鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的差異表達(dá)

摘要：采用Illumina HiSeqTM4000測序平臺對鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）根2個(gè)不同部位（根尖區(qū)和根成熟區(qū)）樣品進(jìn)行測序，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類和KEGG分析。結(jié)果表明，鐵皮石斛根的高質(zhì)量讀長被組裝成136 541個(gè)單基因，平均長度為982 bp。對具有編碼轉(zhuǎn)錄因子能力的基因進(jìn)行鑒定和分類統(tǒng)計(jì)，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中，共識別了148個(gè)MADS-box、737個(gè)NAC、449個(gè)WRKY、369個(gè)MYB和105個(gè)ARF等。差異表達(dá)基因的調(diào)控通路涉及很多途徑，包括苯丙烷生物合成等次生代謝途徑、植物病原體相互作用等環(huán)境應(yīng)答途徑以及植物MAPK信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）；根；發(fā)育；基因； 轉(zhuǎn)錄模式； 轉(zhuǎn)錄因子；差異表達(dá)

中圖分類號：S567.23" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " "文章編號：0439-8114（2025）02-0207-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.033 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The Illumina HiSeqTM4000 sequencing platform was used to sequence samples from two different parts of Dendrobium officinale roots （root tip and mature zone）， and GO clustering and KEGG analysis were performed on differentially expressed genes. The results showed that the high-quality reading length of Dendrobium officinale roots was assembled into 136 541 single genes with an average length of 982 bp. Identification and classification statistics were conducted on genes with the ability to encode transcription factors， and 2105 single genes were mapped to 55 categories of transcription factors. A total of 148 MADS boxes， 737 NACs， 449 WRKYs， 369 MYBs， and 105 ARFs were identified. The regulatory pathways of differentially expressed genes involved many pathways， including secondary metabolic pathways such as phenylpropanoid biosynthesis， environmental response pathways such as plant-pathogen interactions， and signal transduction pathways such as plant MAPK signaling pathway.

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬藥用植物。其性微寒，味甘，益胃生津，滋陰清熱，主要用于病后虛熱、熱病傷津以及口干煩渴等癥［1，2］。藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛具有促進(jìn)消化、降血糖、抗衰老和增強(qiáng)人體免疫力等作用［3］。鐵皮石斛對生長環(huán)境的要求較高，自然繁殖緩慢，野生資源逐漸減少，對其開展生長和發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究十分重要。

基于高通量測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄模式分析在序列組裝、基因表達(dá)分析、功能聚類和調(diào)控通路預(yù)測等領(lǐng)域有明顯的優(yōu)勢［4］。利用鐵皮石斛莖測序數(shù)據(jù)，識別了36 407個(gè)組裝基因，69.97%獲得注釋，鑒定了生物堿生物合成的數(shù)個(gè)關(guān)鍵基因［5］。利用測序技術(shù)研究鐵皮石斛低溫脅迫下的基因表達(dá)和代謝變化，發(fā)現(xiàn)包括CBF和MAP3K激酶在內(nèi)的2 767個(gè)基因表達(dá)受冷脅迫調(diào)控［6］。鐵皮石斛葉轉(zhuǎn)錄組分析揭示了" "9 892個(gè)SSR位點(diǎn)及堿基組成特點(diǎn)［7］。利用鐵皮石斛2個(gè)生長階段莖和葉的測序數(shù)據(jù)，識別了48個(gè)黃酮類化合物代謝相關(guān)基因［8］。蘭科菌根真菌能促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長，利用測序識別了427～749個(gè)小菇誘導(dǎo)和抑制基因［9］。通過研究鐵皮石斛早期、中期、開放期花的轉(zhuǎn)錄模式變化和代謝差異，發(fā)現(xiàn)包括MADS家族在內(nèi)的8 019個(gè)差異表達(dá)基因和239個(gè)分化代謝產(chǎn)物［10］。通過比較轉(zhuǎn)錄模式研究鐵皮石斛3種不同組織中的總黃酮含量與黃酮類化合物生物合成途徑基因的對應(yīng)關(guān)系［11］。利用鐵皮石斛自花授粉與雜交授粉的基因表達(dá)差異研究授粉的分子機(jī)制［12］。利用鹽脅迫下的鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄變化，鑒定參與茉莉酸生物合成途徑的基因表達(dá)水平以及參與類黃酮合成途徑的蘆丁合成基因表達(dá)模式［13］。通過比較1～4年生鐵皮石斛莖轉(zhuǎn)錄組揭示黃酮類化合物累積的分子機(jī)制［14］。利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析揭示瘤菌根菌對鐵皮石斛的促生機(jī)制，找到262條差異表達(dá)基因和瘤菌根菌促進(jìn)鐵皮石斛生長的關(guān)鍵基因［15］。利用生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄模式分析識別鐵皮石斛低氮脅迫應(yīng)答基因，發(fā)現(xiàn)氮和碳代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗氧化應(yīng)激等生物過程可能與其低氮適應(yīng)密切相關(guān)［16］。

鐵皮石斛是根器官生長發(fā)育分子機(jī)制研究的理想材料。本研究對鐵皮石斛根不同部位樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄模式對比，鑒定差異表達(dá)基因，識別調(diào)控通路。同時(shí)，利用鐵皮石斛根測序數(shù)據(jù)對MADS、NAC、WRKY、MYB和ARF等代表性轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行識別，列舉顯著差異表達(dá)的家族成員。為進(jìn)一步深入研究鐵皮石斛根發(fā)育機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，栽培基質(zhì)為碎松樹皮，人工氣候室（22 ℃，光照14 h/d）。取300株生長一致的鐵皮石斛，分為6組。仔細(xì)沖洗去除基質(zhì)，取根尖區(qū)（前端0.5 cm）和根成熟區(qū)（中部0.5 cm）2個(gè)部位（圖1）。設(shè)置3次重復(fù)，分別記為根尖區(qū)1、根尖區(qū)2、根尖區(qū)3和根成熟區(qū)1、根成熟區(qū)2、根成熟區(qū)3，液氮冷凍用于測序。

1.2 測序與過濾

利用華大公司的Illumina HiSeqTM4000測序平臺進(jìn)行測序。利用SOAPnuke（v1.5.2）過濾原始數(shù)據(jù)，包括刪除“污染”讀長（Reads）；刪除未知堿基超過10%的讀長；刪除低質(zhì)量堿基超過50%的讀長，以FASTQ格式存儲。

1.3 組裝與注釋

利用Trinity（v2.0.6）從頭組裝，利用BUSCO檢測組裝質(zhì)量；利用Transdecoder（v3.0.1）對單基因（Unigene）進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測；利用Nr、Nt、GO、Kog、Swissprot、Kegg、Orthology和Pfam等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。

1.4 表達(dá)量與差異表達(dá)分析

利用RSEM（v1.2.8）計(jì)算Unigene表達(dá)量，利用DESeq進(jìn)行組內(nèi)差異表達(dá)計(jì)算，以Fold Change（FC）大于2倍且P≤0.05作為判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)GO和KEGG注釋和分類，對基因聚類分析，Q≤0.05作為候選基因進(jìn)行顯著富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序與注釋

對鐵皮石斛根2個(gè)部位共6個(gè)樣本進(jìn)行測序，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，獲得讀長（Reads）數(shù)據(jù)，所有樣本過濾后讀長Q20均大于97.00%，Q30均大于93.00%（表1）。各樣本從頭組裝，合并數(shù)據(jù)后共獲得136 541個(gè)長的、非冗余單基因（Unigene），平均長度982 nt（圖2）。對具有編碼轉(zhuǎn)錄因子（TF）能力的基因進(jìn)行鑒定和分類統(tǒng)計(jì)，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中，包括bHLH（887個(gè)）、MYB（823個(gè)）、NAC（737個(gè)）、ERF（571個(gè)）、C2H2（551個(gè)）、G2-like（461個(gè)）、WRKY（449個(gè)）、C3H（383個(gè)）、MYB（369個(gè)）、FAR1（365個(gè)）、bZIP（355個(gè)）、ARF（105個(gè)）、MADS-box（148個(gè)）和B3（336個(gè)）等。

2.2 差異表達(dá)基因

本試驗(yàn)獲得了鐵皮石斛根2個(gè)部位之間的差異表達(dá)基因（Differentially expressed gene，DEG）。相校于根尖區(qū)，根成熟區(qū)有上調(diào)基因245個(gè)，下調(diào)基因563個(gè)。表2分別為上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)量排前10的基因。圖3為差異表達(dá)基因的火山圖和聚類熱圖，表明鐵皮石斛根2個(gè)部位基因表達(dá)存在顯著差異。

2.3 基因功能聚類和調(diào)控通路分析

對鐵皮石斛根2個(gè)部位的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類，分析顯著富集程度較高的功能聚類。表3為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能中較典型的5個(gè)功能聚類。同時(shí)，對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG調(diào)控通路分析（圖4），結(jié)果表明，差異表達(dá)基因的調(diào)控通路涉及很多途徑，包括苯丙烷生物合成等次生代謝途徑、植物病原體相互作用等環(huán)境應(yīng)答途徑以及植物MAPK信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子（TF）差異表達(dá)分析

在植物中MADS-box、NAC、WRKY、MYB和生長素應(yīng)答因子（Auxin response factor，ARF）等轉(zhuǎn)錄因子在生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答等方面起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。為了推斷這些轉(zhuǎn)錄因子在鐵皮石斛根發(fā)育中的作用，在基因組范圍內(nèi)識別了這些編碼序列。鐵皮石斛根共識別了148個(gè)MADS-box、737個(gè)NAC、449個(gè)WRKY、369個(gè)MYB和105個(gè)ARF等。表4為MADS-box、NAC、WRKY、MYB和ARF轉(zhuǎn)錄因子的FPKM和差異表達(dá)，結(jié)果表明，很多基因呈現(xiàn)明顯的差異表達(dá)特征，如MADS基因家族的Unigene25348-S6（注釋為鳥苷核苷酸二磷酸解離抑制劑At5g09550亞型X3），在根尖區(qū)相對表達(dá)量為0.36，而在根成熟區(qū)相對表達(dá)量為11.11，發(fā)生了顯著上調(diào)；而WRKY基因家族的Unigene32640-S1（注釋為內(nèi)切葡聚糖酶19），在根尖區(qū)相對表達(dá)量為13.47，而在根成熟區(qū)相對表達(dá)量為0.96，發(fā)生了顯著下調(diào)。

3 小結(jié)與討論

3.1 鐵皮石斛測序

基于高通量RNA測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在序列組裝、基因識別與表達(dá)、基因功能聚類和基因調(diào)控通路預(yù)測等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢。鐵皮石斛是珍稀藥用植物，利用高通量測序研究，產(chǎn)生了553 084個(gè)平均長度為417個(gè)堿基的EST。將EST組裝成36 407個(gè)獨(dú)特的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本，其中69.97%獲得注釋，推測生物堿生物合成途徑，鑒定生物堿生物合成的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)參與生物堿生物合成的5個(gè)關(guān)鍵酶編碼基因在鐵皮石斛葉片中的表達(dá)水平高于莖［5］。隨后，基于高通量RNA測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析方法對鐵皮石斛進(jìn)行深入研究。如使用鐵皮石斛莖（生長期和成熟期）和葉（生長期和成熟期）作為試驗(yàn)材料，利用Illumina HiSeqTM4000測序平臺開展高通量測序，組裝后共獲得43 085條單基因，根據(jù)Pathway分析代謝通路以及鐵皮石斛黃酮類成分?jǐn)?shù)據(jù)，推測其黃酮類化合物的生物合成途徑，識別出48個(gè)黃酮類化合物代謝關(guān)鍵基因［8］。本研究對鐵皮石斛根不同部位進(jìn)行測序，組裝后獲得136 541個(gè)單基因。

3.2 鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式

根是植物的重要營養(yǎng)器官，根的發(fā)育對鐵皮石斛生長、抗逆與藥效物質(zhì)積累具有顯著促進(jìn)作用。為探究鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式，本試驗(yàn)對鐵皮石斛根不同發(fā)育程度的2個(gè)部位進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因。在研究中，相較于根尖區(qū)，根成熟區(qū)有上調(diào)基因245個(gè)，下調(diào)基因563個(gè)，表明鐵皮石斛根2個(gè)部位之間基因表達(dá)存在顯著差異，這些表達(dá)上有差異的基因成為根發(fā)育研究的重要候選基因。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的差異表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，能與基因5′端上游特定序列專一性結(jié)合。本研究利用基因的注釋比對，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中。其中，NAC、WRKY、MADS、MYB和ARF是有代表性的轉(zhuǎn)錄因子。這類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、抗逆等方面具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。WANG等［17］利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定茶的NAC轉(zhuǎn)錄因子，包括45個(gè)編碼蛋白的CsNAC基因，并分為17個(gè)亞組，研究這些基因在不同組織（根、莖、成熟葉、幼葉和芽）以及不同環(huán)境脅迫（干旱、鹽、熱、冷和脫落酸）下的表達(dá)模式，預(yù)測基因可能具有的功能。GOYAL等［18］利用甘草轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)鑒定了147個(gè)全長WRKY基因，識別了啟動(dòng)子區(qū)和誘導(dǎo)因子。基于轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中的重要功能，本研究利用鐵皮石斛根的測序數(shù)據(jù)，識別了MADS-box、NAC、WRKY、MYB和ARF等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量差異，并推測這些基因在鐵皮石斛根器官中的功能，為今后克隆關(guān)鍵基因和系統(tǒng)研究根發(fā)育分子機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 邵 華， 張玲琪， 李俊梅， 等. 鐵皮石斛研究進(jìn)展［J］. 中草藥， 2004， 35（1）： 109-112.

［2］ 陳麗璇， 陳 淳， 陳 菲， 等. 外源無機(jī)硒肥對鐵皮石斛生長及多糖含量的影響［J］. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2018， 9（4）： 423-426.

［3］ 宋廣青， 劉新民， 王 瓊， 等. 石斛藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中草藥， 2014， 45（17）： 2576-2581.

［4］ 王堯龍， 黃璐琦， 袁 媛， 等. 藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展［J］. 中國中藥雜志， 2015， 40（11）： 2055-2061.

［5］ GUO X， LI Y， LI C， et al. Analysis of the Dendrobium officinale transcriptome reveals putative alkaloid biosynthetic genes and genetic markers［J］. Gene， 2013， 527（1）： 131-138.

［6］ WU Z， JIANG W， CHEN S， et al. Insights from the cold transcriptome and metabolome of Dendrobium officinale： Global reprogramming of metabolic and gene regulation networks during cold acclimation［J］. Frontiers in plant science， 2016， 7（11）： e1653.

［7］ 吳 超， 彭 娟， 向 林， 等. 基于高通量測序的鐵皮石斛葉片轉(zhuǎn)錄組分析［J］. 分子植物育種， 2016，14（12）： 3334-3346.

［8］ 林江波， 王偉英， 鄒 暉， 等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序的鐵皮石斛黃酮代謝途徑及相關(guān)基因解析［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 34（9）： 1019-1025.

［9］ 張君毅， 秦建立， 劉 嘉. 小菇促進(jìn)鐵皮石斛光合作用的轉(zhuǎn)錄組分析［J］. 植物生理學(xué)報(bào)， 2020， 56（7）： 1408-1418.

［10］ HE C M， LIU X C， SILVA J A T， et al. Transcriptome sequencing and metabolite profiling analyses provide comprehensive insight into molecular mechanisms of flower development in Dendrobium officinale （Orchidaceae）［J］. Plant Mol Biol，2020，104（4-5）：529-548.

［11］ YUAN Y D， ZHANG J C， LIU X， et al. Tissue-specific transcriptome for Dendrobium officinale reveals genes involved in flavonoid biosynthesis［J］. Genomics， 2020， 112（2）： 1781-1794.

［12］ CHEN Y L， HU B C， ZHANG F T， et al. Cytological observation and transcriptome comparative analysis of self-pollination and cross-pollination in Dendrobium officinale［J］. Genes （Basel）， 2021， 12（3）： 432.

［13］ ZHANG M Z， YU Z M， ZENG D Q， et al. Transcriptome and metabolome reveal salt-stress responses of leaf tissues from Dendrobium officinale［J］. Biomolecules， 2021， 11（5）： 736.

［14］ YUAN Y D， ZUO J J， ZHANG H Y， et al. Transcriptome and metabolome profiling unveil the accumulation of flavonoids in Dendrobium officinale［J］. Genomics， 2022， 114（3）： 110324.

［15］ 王偉英，林江波， 鄒 暉， 等. 轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析瘤菌根菌對鐵皮石斛的促生機(jī)制［J］. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2023，31（4）：557-565.

［16］ WU H T， LI J， PU Q， et al. Physiological and transcriptome analysis of Dendrobium officinale under low nitrogen stress［J］. Funct Plant Biol， 2023， 50（4）： 314-334.

［17］ WANG Y X， LIU Z W AND WU Z J. Transcriptome-wide identification and expression analysis of the nac gene family in tea plant ［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］［J］. PLoS one， 2016， 11： e0166727.

［18］ GOYAL P，GOYAL M M，VISHWAKARMA R A， et al. A comprehensive transcriptome wide identifcation and screening of WRKY gene family engaged in abiotic stress in Glycyrrhiza glabra［J］. Scientific reports， 2020， 10（1）： 373.

收稿日期：2024-04-12

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)課題研究資助項(xiàng)目（QZYY-2024-115）；貴州省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK［2022］一般481）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（貴中醫(yī)博士啟動(dòng)［2019］076號）

作者簡介：陳宏宇（1981-），男，黑龍江齊齊哈爾人，講師，博士，主要從事藥用植物學(xué)研究，（電話）18745117417（電子信箱）chy810501@163.com。