP 高濃度組比較，HYP 高濃度+GW6471 組細胞中TAG含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

4 討論

NAFLD 是全球最常見的慢性肝病，其特征是肝臟中TAG蓄積過多，并與肥胖、胰島素抵抗、血脂異常和炎性疾病相關。NAFLD 的發病機制復雜，脂質代謝在NAFLD 病理過程中發揮了重要作用，具有調節脂質代謝和肝保護作用的中醫藥成分在NAFLD治療中具有獨特的效果[10]。其中，HYP 能夠減少氧化應激和炎癥反應[5]，在體外和體內研究中均顯示出對肝細胞的保護作用，能減少肝細胞的凋亡和壞死，抑制肝纖維化的進程，在多種肝臟疾病模型中均顯示出治療潛力[11]，但應用于NAFLD 的效果和機制尚不明確。本研究結果顯示，與HFD組比較，HYP組小鼠的肝臟脂肪變性、空泡化明顯改善，脂滴數量和脂質堆積均明顯減少，血清中ALT、AST含量均顯著降低，表明HYP對NAFLD具有良好的改善作用。脂質組學分析結果顯示，高脂飲食導致小鼠肝臟中TAG 含量明顯升高，這與早期的報道一致，即NAFLD的特征是肝內TAG沉積過多，導致肝細胞功能障礙、發生炎癥和纖維化[3]，而HYP 可顯著下調小鼠肝臟TAG、DAG水平，提示HYP改善小鼠NAFLD的機制涉及脂質合成過程。PPAR是一類核受體轉錄因子，其中的PPARα在調節脂質代謝和脂肪細胞分化方面具有重要作用[12]。PPARα被激活后，能促進脂肪酸氧化基因的表達，抑制脂質合成，從而改善NAFLD[13]。本研究結果顯示，與NFD組比較，HFD組小鼠肝組織中參與脂肪分解代謝的PPARα蛋白表達水平顯著降低，血清和肝組織中TAG含量顯著升高，提示高脂飲食誘導小鼠肝臟脂質堆積可能與PPARα表達水平有關。與HFD 組比較，HYP 組小鼠肝組織中PPARα蛋白表達水平顯著升高，血清和肝組織中TAG含量顯著降低，表明HYP 可能通過抑制脂質合成基因的表達來降低肝組織中TAG含量。為了進一步驗證HYP 是否通過調控PPARα 介導NAFLD 小鼠肝臟脂質合成途徑從而發揮改善NAFLD的作用，本研究利用HepG2 細胞進行了研究。結果發現，與正常對照組比較，模型組細胞中脂滴蓄積和TAG含量均顯著增加；與模型組比較，HYP低、高濃度組細胞中脂滴蓄積和TAG含量均顯著減少；而PPARα抑制劑GW6471 能顯著逆轉HYP對上述指標的改善作用，表明PPARα是HYP改善NAFLD的關鍵靶點。

綜上，HYP 能有效改善高脂飼料誘導的小鼠NAFLD，其機制可能與激活PPARα從而調控肝臟脂質合成有關。

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（收稿日期：2024-08-14 修回日期：2025-02-24）

（編輯：李勁）