LncRNA MALAT1對骨肉瘤細胞阿霉素耐藥性的影響機制研究

中圖分類號 R979.1+4；R738.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）06-0698-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.06.10

摘要 目的 探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）與骨肉瘤（OS）細胞阿霉素（DOX）耐藥性的關系及作用機制。方法 將MG-63 和MG-63/DOX細胞用不同濃度DOX（0、0.01、0.05、0.1、1 μmol/L）處理后，以CCK-8 法檢測其存活率和半數抑制濃度（IC50）；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測MG-63 和MG-63/DOX細胞中LncRNA MALAT1 表達。將MG-63/DOX 細胞分為Control（對照）組、敲低LncRNA MALAT1 的陰性對照（sh-NC）組、sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+抑制（anti）-NC 組、sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組。檢測各組MG-63/DOX 細胞中LncRNA MALAT1、miR-154-5p、細胞周期素D1（CCND1）mRNA相對表達量，采用CCK-8 法、劃痕實驗、Transwell 實驗、流式細胞儀分別檢測敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響；采用Western blot法檢測MG-63/DOX細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）、CCND1蛋白的表達；采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測LncRNA MALAT1 與miR-154-5p、miR-154-5p 與CCND1 之間的相互作用。結果 與0 μmol/LDOX比較，0.01、0.05、0.1、1 μmol/L DOX均能降低MG-63和MG-63/DOX細胞（0.01 μmol/L DOX除外）的存活率（P＜0.05），IC50分別為0.07、0.13 μmol/L。sh-MALAT1組MG-63/DOX細胞存活率、遷移數、侵襲數、劃痕愈合率、LncRNA MALAT1 mRNA表達、CCND1 mRNA和蛋白表達、PCNA蛋白表達均顯著低于sh-NC組、Control組，細胞凋亡率和miR-154-5p表達顯著高于sh-NC組、Control組（P＜0.05）；相較于sh-MALAT1組，sh-MALAT1+anti-miR-154-5p組的上述生物學作用均被逆轉（P＜0.05）。在轉染MALAT1-野生型（WT）和CCND1-WT的MG-63/DOX細胞中，miR-154-5p 模擬物（mimic）組的熒光素酶活性均顯著低于其陰性對照組（P＜0.05）。結論 敲低LncRNA MALAT1可以抑制OS細胞的DOX耐藥性，其機制可能是通過靶向miR-154-5p/CCND1軸實現的。

關鍵詞 長鏈非編碼RNA；肺腺癌轉移相關轉錄本1；微小RNA-154-5p；細胞周期蛋白D1；骨肉瘤；阿霉素；耐藥性

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是兒童和青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，其主要發生在長骨干骺端，如股骨、脛骨和肱骨，容易侵襲局部組織并進一步發展為全身轉移[1]。OS 的治療方法包括手術切除和化療。研究顯示，非轉移性OS患者的5 年生存率達70%[2]，但OS患者仍面臨化療耐藥、局部復發、肺轉移等諸多挑戰。化療耐藥可分為原發性耐藥和獲得性耐藥，阿霉素（doxorubicin，DOX）為OS的常用化療藥物，約50% 的OS患者因DOX 獲得性耐藥而影響了治療效果[3]。因此，了解OS 細胞DOX化療耐藥的分子機制對開發新的治療方法并最終改善OS患者的預后至關重要。

目前已發現有多種RNA[如長鏈非編碼RNA（longnoncoding RNA，LncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）等]參與調控OS 的進展、轉移和化學耐藥性[4]。肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinomatranscript 1，MALAT1）在哺乳動物中廣泛表達并具有進化保守性，研究顯示，LncRNA MALAT1是OS 的潛在治療靶點[5]。有報道發現，LncRNAMALAT1 可以調控乳腺癌的進展和DOX耐藥性[6]，但其能否調節OS的耐藥性尚不清楚。miR-154-5p 可在多種癌癥中發揮抑癌基因作用，相關研究顯示，miR-154-5p在DOX耐藥OS細胞中表達下調[7]。細胞周期素D1（cyclinD1，CCND1）位于人11q13 染色體上，可參與包括OS 在內的多種癌癥細胞周期和腫瘤增殖的調控[8]。本研究團隊前期利用Starbase 網站分析發現，LncRNAMALAT1 與miR-154-5p、miR-154-5p 與CCND1 之間存在潛在的結合位點?；诖?，本研究擬探討LncRNAMALAT1 靶向miR-154-5p/CCND1 軸與OS細胞DOX耐藥性的關系及可能的作用機制，以期克服OS 的化療耐藥性，進而提高其治療效果。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DMi1 型倒置顯微鏡（德國Leica 公司）、MSFLO型流式細胞儀（杭州譜育科技發展有限公司）、9003021 型實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）儀[凱杰企業管理（上海）有限公司]、 MultiskanFC 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、RCCS-4HD型細胞培養儀（美國Synthecon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

DOX（貨號51410ES10，純度≥98%）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；敲低LncRNA MALAT1（sh-MALAT1）及其陰性對照（sh-NC）、抑制miR-154-5p（anti-miR-154-5p）及其陰性對照（anti-NC）質粒均購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；DMEM培養基（貨號iCell-0003）購自鏡像綺點（上海）細胞技術有限公司；總RNA提取試劑盒（TRIzol 法）、含脫氧核糖核酸酶Ⅰ逆轉錄試劑盒（貨號分別為EZB-TZ1-L、RT3C）均購自上海海方生物技術有限公司；RT-qPCR 檢測試劑盒（貨號QPG-023）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（貨號HB-CCK-8）購自漢恒生物工程（上海）有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（貨號70-APCC101）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒（貨號KL1DBE095）購自上海康朗生物科技有限公司；特超敏ECL化學發光檢測試劑盒（貨號EUL002）購自廣州博鷺騰生物科技有限公司；熒光素酶報告基因測試盒（貨號SLLU-200）購自北京拜爾迪生物技術有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、兔源增殖細胞核抗原（proliferatingcell nuclear antigen，PCNA）、兔源CCND1、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（貨號分別為ab226408、ab201673、ab16663、ab9482）均購自英國Abcam 公司；PCR引物由蘇州艾比拓生物技術有限公司設計、合成。

1.3 細胞來源

OS 親代細胞MG-63、耐DOX 的OS 細胞MG-63/DOX（貨號分別為AM7868、AM7872）均購自美國典型菌種保藏中心。

2 方法

2.1 MG-63和MG-63/DOX細胞對DOX的敏感性檢測

分別將懸浮在200 μL 培養基（含細胞5×103個）中的MG-63 和MG-63/DOX細胞接種于96 孔板，分別加入0、0.01、0.05、0.1、1 μmol/L 的DOX處理（采用濃度梯度篩選確定濃度），作為實驗組，選擇未經任何處理的正常細胞作為對照組，沒有細胞只有培養基等其他成分的作為空白組，在37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h 后，每孔加入體積為10 μL的CCK-8 試劑，于37 ℃下孵育2 h，使用酶標儀于450 nm 波長處檢測光密度（optical density，OD），每組設3 個復孔，每次2 個平行，計算細胞存活率和半數抑制濃度（IC50），細胞存活率（%）＝（實驗組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%。

2.2 MG-63 和MG-63/DOX細胞LncRNA MALAT1 表達檢測

采用RT-qPCR 法檢測。使用Trizol 試劑提取MG-63 和MG-63/DOX 細胞的總RNA，合成cDNA，LncRNAMALAT1 以GAPDH為內參，配置20 μL的反應體系：定量酶10 μL，cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，去離子水7 μL；反應條件：98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，共35 個循環。根據2－ΔΔCt計算MG-63 和MG-63/DOX細胞中LncRNA MALAT1 的相對表達量。引物序列及產物長度見表1。

2.3 miR-154-5p/CCND1 軸與LncRNA MALAT1 靶向關系的驗證

2.3.1 細胞分組與轉染

將10% 胎牛血清加入含0.1 μmol DOX（根據“2.1”項下結果確定）的DMEM培養基，培養MG-63/DOX 細胞，每2～3 d 進行換液。取對數生長期的MG-63/DOX細胞分為Control 組（正常培養）、sh-NC組、sh-MALAT1組、sh-MALAT1+anti-NC 組、sh-MALAT1+anti-miR-154-5p組，分別轉染相應質粒。

2.3.2 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1 mRNA檢測

采用“2.2”項下方法檢測各組MG-63/DOX 細胞中LncRNA MALAT1、miR-154-5p（ 內參U6）、CCND1mRNA（內參GAPDH）的相對表達量，以驗證轉染效率。

2.3.3 MG-63/DOX細胞增殖檢測

采用CCK-8 法檢測。根據“2.3.1”項下方法將MG-63/DOX細胞進行分組，再按“2.1”項下操作檢測各組細胞的增殖情況，并計算細胞存活率。

2.3.4 MG-63/DOX細胞遷移和侵襲檢測

（1）采用劃痕實驗檢測。根據“2.3.1”項下方法進行分組，接種500 個MG-63/DOX 細胞于6 孔板至80%～90% 融合時，用10 μL移液器槍頭取細胞懸浮液在培養皿中間劃痕，于0、24 h 在顯微鏡下觀察細胞的形態變化，并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）＝（初始劃痕寬度－細胞遷移距離）/初始劃痕寬度×100%。

（2）采用Transwell 實驗檢測。根據“2.3.1”項下方法將MG-63/DOX 細胞進行分組。在侵襲實驗上室預涂Matrigel 基質膠，收集轉染的MG-63/DOX 細胞，將細胞重懸于200 μL 無血清培養基中，以2×104個/孔加入上室，下室加入500 μL含20% 胎牛血清的培養基，孵育36h 后，固定上室膜并染色，在顯微鏡下隨機選擇5 個視野，統計遷移或侵襲細胞數。

2.3.5 MG-63/DOX細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀檢測。根據“2.3.1”項下方法將MG-63/DOX 細胞進行分組。收集細胞，重懸調整密度為1.0×106個/mL，加入100 μL含有Annexin Ⅴ-FITC/PI的溶液中，室溫孵育20 min 后，加入500 μL 孵育緩沖液，檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率＝（凋亡細胞數/總細胞數）×100%。

2.3.6 MG-63/DOX細胞中PCNA、CCND1蛋白表達檢測

采用Western blot 法檢測。根據“2.3.1”項下方法將MG-63/DOX 細胞進行分組。采用改良的RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟裂解細胞，提取蛋白質，采用BCA法檢測蛋白濃度，再用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到聚偏氟乙烯膜上與GAPDH（稀釋度1∶1 000）、PCNA（稀釋度1∶5 000）、CCND1（稀釋度1∶500）特異性抗體共同孵育，再加入二抗（稀釋度1∶1 000），室溫孵育1 h。采用Image J 軟件分析，以目標蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.3.7 LncRNA MALAT1、miR-154-5p、CCND1 相互作用檢測

采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測。將LncRNAMALAT1-野生型（wild type，WT）和LncRNA MALAT1-突變型（mutated type，MUT）、CCND1-MUT 和CCND1-WT片段分別克隆到pmirGLO 載體中，再與miR-154-5p模擬物（mimic）和其陰性對照（mimic-NC）共轉染到MG-63/DOX細胞中，48 h 后檢測熒光素酶活性，以分析LncRNA MALAT1與miR-154-5p、miR-154-5p與CCND1之間的相互作用。

2.4 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。滿足正態分布的計量資料以x±s 表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 不同濃度DOX 中MG-63 和MG-63/DOX 細胞存活率比較

與0 μmol/L DOX 組比較，0.01、0.05、0.1、1 μmol/LDOX 組MG-63 細胞和MG-63/DOX 細胞（0.01 μmol/LDOX 組除外）存活率均顯著降低（P＜0.05），詳見表2。經計算，DOX 對MG-63 細胞的IC50 為0.07 μmol/L，對MG-63/DOX細胞的IC50為0.13 μmol/L。

3.2 MG-63 和MG-63/DOX 細胞LncRNA MALAT1mRNA表達檢測結果

MG-63/DOX細胞中LncRNA MALAT1 mRNA相對表達量顯著高于MG-63 細胞（2.36±0.35 vs.1.00±0.32，P＜0.05）。

3.3 敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX 細胞中DOX耐藥相關mRNA表達的影響

sh-MALAT1 組MG-63/DOX 細胞中LncRNAMALAT1、CCND1 mRNA相對表達量顯著低于Control組、sh-NC 組，miR-154-5p 相對表達量顯著高于Control組、sh-NC組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX 細胞中CCND1 mRNA相對表達量顯著高于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC 組，miR-154-5p相對表達量顯著低于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC組（P＜0.05）。結果見表3。

3.4 敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX 細胞增殖的影響

sh-MALAT1 組MG-63/DOX 細胞存活率顯著低于Control 組、sh-NC 組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX 細胞存活率顯著高于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC 組（P＜0.05）。結果見表4。

3.5 敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX 細胞遷移的影響

劃痕實驗結果顯示，sh-MALAT1 組MG-63/DOX 細胞劃痕愈合率顯著低于Control 組、sh-NC組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX 細胞劃痕愈合率顯著高于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC組（P＜0.05）。結果見表4、圖1。

Transwell 實驗結果顯示，sh-MALAT1 組MG-63/DOX細胞遷移數和侵襲數均顯著低于Control 組、sh-NC組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX細胞遷移數和侵襲數均顯著高于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC組（P＜0.05）。結果見表4。

3.6 敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX 細胞凋亡的影響

sh-MALAT1 組MG-63/DOX 細胞凋亡率顯著高于Control 組、sh-NC 組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX 細胞凋亡率顯著低于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC 組（P＜0.05）。結果見表4、圖2。

3.7 敲低LncRNA MALAT1 對MG-63/DOX 細胞中PCNA、CCND1 蛋白表達的影響

sh-MALAT1 組MG-63/DOX 細胞中PCNA、CCND1蛋白相對表達量均顯著低于Control 組、sh-NC 組（P＜0.05）；sh-MALAT1+anti-miR-154-5p 組MG-63/DOX 細胞中PCNA、CCND1 蛋白相對表達量均顯著高于sh-MALAT1 組、sh-MALAT1+anti-NC 組（P＜0.05）。結果見表3、圖3。

3.8 熒光素酶活性檢測結果

在轉染MALAT1-WT 和CCND1-WT 的MG-63/DOX細胞中，與mimic-NC組比較，miR-154-5p mimic 組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。結果見表5。

4 討論

OS 由產生類骨質或未成熟骨骼的間充質細胞組成，具有惡性程度高、侵襲性強、易復發、易早期遠處轉移的特點，約40% 的OS患者在最初診斷時已經發生轉移[9]。DOX是OS患者常用的化療藥物之一，DOX可以破壞DNA的合成和復制，通過多種方式誘導癌細胞死亡[10]。研究發現，長期使用DOX等化療藥物可導致耐藥性的產生[11]。OS 對DOX的耐藥是一個多因素過程，其作用機制尚不清晰。本研究通過探討OS 細胞對DOX耐藥的分子機制，以期改善OS患者的治療效果和預后。

4.1 敲低LncRNA MALAT1 通過抑制OS細胞對DOX的耐藥性

LncRNA 憑借其一級序列和空間結構，可以與DNA、RNA和蛋白質相互作用，在各種生物過程和疾病中發揮調控作用[12]。LncRNA MALAT1 在OS 中發揮致癌基因作用，Yang 等[13]研究顯示，LncRNA MALAT1 表達上調與OS 患者較低的生存率有關，LncRNAMALAT1 過表達可通過靶向miR-873-5p/Rho 相關蛋白激酶信號軸，促進OS 細胞的增殖、遷移、侵襲，抑制OS細胞凋亡。Li 等[14]研究顯示，骨髓間充質干細胞來源的細胞外囊泡可通過調控LncRNA MALAT1/miR-143/神經膜蛋白2/Wnt/β-連環蛋白軸在體外促進OS細胞的增殖、侵襲和遷移，在體內促進裸鼠腫瘤生長。Yue 等[6]研究顯示，抑制LncRNA MALAT1 可上調miR-570-3p 表達，從而抑制耐DOX乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提高乳腺癌細胞對DOX 的敏感性。本研究發現，在DOX 耐藥OS 細胞中敲低LncRNA MALAT1 可以抑制DOX耐藥OS 細胞的增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，提示敲低LncRNA MALAT1 可能通過抑制DOX 耐藥OS 細胞的惡性生物學行為，抑制OS 的進展，增強化療敏感性，進而提高OS的治療效果。

4.2 敲低LncRNA MALAT1 通過上調miR-154-5p 的表達抑制OS細胞的DOX耐藥性

miRNA 是一組內源性的非編碼RNA，LncRNA 與編碼RNA共享miRNA 反應元件，LncRNA 可以海綿化miRNA 并促進其靶標mRNA 的翻譯[15]。Tian 等[16]研究顯示，OS 組織中的miR-154-5p 表達下調，過表達miR-154-5p 可抑制E2F轉錄因子5 的表達，進而抑制OS細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡。Zhou等[17]研究顯示，過表達circ-ATAD1 可抑制miR-154-5p 的表達，從而促進OS細胞的侵襲和遷移。本研究團隊前期利用Starbase 網站分析發現，LncRNA MALAT1與miR-154-5p 之間存在靶向結合位點。本研究結果表明，LncRNA MALAT1 可以靶向負調控miR-154-5p；敲低LncRNA MALAT1 導致miR-154-5p 表達上調，而抑制miR-154-5p 則可以逆轉敲低LncRNA MALAT1 對DOX耐藥OS細胞生物學的作用，提示敲低LncRNA MALAT1可能通過上調miR-154-5p 表達抑制DOX耐藥OS 細胞的惡性生物學行為，提高OS細胞對DOX的敏感性。

4.3 miR-154-5p通過靶向負調控CCND1 抑制OS細胞的DOX耐藥性

CCND1 是一種效應基因，在真核細胞中普遍存在，其主要功能是調節細胞從G1 期向S 期轉變進而參與細胞周期進程，在多種癌癥組織中呈高表達[18]。Xin 等[19]研究顯示，過表達CCND1 和細胞分裂周期蛋白34（cell divisioncyclin 34，CDC34）能促進OS細胞增殖，調節細胞周期；體內外實驗均顯示，過表達的miR-671-5p 可以靶向負調控CCND1 和CDC34 的表達，抑制OS 細胞的增殖，導致細胞周期停滯，可作為OS治療干預的新靶點。Yang 等[20]研究顯示，LncRNA FLVCR-AS1 可通過下調miR381-3p、上調CCND1 的表達來促進OS 生長。Li等[21]研究顯示，在對DOX耐藥的OS 細胞中，CCND1 的轉錄水平顯著高于原始細胞，LncRNA人漿細胞瘤轉化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1）在OS細胞中的過表達伴隨著CCND1 的上調，進而促進OS 細胞對DOX 產生耐藥性，且LncRNA PVT1誘導的耐藥性可以通過敲低CCND1 來有效減弱。此外，既往研究表明，LncRNA MALAT1 可以靶向負調控miR-154-5p，通過降低miR-154-5p 表達，并上調水通道蛋白9 的表達來促進慢性收縮性損傷大鼠神經性疼痛的進展[22]。本研究結果顯示，miR-154-5p 與CCND1 之間存在靶向結合位點，miR-154-5p 可以靶向負調控CCND1，敲低LncRNA MALAT1 可使CCND1 mRNA和蛋白表達下調，而抑制miR-154-5p 則可使CCND1 表達上調，提示LncRNA MALAT1 可能通過海綿化miR-154-5p 促進CCND1 高表達，促進OS 細胞對DOX耐藥，LncRNAMALAT1/miR-154-5p/CCND1 軸可作為OS 化療耐藥性的潛在治療靶點。

綜上所述，敲低LncRNA MALAT1 可以抑制OS 細胞的DOX耐藥性，其機制可能是通過靶向miR-154-5p/CCND1 軸實現的。然而，本研究局限于細胞實驗，后續將增加動物實驗進行深入研究。

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（收稿日期：2024-09-27 修回日期：2025-02-18）

（編輯：舒安琴）