柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)難治性癲癇大鼠神經(jīng)元損傷的影響及機(jī)制

中圖分類號(hào) R285.5；R742.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）06-0692-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.06.09

摘要 目的 探討柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及潛在作用機(jī)制。方法 采用側(cè)腦室注射海人藻酸建立難治性癲癇大鼠模型，將難治性癲癇大鼠隨機(jī)分為模型組、塞來昔布組（陽性對(duì)照）、柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組、柴胡加龍骨牡蠣湯+環(huán)氧合酶-2（COX-2）過表達(dá)組，每組12 只；另取12 只大鼠為假手術(shù)組（側(cè)腦室注射生理鹽水）。各組給予相應(yīng)的藥物/生理鹽水8 周后，采用Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)，觀察海馬組織CA3 區(qū)病理學(xué)變化和細(xì)胞凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)海馬組織COX-2、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；采用比色法檢測(cè)海馬組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性；分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blot 法檢測(cè)海馬組織COX-2、P糖蛋白（P-gp）mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠無癲癇發(fā)作；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠癲癇Racine 分級(jí)，海馬組織細(xì)胞凋亡率，COX-2、PGE2、TNF-α水平和MDA含量以及COX-2、P-gp 的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，SOD活性顯著降低（P＜0.05），海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠癲癇Racine 分級(jí)，海馬組織細(xì)胞凋亡率，COX-2、PGE2、TNF-α水平和MDA含量以及COX-2、P-gp 的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，SOD活性均顯著升高（P＜0.05），海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷減輕；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠上述指標(biāo)的改善被顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），海馬組織CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷加重。結(jié)論 柴胡加龍骨牡蠣湯可能通過抑制COX-2/PGE2 信號(hào)通路的激活，抑制炎癥和氧化應(yīng)激，從而減輕難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷。

關(guān)鍵詞 難治性癲癇；柴胡加龍骨牡蠣湯；神經(jīng)元損傷；環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2 信號(hào)通路

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元陣發(fā)性異常放電。癲癇患者大多數(shù)可通過常規(guī)藥物治療得到有效控制，但仍有近1/3 的癲癇患者對(duì)抗癲癇藥物不敏感，發(fā)展成為難治性癲癇，使治療難度增加[1]。神經(jīng)炎癥是癲癇發(fā)作后腦組織病理改變的主要原因[2]。研究表明，癲癇的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)與環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)增加及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）水平升高密切相關(guān)。COX-2作為前列腺素（prostaglandin，PG）合成的限速酶，可在癲癇發(fā)作時(shí)被激活，進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PG 等有害物質(zhì)，從而進(jìn)一步加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷。多項(xiàng)研究顯示，COX-2 已成為治療癲癇的潛在藥物靶點(diǎn)之一[3―4]。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯可抑制戊四氮誘導(dǎo)的癲癇小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)COX-2/PGE2 炎癥反應(yīng)通路，從而發(fā)揮抗癲癇作用[5]。然而，該方對(duì)難治性癲癇海馬神經(jīng)元損傷的影響尚不清楚。為此，本研究采用海人藻酸誘導(dǎo)難治性癲癇大鼠模型，探討柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)模型大鼠神經(jīng)元損傷的影響，并基于COX-2/PGE2 信號(hào)通路分析其潛在的作用機(jī)制，以期為柴胡加龍骨牡蠣湯治療難治性癲癇提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

68001型動(dòng)物腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司；BX61型電動(dòng)顯微鏡購自日本Olympus公司；MultiskanTM FC 型酶標(biāo)儀購自美國Thermo FisherScientific 公司；LightCycler? 480 Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）儀購自瑞士Roche公司。

1.2 主要藥品與試劑

柴胡加龍骨牡蠣湯（柴胡12 g、龍骨4.5 g、黃芩4.5 g、生姜4.5 g、鉛丹4.5 g、人參4.5 g、桂枝4.5 g、茯苓4.5 g、牡蠣4.5 g、半夏6 g、大黃6 g、大棗6 枚）由本院中藥制劑中心以水煮醇提法制備，質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計(jì)）。COX-2 抑制劑塞來昔布對(duì)照品（純度99.09%，批號(hào)HY-14398）購自美國MCE公司；COX-2 過表達(dá)慢病毒載體pcDNA3.1-COX-2（正向序列為5′-GGGGTACCGCCACCATGCTCTTCCGAGCTGTG-3′，反向序列為5′-CCGCTCGAGTTACAGCTCAGTTGAACGCC-3′）及其對(duì)照慢病毒空載體pcDNA3.1-NC（序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）均由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計(jì)、合成；引物序列由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)、合成；海人藻酸對(duì)照品（純度≥99%，批號(hào)K0250）購自美國Sigma-Aldrich 公司；大鼠COX-2、PGE2、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（貨號(hào)分別為ml058808、ml003036、ml002859）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號(hào)分別為G1120、T2196）均購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號(hào)分別為A001-3-2、A003-1-2）均購自南京建成生物工程研究所；兔源COX-2、P 糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（批號(hào)分別為ab179800、ab170904、ab9485、ab205718）均購自英國Abcam 公司；iScript cDNA 合成試劑盒（ 批號(hào)1708890）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

102 只雄性Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，7～8 周齡，體重220～240 g，購自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（鄂）2021-0009。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度為（55±5）%、每12 h光/暗循環(huán)的環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水。本研究獲得武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為HLK-202406546）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

實(shí)驗(yàn)分為造模組（n＝90）和假手術(shù)組（n＝12）。造模組采用側(cè)腦室注射海人藻酸的方法建立癲癇大鼠模型[6]：采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，將其頭部固定在腦立體定位儀上，局部備皮、消毒后，正中切開頭部皮膚，暴露顱骨和前囟，參考《大鼠腦立體定位圖譜》[7]進(jìn)行側(cè)腦室定位，以顱骨鉆鉆孔，使用微量注射器在硬腦膜下3.8 mm處下針，向右側(cè)腦室內(nèi)緩慢注射3 μL 海人藻酸溶液（0.5 μg/μL，以生理鹽水為溶劑，注射速度為1μL/min），注射完畢后留針5 min。向假手術(shù)組大鼠側(cè)腦室注射0.9% 生理鹽水，其余操作同前。造模后按照Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]評(píng)定大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別，若造模后2 h 內(nèi)出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作表示癲癇大鼠造模成功。為降低大鼠死亡率，造模組大鼠在造模2 h 后通過腹腔注射地西泮（10 mg/kg，以生理鹽水為溶劑）終止癲癇持續(xù)狀態(tài)。最終，造模組有80 只大鼠在造模2 h 內(nèi)出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作，造模成功率為88.89%。將造模成功的大鼠于每天同一時(shí)間給予卡馬西平125 mg/kg（以生理鹽水為溶劑）灌胃，每天1 次，給藥28 d 后連續(xù)7 d 觀察大鼠癲癇發(fā)作時(shí)的腦電圖。若大鼠出現(xiàn)Ⅰ級(jí)及以上癲癇發(fā)作且腦電圖異常（頻率＞20 Hz或波幅＞80 μV），即表示難治性癲癇大鼠造模成功[8]。在篩選過程中，10 只大鼠死亡，8只大鼠造模失敗，最終獲得62 只難治性癲癇大鼠。

取60 只難治性癲癇大鼠隨機(jī)分為模型組、塞來昔布組（陽性對(duì)照）、柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組、柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組，每組12 只。塞來昔布組和柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠分別于每天同一時(shí)間灌胃20 mg/kg 塞來昔布（以生理鹽水為溶劑）[9]或12 g/kg 柴胡加龍骨牡蠣湯1 次；柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組和柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠每天灌胃12 g/kg 柴胡加龍骨牡蠣湯1 次，并分別通過尾靜脈注射慢病毒空載體或COX-2 過表達(dá)慢病毒載體200 μL（病毒滴度均為5.0×108 TU/mL），每周1 次；假手術(shù)組和模型組大鼠則給予灌胃+尾靜脈注射0.9% 生理鹽水。所有大鼠均連續(xù)給藥/生理鹽水8 周。

2.2 大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)觀察

末次給藥結(jié)束后，根據(jù)Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]評(píng)估各組大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)，具體標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)，癲癇未發(fā)作；1級(jí)，面部肌肉抽搐；2 級(jí)，頸部肌肉抽搐；3 級(jí)，單側(cè)前肢陣攣、抽搐；4 級(jí)，雙側(cè)前肢陣攣、抽搐、身體直立；5 級(jí)，全身強(qiáng)直陣攣、雙側(cè)后肢和身體直立、倒地。

2.3 大鼠海馬組織CA3 區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化觀察

Racine 分級(jí)結(jié)束后，將大鼠斷頭并立即將腦組織取出置于冰板上，迅速剖出海馬體，每組隨機(jī)選取6 只大鼠的海馬組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5 μm），進(jìn)行HE染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織CA3 區(qū)病理學(xué)變化并拍照。

2.4 大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下制備的海馬組織石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、水化后，使用TUNEL反應(yīng)混合液進(jìn)行孵育和染色處理，每組隨機(jī)選擇5 個(gè)視野在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)TUNEL陽性細(xì)胞（呈綠色）數(shù)量和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）＝TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 大鼠海馬組織COX-2、PGE2、TNF-α 水平檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)。每組取“2.3”項(xiàng)下剩余6 只大鼠的海馬組織，分成三部分，其中兩部分組織凍存，剩余一部分稱重后，使用組織勻漿器在冰上勻漿，并在4 ℃下以2 500×g離心15 min。收集上清液并儲(chǔ)存在－80 ℃冰箱中，采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度后，檢測(cè)大鼠海馬組織COX-2、PGE2、TNF-α水平。

2.6 大鼠海馬組織MDA含量和SOD活性檢測(cè)

采用比色法檢測(cè)。從冰箱中取出“2.5”項(xiàng)下大鼠海馬組織勻漿上清液，按照試劑盒說明書方法檢測(cè)MDA含量和SOD活性。

2.7 大鼠海馬組織COX-2、P-gp蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下部分海馬組織于勻漿管中，加入RIPA裂解液研磨離心（4 ℃、2 500×g、15 min），取上清，采用BCA 法測(cè)定上清液中的蛋白濃度。采用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用PVDF 膜轉(zhuǎn)移分離的蛋白。將膜用5% 脫脂奶粉封閉2 h 后，向膜中加入COX-2（稀釋比例1∶1 500）、P-gp（稀釋比例1∶1 000）和GAPDH（稀釋比例1∶4 000）抗體，4 ℃下孵育過夜；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例1∶4 000）。蛋白條帶使用ECL顯影，并使用Image J 軟件進(jìn)行定量分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 大鼠海馬組織COX-2、P-gp mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-qPCR 法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下部分海馬組織，采用TRIzol 試劑提取總RNA，并用NanoDrop法測(cè)定其濃度和純度。之后，使用cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，再在RT-qPCR 儀上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4μL，cDNA 5 μL，無菌超純水4.2 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，共28 個(gè)循環(huán)。使用2－ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。COX-2 正向引物為5′-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3′，反向引物為5′-ACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為211 kb；P-gp 正向引物為5′-AACACCCTGGTTGGTGAGAG-3′，反向引物為5′-CACCATCAAAACCAGCAATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為185 kb；GAPDH正向引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向引物為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為112 kb。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s 表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)比較

假手術(shù)組、模型組、塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組、柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠癲癇Racine 分級(jí)分別為0、（4.41±0.45）、（2.18±0.27）、（2.23±0.30）、（2.20±0.29）、（3.96±0.38）級(jí)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠癲癇Racine 分級(jí)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠癲癇Racine 分級(jí)均顯著降低（P＜0.05）；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠癲癇Racine分級(jí)顯著升高（P＜0.05）。

3.2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)病理形態(tài)學(xué)比較

假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；與假手術(shù)組比較，模型組可見大鼠海馬神經(jīng)元排列疏松，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞壞死，出現(xiàn)核固縮，胞質(zhì)空泡樣變性；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠神經(jīng)元排列較整齊，輪廓較清晰，胞質(zhì)空泡化程度明顯減輕；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠神經(jīng)元排列疏松，部分核固縮，胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重。結(jié)果見圖1。

3.3 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況比較

假手術(shù)組、模型組、塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組、柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2過表達(dá)組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率分別為（5.30±1.09）%、（34.21±2.14）%、（12.87±1.55）%、（13.02±1.62）%、（12.94±1.58）%、（26.10±1.97）%。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

3.4 各組大鼠海馬組織COX-2、PGE2、TNF-α水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織COX-2、PGE2、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠海馬組織上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠海馬組織上述指標(biāo)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.5 各組大鼠海馬組織MDA含量和SOD活性比較

模型組大鼠海馬組織MDA含量顯著高于假手術(shù)組，SOD活性顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠海馬組織MDA 含量均顯著降低，SOD 活性均顯著升高（P＜0.05）；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠海馬組織MDA 含量顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.6 各組大鼠海馬組織COX-2、P-gp 蛋白和mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織COX-2、Pgp蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布組、柴胡加龍骨牡蠣湯組大鼠海馬組織COX-2、P-gp 蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與柴胡加龍骨牡蠣湯組、柴胡加龍骨牡蠣湯+空載組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯+COX-2 過表達(dá)組大鼠海馬組織COX-2、P-gp 蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表3、見圖3。

4 討論

一般認(rèn)為，患者經(jīng)過適當(dāng)?shù)乃幬镏委煟ò▎嗡幹委熀吐?lián)合用藥）后，仍無法有效控制癲癇發(fā)作，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（如2 年以上），可診斷為難治性癲癇，其治療除藥物治療外，還可考慮手術(shù)、神經(jīng)刺激等方式，但風(fēng)險(xiǎn)較高[10]。中醫(yī)藥在難治性癲癇的治療中可能具有潛在優(yōu)勢(shì)。

神經(jīng)元損傷、退化和細(xì)胞凋亡是癲癇持續(xù)的主要表現(xiàn)，可導(dǎo)致認(rèn)知障礙。癲癇發(fā)作時(shí)，神經(jīng)元會(huì)經(jīng)歷異常的電活動(dòng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞膜通透性改變和能量代謝障礙，加劇神經(jīng)元損傷和死亡；海馬神經(jīng)元損傷后，還可能引發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放大量的炎癥因子和氧化應(yīng)激產(chǎn)物，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元并促進(jìn)癲癇的發(fā)生和發(fā)展[11―12]。COX-2 可通過生成PGE2，介導(dǎo)大量炎癥因子（如TNF-α）的產(chǎn)生，同時(shí)產(chǎn)生大量的自由基（如超氧陰離子、過氧化氫等），進(jìn)而發(fā)生一系列炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。海人藻酸模型能較好地模擬多種癲癇發(fā)作類型，且海人藻酸引起的病理生理改變與人類難治性癲癇的臨床表現(xiàn)和病理生理過程相似，故海人藻酸誘導(dǎo)的大鼠難治性癲癇模型是研究人類難治性癲癇的理想模型[13]。研究顯示，海人藻酸誘發(fā)癲癇后，大鼠腦內(nèi)COX-2 表達(dá)和PGE2 水平升高，并促進(jìn)海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元死亡[14]。P-gp 是一種多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于血腦屏障中，其主要功能是通過三磷酸腺苷依賴的泵運(yùn)機(jī)制，將多種外來物質(zhì)（包括藥物）從細(xì)胞內(nèi)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而保護(hù)細(xì)胞免受這些物質(zhì)的損害。然而，在難治性癲癇中，P-gp 的這種功能卻可能導(dǎo)致抗癲癇藥物被泵出作用靶位，無法有效作用于病灶區(qū)，從而導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性[15]。研究表明，在難治性癲癇模型大鼠海馬組織中Pgp呈高表達(dá)，這可能是導(dǎo)致難治性癲癇患者耐藥的重要原因之一[15]。塞來昔布是一種非甾體抗炎藥，有研究證實(shí)，塞來昔布能通過降低COX-2 活性來抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，延緩癲癇大鼠海馬的結(jié)構(gòu)變化和海馬神經(jīng)元的缺失，減少癲癇發(fā)作[9]。因此，本研究選擇塞來昔布作為陽性對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，在海人藻酸誘導(dǎo)的大鼠難治性癲癇模型中，海馬組織細(xì)胞凋亡率、COX-2、PGE2、TNF-α水平和MDA含量以及COX-2、P-gp 表達(dá)均顯著升高，SOD活性顯著降低，與上述研究結(jié)果一致，表明海人藻酸可誘導(dǎo)大鼠海馬組織發(fā)生細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并產(chǎn)生耐藥性，與難治性癲癇的病理特征一致，提示難治性癲癇大鼠模型復(fù)制成功；而柴胡加龍骨牡蠣湯可顯著降低難治性癲癇大鼠模型海馬組織細(xì)胞凋亡率、COX-2、PGE2、TNF-α水平和MDA含量以及COX-2、P-gp 表達(dá)，升高SOD 活性，與陽性對(duì)照藥塞來昔布的作用基本一致。以上結(jié)果表明，柴胡加龍骨牡蠣湯可抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷。

COX-2 為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，是大腦神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激的誘發(fā)因素。據(jù)報(bào)道，COX-2/PGE2 信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致戊四氮誘導(dǎo)的癲癇小鼠海馬神經(jīng)元損傷及認(rèn)知障礙，而塞來昔布可顯著減少海馬神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷，其作用可能與對(duì)COX-2 的抑制有關(guān)[16]。此外，抑制COX-2 可阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的離體大鼠腦毛細(xì)血管中P-gp 的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的增強(qiáng)以及癲癇大鼠體內(nèi)腦毛細(xì)血管中癲癇發(fā)作引起的P-gp 表達(dá)上調(diào)[17]。另有研究顯示，慢性癲癇大鼠腦內(nèi)P-gp 表達(dá)的增強(qiáng)與抗癲癇藥物苯妥英腦滲透的顯著減少有關(guān)，COX-2 抑制劑可降低海馬旁回和腹側(cè)海馬中P-gp 表達(dá)，促進(jìn)苯妥英的腦遞送[18]。本研究中，塞來昔布既是難治性癲癇的陽性藥物，也是COX-2 抑制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的改善作用與塞來昔布一致，說明柴胡加龍骨牡蠣湯可能通過下調(diào)COX-2/PGE2 信號(hào)通路改善難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷。進(jìn)一步采用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)COX-2 進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果顯示，過表達(dá)COX-2 可減弱柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的改善作用。以上提示，柴胡加龍骨牡蠣湯能減輕難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷，其作用機(jī)制可能是通過抑制COX-2/PGE2 信號(hào)通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯可能通過抑制COX-2/PGE2 信號(hào)通路的激活，抑制炎癥和氧化應(yīng)激，減輕難治性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷。未來可對(duì)難治性癲癇大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入分析柴胡加龍骨牡蠣湯治療難治性癲癇的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] MESRAOUA B，BRIGO F，LATTANZI S，et al. Drugresistant

epilepsy：definition，pathophysiology，and management[

J]. J Neurol Sci，2023，452：120766.

[ 2 ] CHEN Y，NAGIB M M，YASMEN N，et al. Neuroinflammatory

mediators in acquired epilepsy：an update[J]. Inflamm

Res，2023，72（4）：683-701.

[ 3 ] ROJAS A，CHEN D，GANESH T，et al. The COX-2/prostanoid

signaling cascades in seizure disorders[J]. Expert

Opin Ther Targets，2019，23（1）：1-13.

[ 4 ] FISCHER A，HüLSMEYER V I，MUNOZ SCHMIEDER

V P，et al. Cyclooxygenase-2 inhibition as an add-on strategy

in drug resistant epilepsy：a canine translational study

[J]. Front Vet Sci，2022，9：864293.

[ 5 ] 單萍，張繼龍，笱玉蘭，等. 柴胡龍骨牡蠣湯下調(diào)星形膠

質(zhì)細(xì)胞環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2 的表達(dá)[J]. 世界中醫(yī)藥，

2022，17（23）：3343-3346.

SHAN P，ZHANG J L，GOU Y L，et al. Chaihu longgu

muli decoction downregulates the expression of COX-2/

PGE2 in hippocampal astrocytes[J]. World Chin Med，

2022，17（23）：3343-3346.

[ 6 ] 王瀟慧，鄢澤然，張青，等. 柴貝止癇湯調(diào)節(jié)海人酸致癇

大鼠腦組織耐藥蛋白MRP2 表達(dá)的研究[J]. 中華中醫(yī)藥

雜志，2016，31（12）：4961-4965.

WANG X H，YAN Z R，ZHANG Q，et al. Study on regulation

of Chaibei zhixian decoction on expression of MRP2

protein in brain tissue of kainic acid-induced epilepsy rats

[J]. China J Tradit Chin Med Pharm，2016，31（12）：4961-

4965.

[ 7 ] 帕克森勒斯·喬治，沃森·查爾斯. 大鼠腦立體定位圖譜

[M]. 諸葛啟釧，譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：2-30.

PAXINOS G，WATSON C. Stereoscopic mapping of rat

brain[M]. ZHUGE Q C，translated.Beijing：People’s Health

Publishing House，2005：2-30.

[ 8 ] 王田，岳玉琴. 柴貝止癇湯調(diào)控P38MAPK通路改善難

治性癲癇大鼠行為學(xué)及對(duì)海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

[J]. 中藥材，2023，46（6）：1531-1536.

WANG T，YUE Y Q. Chaibei zhixian decoction regulates

the P38MAPK pathway to improve the behavior of refractory

epilepsy rats and its effect on the ultrastructure of hippocampal

neurons[J]. J Chin Med Mater，2023，46（6）：

1531-1536.

[ 9 ] CHEN L，NIU Q S，GAO C B，et al. Celecoxib treatment

alleviates cerebral injury in a rat model of post-traumatic

epilepsy[J]. PeerJ，2023，11：e16555.

[10] KHANKHANIAN P，LEE A M，DREES C N，et al. Combined

VNS-RNS neuromodulation for epilepsy[J]. J Clin

Neurophysiol，2022，39（2）：e5-e9.

[11] VERGAELEN M，MANZELLA S，VONCK K，et al. Increased

dentate gyrus excitability in the intrahippocampal

kainic acid mouse model for temporal lobe epilepsy[J]. Int

J Mol Sci，2024，25（1）：660.

[12] GIOVANNINI G，BEDIN R，F(xiàn)ERRARO D，et al. Serum

neurofilament light as biomarker of seizure-related neuronal

injury in status epilepticus[J]. Epilepsia，2022，63（1）：

e23-e29.

[13] ?UKAWSKI K，CZUCZWAR S J. Oxidative stress and

neurodegeneration in animal models of seizures and epilepsy[

J]. Antioxidants（Basel），2023，12（5）：1049.

[14] KAWAGUCHI K，HICKEY R W，ROSE M E，et al. Cyclooxygenase-

2 expression is induced in rat brain after

kainate-induced seizures and promotes neuronal death in

CA3 hippocampus[J]. Brain Res，2005，1050（1/2）：

130-137.

[15] 劉沖沖，孫江燕，袁斯遠(yuǎn)，等. 柴貝止癇湯及α細(xì)辛醚對(duì)

難治性癲癇大鼠腦內(nèi)P-gp 表達(dá)及卡馬西平含量的影響

[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（3）：1203-1206.

LIU C C，SUN J Y，YUAN S Y，et al. Effects of Chaibei

zhixian decoction and α-asarone on the P-gp expression

and carbamazepine content in the brain of intractable epileptic

rats[J]. China J Tradit Chin Med Pharm，2020，35

（3）：1203-1206.

[16] ZHU X J，YAO Y Y，YANG J R，et al. COX-2-PGE2 signaling

pathway contributes to hippocampal neuronal injury

and cognitive impairment in PTZ-kindled epilepsy mice

[J]. Int Immunopharmacol，2020，87：106801.

[17] ZIBELL G，UNKRüER B，PEKCEC A，et al. Prevention

of seizure-induced up-regulation of endothelial Pglycoprotein

by COX-2 inhibition[J]. Neuropharmacology，

2009，56（5）：849-855.

[18] VAN VLIET E A，ZIBELL G，PEKCEC A，et al. COX-2

inhibition controls P-glycoprotein expression and promotes

brain delivery of phenytoin in chronic epileptic rats

[J]. Neuropharmacology，2010，58（2）：404-412.

（收稿日期：2024-09-19 修回日期：2025-01-15）

（編輯：舒安琴）